ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Summary

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של תירס rayado Fino וירוס (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

Abstract

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים ^9, חיסונים ^{14, 15,} חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ^ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים ^{4, 5, 10, 16, 18, ​​12.}

על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס ^8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס ^8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג ¹³ קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס ^3, וירוס mottle ציפורנים ^12, Cowpea chlorotic mottle ⁶ וירוס, פסיפס טבק וירוס ^17, וירוס לפת צהוב פסיפס ^1, וMRFV ^13.

Protocol

1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana

1. לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו"א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים ^12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו.
2. לכל תגובת תמליל T7, לחסן שני עלים התרחבו באופן מלא של נ benthamiana עם 10 תגובות μl ולדגור על הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בתנאי לחות 60% עבור 16 שעות עם אור (25,000-30,000 לוקס) בשעת 25 ° C ו 8 שעתי חשכה בשעת 20 ° C.
3. עלי Harves t נ benthamiana נגועים בנגיף 10 ימים אחרי החיסון (dpi), לשקול את רקמות הצמח (50 גרם) ומניח על קרח.
4. הומוגני חומר צמחי במערבל בנוכחות של 100 מ"ל של פתרון מצונן של חיץ 0.5 מ 'Na-ציטראט, 5.5 pH (שימוש 2 מ"ל של חיץ לגרם של רקמות צמח).
5. סנן homogenate באמצעות 3 שכבות של cheesecloth ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב27000 XG למשך 30 דקות. העברת supernatant לגליל סיים מצונן, למדוד את עוצמת קול, ולאחר מכן להעביר למבחנה סטרילית מצוננת. השלך את הגלולה.
6. לעבד את supernatant על ידי הוספת 10% פוליאתילן גליקול 8000 (PEG 8000), מערבבים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ודגירה במשך 45 דקות נוספות ב 4 ° C כדי להאיץ את חלקיקי נגיף הדמויים (VLPs)-PEG מטריקס.
7. צנטריפוגה במדגם 27000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
8. לעבד את הגלולה על ידי הוספת 8 מ"ל של חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH מכיל 2% Triton X-100. מערבולת צינורות צנטריפוגות גם כדי לשחרר את הכדור. להעביר את הכדור והחיץ למבחנה סטרילית מצוננת. יש לשטוף את הצינורות באופן מיידי עם 2 מ"ל של אותו המאגר ולהוסיף לכוס. מערבב את ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהכדורים מתמוססים (בדרך כלל שעות 1).
9. הבהר ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב27000 XG, להשליך את הגלולה, ו-process supernatant ידי צנטריפוגה ב140.000 XG ל2 שעות ב 4 ° C.
10. Resuspend גלול ב 1 מיליליטר חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH ולמקם את ההשעיה על גבי 10-40% שיפוע סוכרוז עשה במאגר 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH.
11. צנטריפוגה השיפוע עבור 3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C.
12. לשפוך אור על החלק העליון של צינור צנטריפוגה ולאסוף רצועה העליונה פיזור אור ב4 סנטימטרים מהחלק העליון של הצינור, לדלל עם חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH, וצנטריפוגה ל3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C.
13. Resuspend גלול ב 0.5 מ"ל של מים וחנות סטרילית ב 4 ° C, למשך שישה חודשים.
14. לכמת את ריכוז VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבון ברדפורד. התשואה של VLPs היא בין 1 ל 3 מיקרוגרם / גרם של רקמות צמח.

2. תגובות fluorescein-5-maleimide-תיוג של VLPs

1. הכן את הפתרון של 1 mM fluorescein-5-maleimide (427.37 גרם / שומה) בphosphat נתרן 50 מ"מימדואר חיץ, pH 7.0, 1 mM EDTA. מערבב בעזרת המערבולת ולוודא מסה מלאה. הגן על הצינור מן האור עם רדיד אלומיניום.
2. הוסף fluorescein-5-maleimide לVLPs מיוצר בשלב 1 ולערבב. השתמש עודף טוחנת 25-קיפול של fluorescein-5-maleimide לכמות טוחנת של sulfhydryls. בדרך כלל, באמצעות 30 μl של VLPs בריכוז של מיקרוגרם 1 / μl ו60 μl של פתרון fluorescein-5-maleimide מייצר תוצאות מתקבלות על דעת.
3. דגירת התגובה ל2 שעות בטמפרטורת חדר או לילה ב 4 ° C.
4. לסיים את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 50 מ"מ.
5. הסר הלא הגיב fluorescein באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר.
6. לניתוח SDS-PAGE, להוסיף 10 μl מתוך 2 חיץ מדגם x-SDS PAGE Laemmli עד 10 μl של כל תגובה. אחסן את החלבון המסומן מוגנים מפני אור ב 4 ° C עד חודש אחד אובaliquots שימוש היחיד ב -20 ° C עד 3 חודשים.

3. תיוג תגובה וקביעת התאגדות ביוטין

1. השתמש בעמודות ספין desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) לבצע החלפת חיץ ממים מלוחים פוספט שנאגר-(PBS), 7.0 pH של VLPs מיוצר בשלב 1.
2. הכן את פתרון מנייה 20 מ"מ של maleimide-PEG2-ביוטין ידי הוספת μl 190 של PBS ב-No-לשקול maleimide-PEG2-ביוטין ולערבב ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. הוסף maleimide-PEG2-ביוטין לVLPs והמערבב. השתמש עודף טוחנת 10-קיפול של ריאגנט לפתרוני VLPs ≤ 2 מ"ג / מ"ל.
4. דגירת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות.
5. הסר הלא הגיב maleimide-PEG2-ביוטין באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר.
6. קבע את השומות של ביוטין לשומות של VLPs באמצעות פירס ביוטין quantitation הקיט (Thermo Scientific) וחצllowing הוראות יצרן.

4. Cross-linking של 2-VLPs Cys וF פפטיד

1. VLPs אשר הביאה שאריות ציסטאין זמינות לצלב-linking בשלב 2 (2-Cys VLPs) משמש בשלב הבא. הכן את פתרון צלב-linking מלאה טרי (28.63 מ"מ) על ידי המסת 10 מ"ג של מקשר צלב NHS-PEG4-maleimide בשנת 680 μl של sulfoxide דימתיל.
2. להמס 17 (F)-אמינו פפטיד ארוך החומצה (LLPNMOKDKEACAKAPL) ב 50 μl של חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ"מ EDTA) בריכוז של 0.1 מ"מ.
3. הוסף 4 μl צולב מקשר עד 50 μl של פפטיד המומס (חלבון NH2) בריכוז סופי mM 1 (אשר הם עודף טוחנת 10-לקפל ל0.1 מ"מ של פתרון פפטיד).
4. דגירת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C.
5. לטהר פפטיד הצולב באמצעות עמודת desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) מתאזנת עם חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ"מ EDTA) על ידי צנטריפוגה XG ב 1500ל1 דקות בטמפרטורת חדר.
6. הגדר את תערובת תגובת שילוב VLPs (חלבון-SH) ופפטיד הצולב (חלבון NH2) ביחס טוחן נקבע על ידי מספר thiols ו אמין הופעל מעורב בתגובה וההבדל במשקל מולקולרי בין VLPs ופפטידים.
7. דגירת תגובת התערובת בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות ב 4 ° C.
8. לניתוח כתם מערבי, לערבב את מוצר מצומד 01:01 התקבלו בLaemmli חיץ, להרתיח במשך 10 דקות, ולהמשיך בSDS-PAGE בגבס מראש 10-20% טריס-גליצין ג'ל (Invitrogen), ואחריו על electroblotting קרום ניטרוצלולוזה (Invitrogen). חסום את הקרומים עם 1 x PBS, 7.2 pH המכיל 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) ו5% אבקת חלב דל שומן ובדיקה עם נוגדני פפטיד ספציפיים ואחריו הנוגדן המשני המתאים phosphatase כותרתו.

תוצאות

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S ^2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינס?...

Discussion

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides לה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Thinwall, צינורות-Ultra Clear	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 קיט	Tecnologies חיים	AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide	חי טכנולוגיות מדעיות Thermo	46130 F150	46130 הם מתחליף סדר עם F150
ערכת quantitation ביוטין פירס	Thermo Scientific	28005
EZ-קישור Maleimide-PEG2-ביוטין, אף לשקול פורמט	Thermo Scientific	21901
SM n Crosslinkers (PEG)	Thermo Scientific	22107
10-20% טריס-גליצין ג'ל	Invitrogen	EC61352
Laemmli המאגר	Bio-Rad	1610737
טריס גליצין SDS ריצת המאגר	Invitrogen	LC2675
טריס גליצין העברת המאגר	Invitrogen	LC3675
כריך נייר מסנן ממברנה ניטרוצלולוזה	Invitrogen	LC2001
זיקת שכותרת phosphatase מטוהרי נוגדני IgG לארנב	Kirkegaard ומעבדות פרי	0751516
תשתית phosphatase NBT / BCIP	Kirkegaard ומעבדות פרי	508107