L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Résumé

Procédé pour analyser l'accessibilité au solvant du groupe thiol de résidus cystéine de Cueilleur rayado fino virus (MRFV)-particules de type virus (VLP) suivi d'un peptide réaction de réticulation est décrit. La méthode tire parti de la disponibilité de plusieurs groupes chimiques à la surface des particules de type viral qui peuvent être les cibles de réactions spécifiques.

Résumé

Imitant et l'exploitation de propriétés du virus et les caractéristiques physico-chimiques et physiques promet d'apporter des solutions à certains des défis les plus urgents de la planète. La multitude et les types de virus associés à leurs propriétés intrigantes potentiellement donner des possibilités infinies pour les applications dans les technologies à base de virus. Les virus ont la capacité de s'auto-assembler en particules de forme discrète et la taille, la spécificité de symétrie, la polyvalence, et des propriétés stables dans une large gamme de conditions de température et de pH. Sans surprise, avec une gamme remarquable de propriétés, les virus sont proposés pour être utilisés dans les biomatériaux ^{9, 14, 15} vaccins, du matériel électronique, des outils et des produits chimiques, l'électronique moléculaire conteneurs ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.}

Afin d'utiliser les virus dans les nanotechnologies, elles doivent être modifiées de leurs formes naturelles pour donner de nouvelles fonctions. Ce défi processus peut être réalisée par plusieurs mécanismes comprenant la modification génétique du génome viral et la fixation chimique des molécules étrangères ou souhaitée pour les groupes réactifs des particules virales ^8. La possibilité de modifier un virus dépend essentiellement des propriétés physico-chimiques et physiques du virus. En outre, les modifications génétiques ou physico-chimique doivent être effectuées sans affecter la structure du virus indigène et le fonctionnement du virus. Protéines de maïs rayado fino virus manteau (MRFV) s'auto-assembler dans Escherichia coli produisant des VLP stables et vides qui sont stabilisées par protéine-protéine interactions et qui peut être utilisé dans les applications des technologies à base de virus ^8. VLP produites dans des plants de tabac ont été examinés comme un échafaudage sur lequel une variété de peptides peuvent être affichés de manière covalente ^13. Ici, nous décrivons les étapes 1) à déterminer lequel des cystéines accessibles au solvant dans une capside du virus sont disponibles pour les modification, et 2) Bioconjugate peptides modifiés pour les capsides. En utilisant indigènes ou par mutation-inséré résidus d'acides aminés et des standards des technologies de couplage, une grande variété de matériaux ont été affichées sur la surface des virus de plantes tels que le virus de la mosaïque de Brome ^3, virus de la panachure Carnation ^12, niébé virus de la marbrure chlorotique ^6, la mosaïque du tabac virus ^17, virus de la mosaïque jaune navet ^1, et MRFV ^13.

Protocole

1. Inoculation et purification de virus VLP de plantes de Nicotiana benthamiana

1. Produire plafonnées T7-ARN transcrits à partir de pommes de terre du virus X (PVX) à base de plasmides vecteurs transportant MRFV de type sauvage (wt) et protéine d'enveloppe Cys-muté (CP) des gènes ^12, en utilisant Ambion de T7-mMessage mMachine Kit.
2. Pour chaque réaction transcription T7, inoculer deux feuilles complètement développées de N. benthamiana avec 10 pi de réactions et incuber les plantes pendant 10 jours en serre à 60% d'humidité pendant 16 heures avec de la lumière (25.000-30.000 lux) à 25 ° C et 8 h obscurité à 20 ° C.
3. Harves t N. benthamiana infectées par le virus laisse 10 jours après l'inoculation (dpi), peser le tissu végétal (50 grammes) et le placer sur la glace.
4. Homogénéiser la matière végétale dans un malaxeur en présence de 100 ml d'une solution glacée de 0,5 M Na-citrate, pH 5,5 (utilisation 2 ml de tampon par gramme de tissu végétal).
5. Filtrez homogénat par 3 couches de cheeseclOTH et de clarifier par centrifugation à 27.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant dans une éprouvette graduée froide, mesurer le volume, puis transvaser dans un bécher stérile réfrigéré. Jeter le culot.
6. Traiter le surnageant par addition de polyéthylène glycol 10% 8.000 (PEG 8.000), sous agitation pendant 15 min à 4 ° C, et incuber pendant encore 45 min à 4 ° C pour précipiter les particules de type virus (VLP)-PEG matrice.
7. Centrifuger l'échantillon à 27.000 xg pendant 20 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
8. Traiter la pastille en ajoutant 8 ml de 0,05 M citrate de Na-tampon, 5,5 contenant 2% de Triton X-100 pH. Swirl tubes à centrifuger le bien de libérer le culot. Transférer le culot et le tampon dans un bécher stérile réfrigéré. Rincer immédiatement les tubes de 2 ml du même tampon et ajouter dans le bécher. Agiter la suspension à 4 ° C jusqu'à ce que les granules sont dissous (en général 1 heure).
9. Clarifier par centrifugation pendant 5 min à 27.000 xg, jeter le culot, et processus le surnageant par centrifugation à 140.000 xg pendant 2 heures à 4 ° C.
10. Remettre en suspension le culot dans 1 ml 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et de placer la suspension sur un gradient de saccharose 10-40% réalisés dans 0,05 M de Na-citrate, pH 5,5.
11. Centrifuger le gradient pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C.
12. Rayonner une lumière sur le dessus du tube de centrifugation et recueillir la bande de diffusion de lumière supérieure à 4 cm de la partie supérieure du tube, diluer avec 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et centrifuger pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C.
13. Reprendre le culot dans 0,5 ml d'eau stérile et conserver à 4 ° C pendant un maximum de six mois.
14. Quantifier la concentration VLP en effectuant un dosage de protéine de Bradford. Le rendement de VLP est comprise entre 1 et 3 mg / g de tissu végétal.

2. Fluorescéine-5-maléimide-étiquetage Réactions des VLP

1. Préparer une solution de 1 mM de fluorescéine-5-maléimide (427,37 g / mol) dans 50 mM de sodium phosphate tampon, pH 7,0; 1 mM EDTA. Mélanger à l'aide du vortex et vérifier dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
2. Ajouter fluorescéine-5-maléimide à VLP produites à l'étape 1 et mélanger. Utiliser un excès 25-fois molaire de fluorescéine-5-maléimide de la quantité molaire de groupes sulfhydryle. En règle générale, l'utilisation de VLP 30 pi à la concentration de 1 pg / pl et 60 ul de la solution de fluorescéine-5-maléimide produit des résultats acceptables.
3. Incuber la réaction pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
4. Mettre fin à la réaction par addition de dithiothreitol (DTT) à une concentration finale de 50 mM.
5. Retirer n'ayant pas réagi fluorescéine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante.
6. Pour analyse SDS-PAGE, ajouter 10 ul de 2 x SDS-PAGE tampon échantillon de Laemmli à 10 pl de chaque réaction. Rangez la protéine marquée abri de la lumière à 4 ° C pendant un mois ouà usage unique aliquots à -20 ° C jusqu'à 3 mois.

3. Réaction de marquage et de détermination de constitution biotine

1. Utilisez les colonnes de spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) pour effectuer un échange de tampon de l'eau de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,0 des VLP produites à l'étape 1.
2. Préparer une solution mère à 20 mM de maléimide PEG2-biotine en ajoutant ul 190 de PBS Non-Weigh-maléimide PEG2-biotine et mélanger par pipetage de haut en bas.
3. Ajouter maléimide PEG2-biotine pour les VLP et mélanger. Utiliser un excès 10-fois molaire de réactif de solutions VLP ≤ 2 mg / ml.
4. Incuber la réaction à température ambiante pendant 4 h.
5. Retirer n'ayant pas réagi maléimide PEG2-biotine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante.
6. Déterminer le nombre de moles de biotine par mole de VLP en utilisant la biotine Pierce Quantification Kit (Thermo Scientific) et following instructions du fabricant.

4. La réticulation de Cys 2-VLP et F Peptide

1. VLP qui conduit à des résidus de cystéine disponibles pour la réticulation de l'étape 2 (Cys 2-VLP) sont utilisés dans l'étape suivante. Préparer une solution mère fraîche de réticulation (28,63 mM) en dissolvant 10 mg de NHS-PEG4-maléimide de réticulation en 680 ul de diméthylsulfoxyde.
2. Dissoudre un 17 (F)-amino peptide acide long (LLPNMOKDKEACAKAPL) dans 50 ul de tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) à une concentration de 0,1 mM.
3. Ajouter 4 pl de réticulation à 50 ul du peptide dissous (protéine-NH2) à 1 mM concentration finale (qui est un excès de 10 fois molaire de 0,1 mM de solution de peptide).
4. Incuber la réaction pendant 2 heures à 4 ° C.
5. Purifier réticulé peptide en utilisant une colonne de dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) équilibrée avec du tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) par centrifugation à 1500 xgpendant 1 min à température ambiante.
6. Créer un mélange réactionnel combinant VLP (-protéine SH) et réticulé peptidiques (protéine-NH2) dans un rapport molaire déterminée par le nombre de thiols et amines activées intervenant dans la réaction et la différence de poids moléculaire entre VLP et peptidiques.
7. Incuber le mélange réactionnel à température ambiante pendant 2 heures à 4 ° C.
8. Pour l'analyse par Western blot, mélanger le produit conjugué résultant 1:1 avec du tampon Laemmli, faire bouillir pendant 10 minutes, et de procéder à SDS-PAGE sur un casting de pré-10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), suivie par un électrotransfert sur une membrane de nitrocellulose (Invitrogen). Bloquer les membranes avec 1 x PBS, pH 7,2 contenant 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) et 5% de poudre de lait écrémé et de la sonde avec le peptide anticorps spécifiques suivies par la phosphatase approprié anticorps secondaire marqué.

Résultats

L'expression transitoire de mutants MRFV manteau de protéines (CP) des gènes dans N. benthamiana dans un vecteur PVX VLP à base produisant est décrit dans la figure 1. Le gène modifié MRFV protéine d'enveloppe est amplifié par PCR puis placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur subgénomique CP dupliqué dans un vecteur PVX-base, pP2C2S ^2, (un cadeau de D. Baulcombe, Laboratoires Sainsbury, Norwich, Angleterre). En vitro transcription de l'ARN...

Discussion

La méthode présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de cystéines réactives présentes sur la surface de particules de type viral de plantes produites ainsi que tous les autres complexes protéiques. Maléimides sont thiol-spécifique des réactifs, qui réagissent avec sulfhydryle libres des molécules contenant de former des liaisons thioéther stable. Cette méthode s'appuie sur la spécificité des maléimides à réagir avec des groupes sulfhydryle pas impliqués dans les interactions avec ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Thinwall, Ultra-Clear Tubes	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Tecnologies vie	AM1344M
Fluorescéine-5-maléimide	Thermo Scientific Technologies de la vie	46130 F150	46130 est hors de substitution afin d'F150
Kit de quantification Pierce biotine	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotine, Non-Weigh Format	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) n Réticulants	Thermo Scientific	22107
10-20% de Tris-Glycine gel	Invitrogen	EC61352
Tampon Laemmli	Bio-Rad	1610737
Tris Glycine SDS Exécution tampon	Invitrogen	LC2675
Tris Glycine transfert Tampon	Invitrogen	LC3675
Membrane de nitrocellulose papier filtre Sandwich	Invitrogen	LC2001
Affinity phosphatase marqué anticorps purifiés à IgG de lapin	Kirkegaard et Perry Laboratories	0751516
Substrat de la phosphatase NBT / BCIP	Kirkegaard et Perry Laboratories	508107