Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Özet

Sistein artıkları tiyol grubunun çözücü yönelik analiz etmek için bir yöntem, Mısır rayado fino virüsü (MRFV)-virüs benzeri tanecikler (VLP'ler) tarif edilir. Yöntem, belirli reaksiyonlar için hedef olabilir VLP'ler yüzeyi üzerinde çeşitli kimyasal gruplarından durumu yararlanır.

Özet

Virüs özellikleri ve fiziko-kimyasal ve fiziksel özelliklerini taklit ve sömürücü dünyanın en acil sorunlarından bazılarına çözümler sunmak için umut vaat ediyor. Sırf aralığı ve ilginç özellikleri ile birleştiğinde virüs tipleri potansiyel virüs tabanlı teknolojilerde uygulamalar için sonsuz fırsatlar verecektir. Virüsler, sıcaklık ve pH koşulları altında geniş bir yelpazede farklı şekil ve boyut, simetri özgüllüğü, polyvalence, ve sabit özelliklere sahip partiküller halinde kendini monte etmek özelliğine sahiptir. Doğal olarak, bu gibi özelliklerinin dikkate değer bir dizi ile, virüs biomateryaller ^{9, aşılar, 14, 15,} elektronik maddeler, kimyasal araçlar, konteynırlar ve moleküler elektronik ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12} olarak kullanım için önerilmiştir.

Nanoteknolojide virüsler kullanılması için, yeni işlevler vermek için kendi doğal formlardan değiştirilmesi gerekir. Bu zorlu process gen viral genomun değişiklik ve kimyasal olarak virüs parçacığı reaktif gruplar ⁸ ile yabancı ya da arzu edilen moleküllerin bağlanması dahil çeşitli mekanizmalar vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bir virüs değiştirme yeteneği öncelikle virüs fizikokimyasal ve fiziksel özelliklerine bağlıdır. Buna ek olarak, genetik veya fizikokimyasal olumsuz değişiklikler virüsün doğal yapısını ve fonksiyonunu etkileyen virüs olmadan gerçekleştirilmesi gerekir. Maize rayado fino virüsü (MRFV) kat proteinler, protein-protein stabilize edilmektedir kararlı ve boş VLP'ler üreten E. coli içinde kendi kendine bir araya etkileşimi ve bu virüs bazlı teknolojileri uygulamalar ⁸ kullanılabilir. Tütün bitkilerinde üretilen peptidlerin VLP'ler çeşitli kovalent ¹³ görüntülenebilir hangi bir yapı iskelesi olarak incelenmiştir. Burada, bir virüs kapsid içinde çözücü erişilebilir sissteinler hangi modifikasyonu için kullanılabilir belirlemek) 1 adımları açıklarkatyon, ve 2) capsids ile değiştirilmiş peptitler bioconjugate. Doğal ya da mutationally takılan amino asit kalıntıları ve standart bağlama teknolojileri kullanarak, malzemeler çok çeşitli böyle Brom mozaik virüsü ^3, karanfil benek virüsü ^12, Börülce klorotik benek virüsü ^6, Tütün mozaik virüsü gibi bitki yüzeyinde ortaya konulmuştur Virüs ^17, Şalgam sarı mozaik virüsü ¹ ve MRFV ^13.

Protokol

1. Nicotiana benthamiana Bitkiler Virüs Aşılaması ve VLP'ler Arıtma

1. Patates X virüsü (PVX) tabanlı taşıyan vektör plasmidlerden şapkalı T7 RNA transkriptleri üretin MRFV wild-tip (wt) ve Cys-mutasyona uğramış kılıf protein (CP) genleri ^12, Ambion en T7-mMessage mMachine Kit kullanarak.
2. Her T7 transkript reaksiyon için, N., iki tam genişletilmiş yaprakları aşılamak 10 ul reaksiyon ile ve 25 ışık (25,000-30,000 lux) ile 16 saat süreyle% 60 nem, serada 10 gün için inkübe edilir benthamiana bitkiler 20 ° C'de ve 8 saat karanlık ° C.
3. Harves t N. benthamiana virüs bulaşmış yaprakları 10 gün sonrası aşılama (dpi), buz üzerinde bitki doku (50 gram) ve yer tartın.
4. 0.5 M Na-sitrat tampon, pH = 5.5 (kullanımı 2 bitki gram doku başına tampon ml) içinde soğutulmuş bir çözeltisi, 100 ml varlığında, bir karıştırıcı içinde bitki materyali homojenize edilir.
5. Cheesecl 3 kat boyunca Homojenat Filtreoth ve 30 dakika boyunca 27,000 x g'de santrifüj ile netleştirmek. Soğutulmuş mezun silindirin içine supernatant aktarın, hacmini ölçmek ve sonra soğutulmuş steril behere aktarılır. Pelet atın.
6. 4 ° C sıcaklıkta 15 dakika için karıştırılır,% 10 polietilen glikol 8000 (PEG 8000) ilave edilerek süpernatant işleme ve 4 de ilave bir 45 dakika süreyle inkübe ° C virüs benzeri tanecikler (VLP'ler)-PEG matris çökeltilir.
7. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 27,000 x g numune santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın.
8. 0.05 M Na-sitrat tamponu, 5.5 2 içeren% Triton X-100, pH 8 ml ilave edilerek pellet işlemden geçirin. Swirl santrifüj tüplerine de pelet yayınlayacak. Soğutulmuş steril behere pelet ve tampon aktarın. Aynı tampon, 2 ml ile hemen tüpler yıkayın ve behere ekleyin. Pelet (genellikle 1 saat) çözülene ° C kadar 4 de süspansiyon karıştırın.
9. 27,000 x g'de 5 dakika için santrifüjleme ile netleştirmek için pelet atmak ve p,4 de 2 saat boyunca 140,000 x g'de santrifüj ile roses süpernatant ° C.
10. 1 ml 0.05 M Na-sitrat tampon, pH 5.5 'de pelet yeniden süspanse edin ve 0.05 M Na-sitrat tampon, pH = 5.5 içinde yapılmış bir% 10-40 oranında sakaroz eğim üzerine süspansiyon yerleştirin.
11. 4 de 140,000 xg'de 3 saat boyunca gradyanı Santrifüj ° C.
12. Santrifüj tüpünün üst üzerine hafif bir parlaklık ve tüpün üst kısmından 4 cm ışık saçılım üst bant toplamak, 4 az 140,000 xg'de 3 saat için 0.05 M Na-sitrat tamponu, pH 5.5, ve santrifüj ile sulandırmak ° C.
13. Altı ay için 4 ° C de steril su deposu ve 0.5 ml içinde pellet yeniden süspanse edin.
14. Bir Bradford protein tayini yapılarak VLP'ler konsantrasyonunu ölçmek. VLP'ler verimi bitki dokusunun 1 ila 3 mg / g'dır.

2. VLP'ler arasında Flöresein-5-maleimid-etiketleme Reaksiyonları

1. 50 mM sodyum fosfat içinde fluoresein-5-maleimit (427,37 g / mol) bir 1 mM çözelti hazırlayınE tamponu, pH 7.0, 1 mM EDTA. Vorteks kullanılarak karıştırılır ve tam çözünme doğrulayın. Alüminyum folyo ile ışıktan tüp koruyun.
2. Adım 1 ve karıştırın üretilen VLP'ler fluoreseinin-5-maleimid ekleyin. Sülfhidrilleri molar miktarda fluoresein-5-maleimit bir 25 kat molar fazlalık kullanın. Genel olarak, 1 ug / ml 'den ve fluoresein-5-maleimit solüsyonu 60 ul arasında derişimde VLP'ler 30 ul kullanılarak kabul edilebilir sonuçlar elde edilmektedir.
3. 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında gece boyunca 2 saat boyunca reaksiyon inkübe
4. 50 mM bir son konsantrasyon için ditiyotretol (DTT) ilave edilerek tepkime sona erdirme.
5. İzleme olmayan reaksiyona oda sıcaklığında 1,500 x g'de 2 dakika süre ile bir tuzsuzlaştırma spin kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) ve santrifüj kullanılarak floresein.
6. SDS-PAGE analizi için, her bir reaksiyon 10 ul 2 x SDS-PAGE Laemmli numune tamponu 10 ul ilave edin. Yukarı bir ay ya da için 4 ° C'de ışıktan koruyarak etiketli protein saklayın3 aya kadar -20 ° C'de tek kullanımlık alikotları.

3. Biotin Kuruluş ve reaksiyon Belirlenmesi Etiketleme

1. Su, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 1. Adımda üretilen VLP'ler arasında pH değeri 7.0 olan bir tampon alışverişi yapmak için tuzsuzlaştırma sıkma kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) kullanın.
2. Aşağı yukarı pipetleme ve tarafından maleimid-PEG2-biotin ve mix No-tartılır PBS 190 ul ekleyerek maleimid-PEG2-biotin bir 20 mM stok solüsyonu hazırlayın.
3. VLP'ler ve karıştırın maleimid-PEG2-biotin ekleyin. VLP'ler çözümler için bir ayıraç ile 10-kat molar fazlalığı kullanmak ≤ 2 mg / ml idi.
4. 4 saat için oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin.
5. İzleme olmayan reaksiyona oda sıcaklığında 1,500 x g'de 2 dakika süre ile bir tuz giderme spin kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) ve santrifüj kullanılarak maleimid-PEG2-Biotin.
6. Pierce Biotin kantitasyonu Takımı (Thermo Scientific) ve fo kullanarak VLP'ler mol başına biotin mol belirleyinüreticinin talimatlarına llowing.

4. Cys 2-VLP'ler ve F Peptid Çapraz bağlama

1. Adım 2. (2-Cys VLP'ler) çapraz bağlama için mevcut sistein kalıntıları ile sonuçlanmıştır VLP'ler aşağıdaki adımda kullanılır. Dimetil sülfoksit 680 ul NHS-PEG4-maleimid çapraz bağlayıcı 10 mg çözülerek taze bir çapraz-bağlayıcı stok çözeltisi (28.63 mM) hazırlayın.
2. , 17 (F) çözülür-amino konjugasyon tamponu 50 ul (1 x PBS, pH 7.2, 1 mM EDTA) içinde asit uzunluğunda peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) 0.1 mM bir konsantrasyonda.
3. 1 mM nihai konsantrasyonunda (ki peptid solüsyonu, 0.1 mM için bir 10-kat molar fazlası tercih edilir) çözündürüldü peptit (protein-NH2) 50 ul çapraz bağlayıcının 4 ul ekle.
4. 4 ° C'de 2 saat inkübe reaksiyon
5. 1,500 x g'de santrifüj ile, konjugasyon tampon (1 mM EDTA 1 x PBS, pH 7.2) ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) kullanılarak çapraz bağlı peptit arındırmakOda sıcaklığında 1 dakika için.
6. VLP'ler (protein-SH) ve reaksiyon ile VLP'ler ile peptid arasında bir moleküler ağırlık arasındaki fark olarak dahil tioller ve aktive edilmiş aminlerin sayısına göre belirlenen bir molar oranda çapraz bağlı peptit (protein-NH2) birleştiren bir reaksiyon karışımı ayarlayın.
7. 4 ° C'de 2 saat için oda sıcaklığında reaksiyon karışımı inkübe
8. Western blot analizi için, Laemmli tamponu, 10 dk için kaynatılır, ile elde edilen konjüge ürün 1:1 Karışım ve% 10-20 Tris-Glisin jeli (Invitrogen) ve bir ön-dökme üzerinde SDS-PAGE ile devam edin, bir üzerine electroblotting takiben Nitroselüloz zar (Invitrogen). 1 x PBS, pH 7.2% 0.05 Tween 20 (PBS-Tween) ve uygun fosfataz-etiketli ikincil antikor tarafından takip peptit-spesifik antikorlar ile% 5 kaymağı alınmış süt tozu ve sonda içeren membranlar ile engelleme.

Sonuçlar

N. mutant MRFV kılıf protein (CP) genlerin geçici ifadesi bir PVX bazlı vektör üretiminde VLP'ler içinde benthamiana bitki Şekil 1 'de tarif edilmektedir. Modifiye MRFV kılıf protein geni bir PVX tabanlı vektör, pP2C2S ^2, (D. Baulcombe, Sainsbury Laboratuvarları, Norwich, İngiltere bir hediye) olarak çoğaltılamaz subgenomik CP organizatörü transkripsiyonel kontrolü altında amplifiye ve sonra yerleştirilir. Yılında In vitro RNA transkr...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem, bitki üretilen VLP'ler yüzeyi üzerinde hem de diğer protein kompleksleri üzerinde mevcut reaktif sistein çok hassas ve hızlı bir analizine izin verir. Maleimides stabil tiyoeter bağları oluşturmak için ücretsiz sülfidril içeren moleküllerle reaksiyona tiyol özgü reaktifler vardır. Bu yöntem, diğer amino asitler ile etkileşimlerine sülfhidril grupları ile tepkimeye maleimides özgüllüğünü dayanmaktadır. VLP'ler arasında doğal yapısının korunması tüm sü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Thinwall, Ultra-Clear Tüpler	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Takımı	Yaşam Teknolojileri	AM1344M
Fluoresein-5-Maleimid	Thermo Scientific Life Teknolojileri	46130 F150	46130 F150 ile sipariş yerine dışında
Pierce Biotin Kantifikasyonu Takımı	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimid-PEG2-Biotin, Biçim No-Weigh	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) n Çapraz Bağlayıcılar	Thermo Scientific	22107
% 10-20 Tris-Glisin jeli	Invitrogen	EC61352
Laemmli Tampon	Bio-Rad	1610737
Tris Glisin SDS Buffer Koşu	Invitrogen	LC2675
Tris Glisin Transferi Tampon	Invitrogen	LC3675
Nitroselüloz Membran Filtre Kağıdı Sandviç	Invitrogen	LC2001
Tavşan IgG antikor Arıtılmış Fosfataz Etiketli Affinity	Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları	0751516
NBT / BCIP Fosfataz Yüzey	Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları	508107