成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

要約

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである in vitroでシステム。重要なのは、単一筋線維培養系は、筋幹細胞ニッチの不可欠な構成要素である筋原線維/幹細胞の関連付けを維持します。

要約

成人の筋肉の再生には、衛星細胞と呼ばれる幹細胞を常駐することによって行われる。衛星細胞は基底膜と各筋線維の筋鞘の間に自分の位置によって定義されます。彼らの行動の現在の知識が大きく、単一筋線維の単離プロトコルの使用に依存している。 1985年には、ビショフは、筋線維とその幹細胞との間の物理的な関連付けが¹保存されているin vitro系を作成することを目標に成体ラットの短趾屈筋（FDB）から単一のライブ繊維を分離するためにプロトコルについて説明しました。 1995年には、筋繊維が単独でピックアップし、コラゲナーゼ消化後に別に処理の代わりに重力沈降^2,3によって隔離されていることなどビショフプロトコルをRosenblattmodified。ローゼンブラットまたはビショフプロトコルは以来、異なる筋肉、年齢や条件^3-6に適応されています。単一筋線維の分離技術が不可欠であるそのユニークな利点による工具。まず、単一筋線維プロトコルでは、衛星細胞は、基底膜の下に維持されています。このような蛍光活性化細胞選別のような他の技術は、化学的、機械的組織解離^7を必要と^{するため、}これはプロトコルのユニークな機能です。筋線維培養システムはin vivo試験での代用はできませんが、それは筋幹細胞の関連する生物学的特性に対処するための優れたプラットフォームを提供していません。単一筋繊維は、標準的なめっき条件や浮遊条件で培養することができる。フローティング筋繊維のサテライト細胞が筋線維環境以外ほとんどない他の影響にさらされる。基板剛性とコーティングが筋肉^8,9を再生成^するために、衛星細胞の能力に影響を及ぼすことが示されているので、これらの要因のそれぞれを制御できることは、独立してニッチ依存性および非依存性応答の間の区別を可能にします。血清の異なる濃度は持っているまた、休止からのアクティベーションへの移行に影響を及ぼすことが示されて。それに関連付けられた衛 ​​星細胞の休止状態を維持するために、繊維は^1-3低血清培地中で保たれるべきである。休止状態に関与する遺伝子を研究する場合に特に便利です。血清富栄養培地では、衛星細胞は急速にこうして生体再生プロセス^1-3 の模倣、移行と差別化、有効化、増殖する。システムは、化学阻害剤のテストなどの種々のアッセイを実行するために使用することができ、ウイルスの配信による遺伝子の異所性発現は、オリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウンやライブイメージング。この動画の記事は現在、成体マウス（6-8週齢）の長趾伸筋（EDL）筋肉から単一筋繊維を単離するために、我々の研究室で使用されるプロトコルについて説明します。

プロトコル

全ての実験は、動物のケアと処理のための規制のオタワ大学によると取り扱われていました。

プロトコルの概要については表1を参照してください。

1。アイソレーションを開始する前に

1. 次の解決策を準備します。
   0.2％コラゲナーゼタイプDMEM中で私（ダルベッコ改変イーグル培地、110 mg / mlのピ​​ルビン酸ナトリウムによる高グルコース、L-グルタミン）。については、2つのEDL筋肉はDMEM中で0.2％Collagenease 2mlの準備をします。 0.22μmフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 37℃prewarm分離の10分前、℃の水浴インチ原液コラゲナーゼの追加のアリコートを、後で使用するために-20℃で凍結することができます。
   注：この手順のすべてを通してピルビン酸ナトリウムを含むDMEMを使用しています。繊維は、ピルビン酸ナトリウムを含まない培地では存続しません。
   • 洗濯メディア（すべての洗浄を行うために使用します）。 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。 0を介してフィルタリング使用前にフィルター0.22μmである。
   • 筋線維培地。 20％FBS、1％ニワトリ胚エキス及び1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。使用前に0.22μmのフィルターでろ過。
   • コー​​ティングされた料理をマトリゲル。時間の長い期間のための培養繊維に、我々は、コーティング基材としてマトリゲルの使用をお勧めします。マトリゲルコートディッシュを準備するには、4℃で一晩マトリゲルのアリコートを解凍します。一日を過ごした後、DMEM中マトリゲル1:10に希釈します。すべての回で4℃でCをマトリゲルを維持し、これは塗布ムラが生じるマトリゲルソリューション内で微細な結晶を作成するので、急激な温度変化を避けてください。氷の上にコーティングされる皿を置きます。表面を覆うだけで十分なボリュームでコートディッシュ。それは1分間座ってみましょう。完全に残ったマトリゲルを削除します。使用前に、または一晩少なくとも3時間37℃で食器乾燥させます。
   
   注：4＆ドで保存した場合、希薄化後のマトリゲルのアリコートは、コーティングの目的のために複数回再使用することができますグラム、C.
2. 最後に、70％エタノールを用いて顕微鏡ステーションと解剖ツールを清掃してください。
3. 2 EDLのアイソレーションは、（1マウス）は、次のように5プラスチック製ペトリ皿を（60 * 15ミリメートル）の準備のために：
   • 分離のための四つの皿（筋解離のための1、シリアル洗浄のための3）。すべての料理は、プラスチックに付着する筋繊維を防ぐために馬血清（HS）でコーティングされている必要があります。コー​​ト、それぞれの皿にウマ血清のピペット3ミリリットル、均一なコーティングを可能にするスワールに、馬の血清を除去し、少なくとも30分間皿は乾燥させてください。各皿にDMEMの4ミリリットルを追加します。使用に先立って、5％CO ₂インキュベーター内で37℃で料理をしてください。
   
   注意：滅菌守れば馬の血清を、複数回再使用することができます。あるいは、DMEM中10％HSの溶液がコートディッシュに使用することができます。全体のプロトコルを通して、HSコートディッシュを使用して、浮動小数点の条件で培養するとき筋線維。
   • 一皿は、分離後の培養線維に使用されます。 Altキーernative皿のサイズやフォーマットは、下流のアプリケーションに応じて、筋繊維の最終培養に使用することができます。しかし、我々は、60 * 15ミリメートルより大きい皿の大きさを示唆していない。ハイパー収縮が発生する前に、筋線維は、もはやより96時間懸濁状態に維持することができます。長い培養時間のために、私たちはマトリゲル被覆皿やプレートの使用をお勧めします。
4. 筋肉処理および筋線維操作のための1小口径ピペット用の大口径ピペット：1繊維の分離（2 EDL）は、2つの滅菌パスツールピペットを準備します。ピペットのエッジを滑らかにするために、所望の長さと熱ポリッシュに各ガラスピペットを切断するためにダイヤモンドペンを使用しています。炎を使用することにより、小口径ピペットの先端カーブ。これは、単繊維を処理するのに役立ちます。火炎滅菌する。使用前にHSとコートが各ピペット。

2。筋肉の解剖と消化

1. Rosa26TdTomato（;これらの実験の目的は、8週齢のSV129、Pax7クレエ^Cklr用Pax7Cre-TdTomato）およびMyf5-CRE; Rosa26YFPを使用した。
2. 70％エタノールで後肢を吹き付けます。手順の実行中に後肢のより良い理解を持っているために、支持基板に動物（顔アップ）ピン。
3. はさみの助けを借りて、四肢の全体の長さを切って、基礎となる筋肉を公開します。皮膚だけでなく、任意の髪の毛や毛皮（ 図1A）を取り外します。
4. 細かいはさみと、下層にある筋肉を損傷することなく、薄い筋膜を介してカット。視覚的にEDLをローカライズします。 EDLはちょうど前脛骨筋（TA）の筋肉の下に後肢の前方コンパートメントに含まれています。
5. 2鉗子の助けを借りて、遠位腱を公開します。
6. 鋭いCohann-Vannas春ハサミで遠位腱（TAとEDL両方の）カット。
7. 鉗子の助けを借りて、彼らの腱によって、TAとEDL筋肉の両方を保持し、微妙に近位端に向かって筋肉を引き上げます。この時点では、はっきりと見ることができるはずですただTAの筋肉の下にEDL筋肉。さて、反対方向（ 図1B）の2つの腱を引っ張ることにより、TA筋からEDLを区切ります。これが筋繊維を傷めますので、この操作を実行中にEDL筋肉をストレッチングは避けてください。
8. EDLの腱を公開します。より良い近位腱を視覚化するためには、TA筋肉を削除するには、この点で助けるかもしれない。また、膝の周りにいくつかの結合組織（ 図1C）を遮断するのに役立つことがあります。
9. 近位腱を切って、優しく、EDL（ 図1D）を取り外します。
10. その腱、筋肉を保持することによって、先に調製したコラゲナーゼ溶液2mlに転送します。水浴中で37℃でインキュベートする。
    注：正常な繊維の分離のために、それは筋線維の整合性が維持されるように腱から腱にEDLを分離することが重要です。 2.3から2.9までの手順が解剖顕微鏡下で行うことができる。あるいは、MAGNの使用ガラスをifyingことも筋肉の方のビューを持っているのを助けるかもしれません。
11. 第二EDLを分離するために2.3から2.9の手順を繰り返します。同じチューブ内の第二のEDLを転送します。でこぼこの消化を避けるために、第二のEDLの単離は、わずか5分後の最初に完了する必要があります。
    注1：インキュベーション時間は、コラゲナーゼ活性に応じて調整する必要があるかもしれません。長くしたり短くインキュベーションは、サイズ、年齢および/ ​​または筋肉の状態（ 例えば、線維筋肉は長い消化時間を必要とする）に応じて必要となる場合があります。
    注2：筋肉消化時に休止状態、攪拌下、衛星細胞の挙動を調べる場合は衛星細胞^10を活性化することができる。
12. 消化時間の間、定期的に過剰消化を回避するために、筋肉を確認してください。筋肉がほぐれ始め、筋繊維が表示されているときに消化を停止します。消化を停止するには、慎重にしたDMEM（dissociati 4mlで温めておいたシャーレに、両方の筋肉を転送皿の上）。この操作を実行するには、大口径のピペットを使用しています。
    注：Hyper委託筋繊維の分離では、この必然的結果として筋肉の過剰消化を避ける。

3。単一筋線維解離と文化

1. 筋繊維を解除するには、繊維が自然に放出され始めるまで、暖かい培地で筋肉をフラッシュするために大口径ガラスピペットを使用しています。これは必然的に有害な繊維が発生するので、筋をひいて粉にするしないでください。解剖顕微鏡下でこれと次の手順を実行します。
2. 希望数に達するまで、筋繊維を放出続ける。皿を10分以上室温で必要とされる場合37℃で5 min（最小）インキュベーション℃、5％CO ₂の媒体を再平衡化するが可能になります。
   注：メディアは長時間生理以下の温度（37℃）に達した場合筋繊維は死んでしまう。
3. 小型ボアピペット、transfe使い方rが新しいあらかじめ温めておいた皿（3つの連続した​​洗浄の最初）に単一筋繊維を生きる。すべてを一度に筋繊維のバルクを転送する代わりに、個々にそれぞれの筋線維を処理します。必要に応じて、37℃で、培地を再平衡化するために10〜15分間、5％のCO _2。
4. 2回以上またはすべての死んだ筋繊維や破片が削除されるまで、ステップ3.3を繰り返します。我々は、適切なクリーンアップのために、少なくとも3つの連続洗浄をお勧めします。
   注意：ショートとハイパーは、顕微鏡の光の下で契約通りに死んだ筋繊維が表示されます。
5. 37℃単一筋繊維をインキュベート℃、前培養培地への切り替えには、少なくとも1時間、最後の洗浄の皿（のみDMEM）中で5％のCO _2。これは、筋繊維が血清の非存在下でin vitroでの条件に調整することができます。我々は血清富栄養培地繊維の縮小を増加に筋繊維の即時文化を発見した。
6. 1時間後、新たな温めた皿にするか、適切なカルチャ形式に筋繊維を転送下流のアプリケーションに応じて。高血清培地で培養繊維は衛星細胞の活性化を可能にします。あるいは、血清またはニワトリ胚抽出物の異なる濃度を使用することもできます。一日おきに培地を変更します。

4。下流アプリケーション

1. 免疫染色 。ライブ筋繊維を単離中に固定されており、任意の時点で染色することができる。免疫は、フローティングと基板に接続された筋線維の両方で実行することができます。フローティング筋繊維を染色した場合、別の溶液から筋繊維を転送するために小口径のガラスピペットを使用しています。あるいはまた、それはすべての手続きを通して同じ井戸に筋繊維を維持し、ガラスピペットを使用してソリューションを追加/削除することが可能である。これは同様に筋線維の除去になりますように、標準の吸引を避ける。簡単に言えば、完全に培地を除去し、5分間温めておいた4％パラホルムアルデヒド（PFA）でフィックス筋繊維。 PBSで数回洗浄する。インキュベーションPFAのバックグラウンド染色を最小限に抑えるために、PBS中1％グリシンまたは他の標準的な焼入れソリューションのTE筋繊維。必要に応じて、PBSで5分間洗浄続く10分間PBSにTriton X-100を0.1％筋繊維を透過。室温で1時間以上、好ましくは一晩4℃でのブロッキング溶液中で繊維（10％ウマ血清、0.1％トリトンX-100、1％NaN）をインキュベート代替ブロッキング溶液は、目的の抗体に応じて、使用されるかもしれません。 5分間PBSで一度洗浄します。 4℃、室温で1時間または一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体とインキュベート任意の未結合抗体を除去するためにPBSで洗浄あたり5分で繊維を3回洗浄します。室温で45分〜1時間のための適切な二次抗体を用いてインキュベートします。 PBS中で洗浄あたり5分で3回洗浄する。 1 mg / mlのDAPIで核を対比染色する。浮遊繊維を染色した場合、顕微鏡に適したガラススライドに各繊維を転送します。 PBSまたは媒体の任意の過剰を削除します。メディ取付適用ええと、その後カバースリップを追加します。蛍光顕微鏡下で筋線維を可視化するために進んでください。 EDLの筋繊維に代表免疫については、 図4を参照してください。強力な固定剤を使用する代替染色手順はVermaさん、M. ら ¹¹ Wosniak、交流ら ¹²に記載されている。
2. オリゴヌクレオチドまたはプラスミド一過性トランスフェクション 。ライブ筋繊維は、関心のある特定の遺伝子/ sのプラスミドまたはsiRNAをトランスフェクトすることができます。 siRNAを使用する場合は、二重トランスフェクションは、効率的な遺伝子ノックダウンすることをお勧めします。我々は、分離から8時間後の最初のトランスフェクションを行うことをお勧めします。トランスフェクション後の六時間は、新鮮な培地と交換してください。 siRNAトランスフェクションのために、私たちは、50nMの最終濃度を使用して開始を示唆している。遺伝子発現のノックダウンは、RNA抽出によって、または好ましくは免疫染色によって分析することができます。
3. ウイルス感染 。ライブ筋繊維の感染は可能ですが、ここではセルの発生率死はオリゴフェクションに比べて高く、感染効率は、筋肉の状態や年齢に応じて可変とすることができる。例えば、そのまま大人になってから筋肉の筋線維は、宿主感染^13,14に対する保護バリアを提供することが示されている基底膜が存在するために、ウイルス感染に特に非応答性である。彼らは静止（非有糸分裂）細胞に感染することができますので、レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターよりも優先されます。ウイルス感染の場合は、マトリゲル被覆された皿やプレート上で培養繊維へのお勧めで、筋繊維が最初の24時間のためのメディアの状態に調整することができます。
4. イメージングを生きる 。筋繊維のイメージングは特に時間がかかり、37℃、5％CO ₂のチャンバーを備えた顕微鏡を必要と住んでいます。単一のサテライト細胞の挙動を評価する際に便利です。この技術を用いて行われた作業は、衛星細胞の異質性の発見のために尽力されているとそのbehaを勉強する繊維上vior（15と16）。

結果

ここでは、成体マウスのEDL筋肉から単一筋線維の単離を説明。成功した筋線維の収量は、コラゲナーゼ活性や筋肉の状態や年齢など、いくつかの要因に依存します。最も重要なのは、腱からEDL筋肉から長い間、無傷の筋繊維の腱結果に筋肉の分離図1は、分離"腱の腱"のステップバイステップのグラフィカルな表現を示しています。筋肉が完全に消化されると、筋線維が筋肉に穏やかな圧力を適用することによって解放されます。 図2Aは最初の洗浄後の筋線維の分離実験の代表的な写真を示す。この時点で、文化が長くて輝く管状構造として表示され、単一筋繊維の束の混合物を含む、ハイパーは、消化過程から暗くて短いと破片アール筋繊維を契約。少なくとも3つの連続した​​洗浄の終わりまでには、唯一つのライブ筋繊維は、ジに残るべき文化または下流の分析はsh（ 図2B）。図2Cは、ハイパー委託繊維（C '）に比べて長く、ライブ繊維を示しています。分離の時点では、衛星細胞が筋線維表面（ 図3A）の小さな突起として表示されます。血清富栄養培地中で維持した場合、衛星細胞は、活性化増殖し、移行し最終的には筋管（B）に融合する。文化の中で15日後に、すべての筋管は、成人における筋肉の再生は、その開発中のある時点で筋原性決定因子Myf5を表明していたことが細胞によって行われることを示唆しているMyf5レポーターYFP（C）を表現しています。すべてのサテライト細胞が対になったボックス型転写因子Pax7 ^17を表現^{しています} 。レポーターマウスラインPax7Cre-TdTomatoは TdTomato蛍光シグナル（ 図3D及びE）の発現を介して衛星細胞を追跡するために使用することができます。 図4に示す代表的な免疫ダブルPax7 + / MyoDの衛星細胞のnofluorescence。古典的には二重Pax7 + / + MyoDの衛星細胞はどちらダウンMyoDのを規制するとPax7表現^18を維持^することによって、MyoDの発現または休止へのリターンを維持しながらダウンPax7を調節することにより、分化プログラムを完成させ増殖コミット筋肉前駆細胞と考えられている

図1。マウス後肢からEDL筋肉分離。 8週齢の成体マウスの。後肢。矢印は遠（ひざ）と近位腱（足）腱を示しています。Bは 。前脛骨筋（TA）の筋肉と長趾伸筋（EDL）の筋肉の解剖学的位置するc。近位腱を通してEDLを保持することによって、筋肉を遠位腱を露出するために膝に向かって引っ張られています。Dが 。遠位腱であるカットとEDLが解除されます。

図2。単一筋線維の分離実験の代表的な結果。最初の洗浄工程における筋線維の分離実験。明視野像。赤い矢印はライブ筋繊維を示し、白い矢印は、ハイパー委託筋繊維を示し、黄色の矢印は、細胞、筋線維やECMの残骸を示しています。Bは 。 DMEM中で連続した回洗浄した後、唯一のライブ筋繊維が残っています。CとC '。画像は、長い無傷ライブ筋線維（C）および筋線維を（C '）を契約した短いハイパーを表しています。バーは10μm。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。

Figur E 3。単一筋線維培養実験の代表的な結果。右の単離後、その関連衛星細胞（矢印）（時間0）になります。Bとシングル、ライブ筋線維の。明視野像。単一筋繊維をマトリゲル上に播種し、15日間血清豊富な培地で培養した。単一細胞（黄色の矢印）は、Cに比べて、白矢印は、分化した筋管を示しています。 Myf5Creから単一筋線維; RosaYFPマウスは 、Bのように培養した。矢印はMyf5派生筋管を示しています。DとE。 Pax7Creから単一筋繊維; TdTomatoを単離して、右後に修正されました。矢印はPax7正静止衛星細胞（E、赤）を示す。核はDAPI（D）で対比染色した。バー：50μmである。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。

方法 ">
図4。筋線維上の衛星細胞の免疫蛍光染色の例。単一筋繊維を単離し、フローティング条件で72時間培養した。筋繊維のサテライト細胞は衛星細胞特異的マーカーPax7（B、赤）と筋原性調節因子MyoDの（C、緑）で染色した。核はDAPI（A）で対比染色した。バー：50μmである。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。

筋肉解剖 （5分毎に筋肉）	腱分離に腱 シャープツール 最小限の筋損傷
筋肉消化 （30-45分）	温度敏感 過剰消化を避ける
繊維の分離	繊維の操作をする上で避ける 数回の洗浄でデブリを除去する
繊維·カルチャー （最大3〜4週間まで）	フォーマット：任意 コー​​ティング：ウマ血清、マトリゲル 媒体：基礎または血清高

表1。筋線維の単離プロトコルの概要。筋線維分離プロトコルは4つの主要なステップで構成されます。ステップごとに、おおよその時間や主要臨界点が議論されています。各ステップの詳細については、プロトコル·テキストを参照してください。

ディスカッション

無傷の筋肉からの単一筋線維の単離および培養は、筋肉の再生の過程を研究するためのin vitroでの優れたモデルを提供します。このシステムのユニークな特徴は、基底膜の下に、それらの生理学的環境での衛星細胞の保存です。最も重要なのは、技術は、静穏と活性化状態の両方で筋幹細胞の挙動を調査するために使用することができます。過去20年間、筋線維培養系は、内因性および外因性の決定要因の両方に関して衛星細胞集団の生物に有意義な洞察を提供してきました。培養個々の筋線維、筋原線維に対する衛星細胞の不均一性により、筋肉のタイプや再生能力は¹⁵対処されています。衛星細胞遊走パターン¹⁶上の獲得については、許可された単一の培養繊維のライブイメージングを用いた研究を練る。定量的なデータの取得がある可能LSO。時間がかかるが、それは特定のイベント（幹細胞の非対称分裂、増殖および分化比等）の分布と発生に関する重要な情報を提供します。 FACSまたは他の手段による衛星細胞の純粋な集団の単離は、分子レベルでのタンパク質または遺伝子発現の変化を調査するための優れたプラットフォームを提供するかもしれませんが、一緒に前に説明したアプリケーションと、単繊維からタンパク質またはRNA抽出も可能である。我々の経験では、成功した繊維の分離のための最も重要なステップは、アイソレーション（2.5から2.9プロトコル·テキスト内のステップ） "腱の腱"です。これは、筋肉消化後、繊維はこのように、最小の、または全然ダメージは以下の手順で自分のパフォーマンスを向上させると共にEDLから解放されることを保証します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			試薬/素材
コラゲナーゼ	シグマアルドリッチ	C0130-1G	最適な結果を得るために新鮮なすべての回を準備します。原液コラゲナーゼの追加のアリコートを-20℃で保存することができます
DMEM高グルコース+ NaPyr	インビトロジェン	11995073	ペニシリン/ストレプトマイシンを添加すると、空気の混入を最小限に抑えることが必要である
特徴ウシ胎児血清	Hyclone社	SH30396.03	ロット＃KUJ35152
ウマ血清	Hyclone社	SH300.74.03	ロット＃AVJ82494
ニワトリ胚エキス	正確な化学	CE-650-T、バッチB7035010	凍結融解の繰り返しは避けてください。
マトリゲル	BD		-20℃で保存するアリコート凍結融解の繰り返しは避けてください。 4℃で希釈アリコートを保存
			機器
Cohann-Vannas春シザーブレード - ストレートシャープ6ミリメートル	ファイン科学ツール	15000から02
エキストラシンアイリスはさみ-10.5センチメートル	ファイン科学ツール	14088から10
カーブモリアアイリス鉗子	ファイン科学ツール	11373から12
パスツールピペット	VWR	14672-380	14672-200
ダイヤモンドペン	VWR	52865-005
60 * 15ミリメートルペトリ皿	VWR	25384-092
アクロディスク0.22μmのフィルター	VWR	CA28-145から477
顕微鏡StemiV6を解剖する	ツァイス		追加の光源が良いフォーカスビューを持つことが必要になることがあります