JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri manipüle

Özet

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) hattı postnatal lateral ventriküllerin ve nöronlar, astrositler ve ependimal hücreleri 1 dahil olduğu birden fazla hücre tipleri yol açmaktadır. Moleküler MGK kendini yenileme, bağlılık sorumlu yollar ve farklılaşma anlama sokmak beyin onarım ve iyi merkezi sinir sistemi bozuklukları anlamak için eşsiz potansiyeli açısından son derece önemlidir. Memeli sistemlerin manipülasyon için Önceki yöntemler tüm hayvan 2 düzeyinde genetik mühendisliğinin zaman alıcı ve pahalı bir çaba gereklidir. Böylece, çalışmaların büyük çoğunluğu in vitro ya da omurgasız NSC moleküllerin fonksiyonlarının inceledik.

Burada, neonatal subventrikuler alanin (SVZ) elektroporasyon olarak ifade edilir neonatal NPC işlemek için basit ve hızlı bir teknik göstermektedir. Benzer teknikler embriyonik NSC'lerde çalışmak için bir on yıl önce geliştirilen ve cortica çalışmalar yardım etmişl geliştirme 3,4. Daha yakın zamanda bu postnatal kemirgen ön beyin 5-7 incelemek için kullanılmıştır. Bu teknik SVZ NSC'lerde ve yavrularının sağlam etiketleme sonuçlar. Böylece, postnatal SVZ elektroporasyon memeli MGK genetik mühendisliği için bir maliyet ve zaman etkin bir alternatif sunuyor.

Protokol

Bu prosedür Yale IACUC gereklerine uygun olduğunu. Bilim adamları IACUC kuralları kendi kurumsal ihtiyaçlarına göre onaylanmış ve takip edildiğinden emin olun.

1. Bölüm 1. DNA, Çözümler ve Cam Pipetler hazırlanması

  1. Yüksek saflıkta (OD 260/280> 1.80) yüksek konsantrasyon (mg / ul> 2.5) endotoksin-serbest DNA oluşturun.
  2. Bir 22 mikron filtre ile% 0.9 salin solüsyonu ve steril filtre hazırlayın.
  3. Sıra 10 cm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin (OD: 1.5 mm, ID: 1.10 mm) Model bir kanthal tel ile PP-830 Narishige PC-10 cam pipet çektirmenin içine. 70.5 de bir adım ağırlıklı çekme ° C'ye çektirme ayarlayın Dairesel forseps ile ipuçları kırın ve tırtıklı kenarları için bir diseksiyon mikroskop altında inceleyin. 15 dakika boyunca bir UV lamba altında Bevel ipuçları ve yer. Çekilir pipet uç kenarından 2 mm işaretlenmiş olması gerekmektedir.
  4. Ağırlık / hacim fast green soluti% 0,1 hazırlayınkuru fast green ile karıştırma filtrelenmiş steril% 0.9 salin solüsyonu ile ilgili.

2. Bölüm 2. Hayvan Hazırlama, Cam Pipet Yükleme ve Plazmid Enjeksiyon

  1. Bir cam Petri 4 önceden soğutulmuş üzerine, kafesleri 0-1 yavrular ayrı postnatal gün yer Kaldır ° C, ve sonra ıslak buz üzerinde bir yer.
  2. Yaklaşık 5 dakika sonra, ayak kıskı tepki kullanılarak anestezisi durumunu belirler. Intraventriküler enjeksiyonu hiçbir hareket meydana gelirse, konu yavrular.
  3. Hızlı yeşil, DNA ve salin solüsyonu kombinasyonu hızlı buharlaşma, kristalizasyon ve cam pipetler abluka neden olabilir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, bir stok solüsyonu ve enjeksiyon hemen önce parafilm üzerine kısım 1-2 ul oluşturur.
  4. Çekti cam pipet ile tüm aliquoted hacmi aspire.
  5. Başparmak ve az dominant elin işaret parmağı arasında yavru başkanı tutun.
  6. Lamba açmad sadece ışık huzmesinin dışında yavru kafa tutmak. Gerekirse, yavru yansıyan ışık miktarını azaltmak için baş salin koydu. Ventriküller şimdi yanmalıdır.
  7. Sizin baskın el ile (Şekil 1A ve 1B) en yakın lateral ventrikül içine iğne takın. Enjeksiyon sitesi sutura lambdoidea'nın göz ve sutur lateral 2 mm yaklaşık olarak eşit mesafede olmalıdır. Takın lateral ventrikül içine girmesi gereken, P0 yavru için 2 mm işaretine pipet çekti. Tesadüfen, kafa içi basınç sürümünden pipet içine BOS dolum geri görebilirsiniz. Plazmid enjeksiyon asistleri kafa içi basıncı azaltmak için, pup.Step 2.8 başınızın üzerine kavrama gevşetin. Bir hava basınçlı enjektör (Picospritzer, Parker) kullanarak lateral ventrikül içine plazmid yaklaşık 0,5 mikrolitre enjekte edilir.

3. Bölüm 3. Elektroporasyon ve Kurtarma

  1. Set 5 kare bakliyat, 950 msn aralıklarla 100 voltta 50 msn / darbe için elektroporasyon jeneratör voltajının. Plazmid elektroporasyon mekansal özgüllüğü yük transferinin yönü tarafından belirlenir. Yakın ilgi SVZ 8 boyunca kök hücre popülasyonlarının heterojenliği verilen yerleşim verilmelidir. Çoğalması ve hücre kaderinin oranıfarkları ventral-dorsal ve rostral-kaudal yerle 9,10 için tespit edilmiştir.
  2. Bir kez plazmid daldırma cımbız elektrotlar PBS içine enjekte edilir. Bu adım yük transferi maksimize etmek ve rezistivite kaynaklanan yanıklar önlemektir.
  3. Plazmid enjeksiyon sitesi (Şekil 1C ve 1D) ipsilateral kulağınıza yakın yavru dorsal lateral duvara pozitif elektrot yerleştirin. Yavrunun burnu ile kontralateral hemisferde ventral yanal üzerindeki negatif elektrot yerleştirin.
  4. Darbe ayaklar basarak cari transfer başlatıncadı dorsalden ~ 25 ° açı aralıkları kullanılarak lateral elektrotlar pedal ve süpürme.
  5. Sıra 5 dk için ısıtma pedi üzerine yavrular electroporated. Yavaşça hafif stimülasyon ile yavrular her 30 sn döndürün.

Sonuçlar

Cımbız elektrot "süpürme" hareketi (Şekil 1E) takiben dorsal, dorsal lateral ve lateral subventricular bölgesi ile mücavir neredeyse tüm radyal glia ve etiketleme Yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon sonuçlar. Ancak, elektroporasyon ilgili deney şartı uyarlanmış ancak elektrot süpürme ve video ayrıntılı olarak belirli yerleşimi ve yönlendirme kullanarak değil olabilir. Dorsal lokalize radyal glia bu astar ventrikülün lateral bölümünde farklı yana Örneği...

Tartışmalar

Burada ayrıntılı yenidoğan SVZ elektroporasyon tekniği, hızlı ve güçlü bir etiket ve SVZ kök hücre ve yavrularının işlemek için bir tekniktir. Elektroporasyon için diğer teknikler ile karşılaştırıldığında, sahip olduğu birkaç avantajı vardır. İlk olarak, hücrelerin odak etiketleme göz önüne alındığında, tek hücre ve otonom olmayan hücre otonom etkilerini ayırt edebilir. Indüklenebilir sistemleri kullanarak İkincisi, genetik manipülasyon birini önce veya sinaptik entegrasyon ...

Açıklamalar

Yazarlar yapmak için hiçbir açıklama yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Savunma Bakanlığı (Fikir geliştirme ödülü, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Kök hücre hibe (AB) ve Sağlık NRSA 10.668.225 (DMF) Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştir. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Eyaleti tarafından desteklenen çalışmaya dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Bölümü Devletin resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Inc fon, veri toplama çalışması tasarım herhangi bir rolü vardı ve analiz, yayınlamak kararı veya yazının hazırlanması.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Ağır Parlak Borosilikat Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Çift Kademeli Cam Mikropipet Çektirme Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Kare Dalga Sinyal jeneratörü Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optik Işık Kaynağı Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halojenlamba Ushio America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Aletleri 052-0312-900

Referanslar

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 72Geli imsel BiyolojiN robiyolojiMolek ler BiyolojiH cre BiyolojisiFizyolojiAnatomiBiyomedikal M hendisli iK k H cre BiyolojiGenetikn ronB y me ve Geli meCerrahisubventricular B lgesiElektroporasyonN ral K k H crelerMGKsubventricular b lgesibeyinDNAenjeksiyongenetik m hendisli iyenido an yavrularhayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır