Анализ растворителей доступность остатков цистеина на<em&gt; Кукуруза rayado Fino вирус</em&gt; Вирус типа частиц, образующихся в<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Растения и Перекрестное связывание пептидов VLPs

Резюме

Метод анализа растворителей доступность тиоловые группы остатков цистеина в Кукуруза rayado Fino вирус (MRFV)-вирус типа частиц (VLP), а затем пептида реакции сшивания описано. Метод использует преимущества наличия нескольких химических групп на поверхности ВПЧ, которые могут стать мишенью для конкретной реакции.

Аннотация

Имитация и эксплуатации вирус свойства и физико-химические и физические характеристики держит обещание дать ответы на некоторые из наиболее актуальных проблем в мире. Сам диапазон и типы вирусов в сочетании с их интригующими свойствами потенциально дают бесконечные возможности для применения в вирус-технологий. Вирусы имеют возможность самостоятельно собираться в частицы с дискретной формы и размера, специфики симметрии, поливалентности и стабильные свойства в широком диапазоне температур и рН условиях. Не удивительно, что с таким замечательным набором свойств, вирусы предложены для использования в биоматериалов ^9, вакцины ^{14, 15,} электронных материалов, химических средств и молекулярных электронных контейнеров ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.}

Для того чтобы использовать вирусы в области нанотехнологий, они должны быть изменены с их естественной формы, чтобы придать новые функции. В этом сложном пр.ocess может осуществляться посредством нескольких механизмов, включая генетические модификации вирусного генома и химически крепления иностранной или желаемой молекулы вирусной частицы реактивные группы ^8. Возможность изменять вирус в первую очередь зависит от физико-химических и физических свойств вируса. Кроме того, генетические или физико-химические изменения должны быть выполнены без ущерба для нативной структуры вируса и вируса функции. Кукурузы rayado Fino вируса (MRFV) белков пальто самостоятельно собираться в кишечной палочки получения стабильных и пустые ВПЧ, которые стабилизировать белок-белковых взаимодействий и которые могут быть использованы в вирусных технологий на основе применения ^8. VLPs производится в растениях табака были рассмотрены как эшафот, на котором различные пептиды могут быть ковалентно отображается ^13. Здесь мы описываем шаги: 1) определить, какие из доступных растворителей цистеина в капсид вируса доступны для модификацийкатионов, и 2) Bioconjugate пептидов изменение капсид. С помощью родных или мутационно вставлен аминокислотных остатков и стандартных технологий связи, широкий спектр материалов были выставлены на поверхности вирусов растений, таких как, Brome вируса мозаики ^3, гвоздика пятнистости вируса ^12, Вигну хлоротичных пятнистости вирус ^6, табачной мозаики Вирус ^17, репа вирус желтой мозаики ^1, и MRFV ^13.

протокол

1. Прививка Вирус ВПЧ и очистки от растений Nicotiana benthamiana

1. Продукция ограничен T7-РНК-транскрипты из картофельного вируса X (PVX)-плазмиды на основе вектора, несущего MRFV дикого типа (WT) и Cys-мутировал белка оболочки (CP) генов ^12, с использованием Ambion в T7-mMessage mMachine Kit.
2. Для каждой реакции стенограммы T7, прививают два полностью расширена листьев N. benthamiana с 10 мкл реакции и инкубировать растений в течение 10 дней в теплице, при 60% влажности в течение 16 часов со светом (25,000-30,000 люкс) при 25 ° C и 8 часов темноте при 20 ° C.
3. Harves т Н. benthamiana инфицированных вирусом листьев 10 дней после прививки (точек на дюйм), вес ткани растения (50 грамм) и место на льду.
4. Однородный растительный материал в блендере в присутствии 100 мл охлажденной раствор 0,5 М Na-цитрат буфер, рН 5,5 (использование 2 мл буфера на грамм ткани растений).
5. Фильтр гомогената через 3 слоя cheeseclOTH и уточнить путем центрифугирования при 27000 х г в течение 30 мин. Передача супернатант в охлажденный мерный цилиндр, измерения объема, а затем переносить их на охлажденное стерильным стакан. Откажитесь от гранул.
6. Процесс супернатанта путем добавления 10% полиэтиленгликоля 8000 (ПЭГ 8000), перемешивают в течение 15 мин при 4 ° С, и выдержать в течение дополнительных 45 мин при 4 ° С для осаждения вирус типа частиц (VLP)-PEG матрицы.
7. Центрифуга образца при 27000 х г в течение 20 мин при 4 ° C и удалите супернатант.
8. Процесс гранул путем добавления 8 мл 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5, содержащего 2% Triton X-100. Swirl пробирок хорошо, чтобы освободить гранул. Передача гранул и буфер для охлажденных стерильных стакана. Промойте трубы сразу с 2 мл того же буфера и добавить в стакан. Движение суспензии при 4 ° С до растворения гранул (как правило, 1 час).
9. Уточнить центрифугированием в течение 5 мин при 27000 мкг, отказаться от гранул и рrocess супернатанта центрифугированием при 140000 х г в течение 2 ч при 4 ° C.
10. Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5 и поместить подвески на вершине 10-40% градиенте сахарозы, сделанные в 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5.
11. Центрифуга градиент в течение 3 ч при 140000 х г при 4 ° C.
12. Shine A Light поверх центрифуги трубы и собирать рассеяния света верхняя полоса на 4 см от верхней части трубки, разбавляют 0,05 М Na-цитрат буфер, рН 5,5, и центрифуги в течение 3 ч при 140000 х г на 4 ° C.
13. Ресуспендируют осадок в 0,5 мл стерильной воды и хранить при температуре 4 ° С на срок до шести месяцев.
14. Количественного определения концентрации ВПЧ, выполняя анализ Bradford белка. Выход ВПЧ составляет от 1 до 3 мкг / г растительной ткани.

2. Флуоресцеин-5-малеимида маркировки Реакция VLPs

1. Подготовить 1 мМ раствора флуоресцеина-5-малеимида (427,37 г / моль) в 50 мМ фосфат натрияэлектронной буфера, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА. Смешать помощью вихря и проверить полного растворения. Защита труб от света с помощью алюминиевой фольги.
2. Добавить флуоресцеин-5-малеимида на ВПЧ, полученного на стадии 1 и перемешать. С помощью 25-кратного молярного избытка флуоресцеин-5-малеимида для молярного количества sulfhydryls. Как правило, с использованием 30 мкл ВПЧ при концентрации 1 мкг / мкл и 60 мкл флуоресцеин-5-малеимида решение дает приемлемый результат.
3. Инкубируйте реакции в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
4. Завершить реакцию добавлением дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 50 мМ.
5. Удалить непрореагировавшего флуоресцеина использованием обессоливания колонки спина (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) и центрифугирования в течение 2 мин при 1500 мкг при комнатной температуре.
6. Для SDS-PAGE анализа, добавить 10 мкл 2 х SDS-PAGE буфере образца Laemmli до 10 мкл каждой реакции. Хранить меченых белков, защищенном от света при температуре 4 ° C в течение одного месяца илиВ одноразовые аликвоты при -20 ° C до 3 месяцев.

3. Маркировка реакции и определение о регистрации Биотин

1. Используйте обессоливания спина столбцов (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) для выполнения буфер обмена из воды в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,0 из VLP, полученного на стадии 1.
2. Подготовить 20 мМ исходного раствора малеимида-PEG2-биотин, добавив 190 мкл PBS в No-взвешивание малеимида-PEG2-биотин и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Добавить малеимида-PEG2-биотин на ВПЧ и перемешать. С помощью 10-кратного молярного избытка реагентов для VLPs решения ≤ 2 мг / мл.
4. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 4 часов.
5. Удалить непрореагировавшего малеимида-PEG2-биотин использованием обессоливания спина колонки (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) и центрифугирования в течение 2 мин при 1500 мкг при комнатной температуре.
6. Определить моль биотина на моль VLPs помощью Пирс Биотин Количественный Kit (Thermo Scientific) и FOllowing инструкциями производителя.

4. Перекрестное связывание Cys 2-VLPs и F пептида

1. VLP, в результате которых доступны остатков цистеина для сшивания на шаге 2 (2-Cys VLP) используют в следующей стадии. Подготовьте новый сшивающий раствора (28,63 мм) растворением 10 мг NHS-PEG4-малеимид сшивающего в 680 мкл диметилсульфоксида.
2. Растворите 17 (F)-аминокислота долго пептид (LLPNMOKDKEACAKAPL) в 50 мкл буфера сопряжения (1 х PBS, рН 7,2, 1 мМ ЭДТА) в концентрации 0,1 мм.
3. Добавить 4 мкл сшивающий до 50 мкл растворенного пептида (белка-NH2) на 1 мм конечной концентрации (которая находится в 10-кратном молярном избытке в течение 0,1 мМ раствора пептида).
4. Инкубируйте реакции в течение 2 часов при температуре 4 ° C.
5. Очищают сшитый пептид использованием обессоливания колонки (Thermo Scientific Inc, Rockford IL), уравновешенную буфером сопряжения (1 х PBS, рН 7,2, 1 мМ ЭДТА) путем центрифугирования при 1500 х гв течение 1 мин при комнатной температуре.
6. Настройка реакционной смеси объединения ВПЧ (белково-SH) и сшитого пептида (белка-NH2) в молярном соотношении определяется числом тиолов и аминов активированного участвующих в реакции, и различия в молекулярной массе между ВПЧ и пептидов.
7. Инкубируйте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч при 4 ° C.
8. Для Вестерн-блоттинга, смешать полученную сопряженных продуктов 1:1 с Laemmli буфера, кипятить 10 мин, и приступить к SDS-PAGE на сборных 10-20% Трис-глицин гель (Invitrogen), а затем на электроблоттинга нитроцеллюлозные мембраны (Invitrogen). Блок мембраны с 1 х PBS, рН 7,2, содержащем 0,05% Твин-20 (PBS-Tween) и 5% обезжиренного сухого молока и зонд с пептид-специфических антител следуют соответствующие фосфатазы-меченых вторичных антител.

Результаты

Переходный выражение мутантного белка оболочки MRFV (CP) генов в N. benthamiana растений в PVX-вектора на основе производства VLP, представлена ​​на рисунке 1. Изменения пальто MRFV гена белка усиливается с помощью ПЦР, а затем помещен под транскрипционный контроль дублируется промоут?...

Обсуждение

Метод, представленный здесь, дает очень чувствительный и быстрый анализ реактивных цистеина, присутствующего на поверхности растений производства VLP, а также на других белковых комплексов. Малеимиды являются тиол-специфических реагентов, которые вступают в реакцию с свободных сульфг...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Тонкостенных, Ultra-Clear трубы	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Жизнь Tecnologies	AM1344M
Флуоресцеин-5-Maleimide	Thermo Технологии Научная жизнь	46130 F150	46130 вышла из строя замена с F150
Пирс Биотин Количественный Kit	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-биотин, No-взвешивание формат	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) п Сшивающие агенты	Thermo Scientific	22107
10-20% Трис-глицин гель	Invitrogen	EC61352
Laemmli буфера	Bio-Rad	1610737
Трис-глицин SDS Запуск буфера	Invitrogen	LC2675
Трис-глицин Передача буфера	Invitrogen	LC3675
Нитроцеллюлозные мембранные фильтр Sandwich бумаги	Invitrogen	LC2001
Фосфатазы Маркированный аффинно очищенные антитела к IgG кролика	Kirkegaard и Perry Laboratories	0751516
NBT / BCIP фосфатазы основания	Kirkegaard и Perry Laboratories	508107