Electroporation האזור Subventricular ילודים

Summary

אנחנו מדגימים את טכניקה פולשנית המכונית electroporation האזור subventricular ילוד. הטכניקה מורכבת של הזרקת DNA פלסמיד לתוך חדרי לב לרוחב של גורים ילודים ויישום זרם חשמלי כדי לספק ולתפעל גנטיים תאי גזע עצביים

Abstract

תאי גזע עצביים (NSCs) קו רוחב חדרי לב לאחר הלידה ולהצמיח סוגי תאים רבים הכוללים נוירונים, האסטרוציטים, ותאי ependymal ^1. הבנת המסלולים המולקולריים האחראים למל"ל התחדשות עצמית, מחויב, וההתמיינות היא קריטית לרתימת הפוטנציאל הייחודי שלהם כדי לתקן את המוח ולהבין טובים יותר את הפרעות במערכת עצבים מרכזיות. קודם שיטות למניפולציה של מערכות יונקים נדרשו זמן מאמץ רב ויקר של הנדסה גנטית ברמת החיים השלמה ^2. לכן, הרוב המכריע של מחקרים בחן את הפונקציות של מולקולות המל"ל במבחנה או בחסרי חוליות.

הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקה הפשוטה ומהירה כדי לתפעל NPCs יילודים המכונה האזור electroporation subventricular יילודים (SVZ). טכניקות דומות פותחו לפני עשור כדי ללמוד NSCs העוברי וסייעו מחקרים על cortical פיתוח ^3,4. לאחרונה זה יושם ללמוד המוח הקדמי המכרסם לאחר לידת ^5-7. טכניקה זו מביאה לתיוג חזק של SVZ NSCs וצאצאיהם. לפיכך, לאחר לידת SVZ electroporation מספק עלות וזמן חלופי יעילה להנדסה גנטית של יונקי המל"ל.

Protocol

הליך זה בהתאם לדרישות ייל IACUC. מדענים צריכים לוודא שהנחיות IACUC מאושרות ואחריו על פי הדרישות המוסדיות שלהם.

1. סעיף 1. הכנת דנ"א, פתרונות, וזכוכית פיפטות

1. צור טוהר גבוה (OD 260/280> 1.80) ריכוז גבוה (מיקרוגרם / μl> 2.5) אנדוטוקסין נטול ה-DNA.
2. הכן תמיסת מלח 0.9% ומסנן סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 22.
3. 10 צינורות Place סנטימטר אש מלוטשים ורוסיליקט זכוכית נימים (OD: 1.5 מ"מ, מזהה: 1.10 מ"מ) למודל PP-830-10 Narishige מחשב זכוכית פיפטה חולץ עם חוט kanthal. הגדר חולץ למשיכת צעד אחד משוקללת ב70.5 מעלות צלזיוס לשבור טיפים עם מלקחיים מעגליים ולבדוק תחת מיקרוסקופ לנתח לקצוות משוננים. טיפי שיפוע ומקום תחת מנורת UV במשך 15 דקות. pipettes משך צריך להיות מסומן ב 2 מ"מ מהקצה של הקצה.
4. הכן 0.1% משקל / נפח המהיר הירוק solutiעל ידי ערבוב פתרון סטרילי מסונן 0.9% עם מלח ירוק מהיר יבשה.

2. סעיף 2. הכנת בעלי חיים, זכוכית פיפטה טוענת והזרקת פלסמיד

1. הסר יום לאחר לידה בנפרד 0-1 גורים מכלובים, מקום על צלחת פטרי זכוכית מראש צוננת עד 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מקום על קרח רטוב.
2. לאחר כ 5 דקות, לקבוע את המצב של הרדמה על ידי ניצול את תגובת דחק הרגל. אם אין תנועה מתרחשת, גורי בכפוף להזרקה תוך חדרים.
3. חשוב לציין כי שילוב של ירוק מהיר, ה-DNA, ותמיסת מלח יכול לגרום לאידוי מהיר, התגבשות, ומצור על pipettes זכוכית. לכן, לייצר פתרון מניות ו1-2 μl aliquot על parafilm מייד לפני זריקות.
4. לשאוב נפח aliquoted כל עם הכוס טפטפה משך.
5. החזק את הראש של הגור בין אגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית פחות שלך.
6. הפעל מנורהד להחזיק את הראש של גור, ממש מחוץ לאלומת אור. במידת צורך, לשים מלח על ראש כדי להפחית את כמות האור מוחזר על ידי גור. חדרי הלב עכשיו צריכים להיות מוארים.
7. עם היד הדומיננטית שלך, הכנס את המחט לתוך חלל רוחב הקרוב אליך (האיור 1A ו-1B). במקום הזרקה צריך להיות כ מרחק שווה מהתפר והעין ו2 מ"מ לרוחב כדי תפר sagittal lambdoid. הכנס משכתי פיפטה לסימן המ"מ 2 עבור P0 גור, שאמור להבטיח חדירה לתוך חלל הרוחב. בצירוף מקרים, אתה עשוי לראות חזרה של מילוי CSF לתוך פיפטה משחרור לחץ תוך גולגולתי. כדי להפחית את לחץ תוך גולגולתי, המסייע בהזרקה של פלסמיד, לשחרר את האחיזה שלך על ראש pup.Step 2.8. להזריק כ -0.5 μl של פלסמיד לתוך חדר לב לרוחב באמצעות הזרקת אוויר בלחץ (Picospritzer, פארקר).

3. סעיף 3. Electroporation ושחזור

1. Seלא המתח של הגנרטור electroporation במשך 5 פולסים מרובעים, 50 msec / דופק של 100 וולט, עם 950 מרווחי msec. הסגולי המרחבי של electroporation פלסמיד מוכתב על ידי הכיוון של העברת תשלום. תשומת לב צריכה להינתן למיקום נתון ההטרוגניות של אוכלוסיות תאי גזע לאורך SVZ ^8. הבדלים בשיעורי התפשטות וגורל תא זוהו למקומות גחון גב וזנב ^{מקוריים-9,10.}
2. ברגע פלסמיד מוזרקת, לטבול אלקטרודות פינצטה לתוך PBS. צעד זה הוא למקסם את העברת תשלום וכדי למנוע כוויות שנגרמו על ידי התנגדות.
3. הנח את האלקטרודה החיובית על הקיר לרוחב הגב של הגור ליד אוזן ipsilateral לאתר של הזרקת פלסמיד (האיור 1C ו1D). הנח את האלקטרודה השלילית על רוחב גחון ההמיספרה נגדית לחוטמו של הגור.
4. ליזום העברה נוכחית על ידי לחיצה על רגלי הדופקמכשפת דוושה ולסחוף את האלקטרודות מהגבה לרוחב באמצעות ~ 25 ° מרווחי זווית.
5. מקום electroporated גורים על כרית חימום למשך 5 דקות. בעדינות לסובב גורים בכל 30 שניות עם גירוי קל.

תוצאות

תוצאות ילודות subventricular אזור electroporation בתיוג של כמעט כל גליה הרציפה עם האזור הגבה, לרוחב גב, ורוחב subventricular בעקבות התנועה "הגורפת" של האלקטרודה פינצטה (האיור 1E) רדיאלי. עם זאת, electroporation ניתן להתאים לדרישה של הניסוי המתאים אך לא מטאטא את האלקטרודה ושימוש במיקו...

Discussion

כאן אנחנו פירוט הטכניקה של electroporation SVZ יילודים, טכניקה במהירות ובאופן עמיד לתייג ולטפל בתאי גזע SVZ וצאצאיהם. ישנם מספר יתרונות שיש electroporation בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, מאחר תיוג המוקד של תאים, אחד הוא מסוגל להבחין סלולריות השפעות אוטונומיות אוטונומיות ולא תא. מניפולצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
אבובי ורוסיליקט מלוטשים כבדים	מכשיר סאטר	BF150-110-10
Dual-שלב הזכוכית micropipette פולר	Narishige	PC-10h
גרין המהיר	הפישר סיינטיפיק	0521192205
ECM 830 Wave הכיכר פולסה גנרטור	הרווארד Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	הרווארד Apparatus	45-0488
מקור אור בסיבים אופטי	הפישר סיינטיפיק	12-562-36
הלוגן טונגסטןמנורה	USHIO אמריקה, Inc	1002247
Picospritzer השני	פארקר מכשירים	052-0312-900