La electroporación neonatal zona subventricular

Resumen

Se demuestra una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación neonatal zona subventricular. La técnica consiste en la inyección de ADN de plásmido en los ventrículos laterales de cachorros neonatales y la aplicación de corriente eléctrica para suministrar y manipular genéticamente las células madre neuronales

Resumen

Las células madre neurales (NSC) de la línea de los ventrículos laterales postnatales y dan lugar a múltiples tipos de células que incluyen neuronas, astrocitos y células ependimarias ^1. La comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la NSC auto-renovación, el compromiso y la diferenciación es fundamental para el aprovechamiento de su potencial único para reparar el cerebro y entender mejor los trastornos del sistema nervioso central. Los métodos anteriores para la manipulación de los sistemas de mamíferos requiere el esfuerzo largo y costoso de la ingeniería genética a nivel animal entero ^2. Por lo tanto, la gran mayoría de los estudios han examinado las funciones de las moléculas NSC in vitro o en los invertebrados.

Aquí se demuestra la técnica simple y rápida para manipular NPCs neonatales que se conoce como zona neonatal subventricular (SVZ) electroporación. Técnicas similares se han desarrollado hace una década para estudiar NSCs embrionarias y han ayudado a los estudios sobre Cortical desarrollo ^3,4. Más recientemente, este fue utilizado para estudiar el cerebro anterior roedor postnatal ^5-7. Esta técnica da como resultado el etiquetado robusto de SVZ NSCs y su progenie. Por lo tanto, postnatal SVZ electroporación ofrece una alternativa costo y tiempo efectivo de mamíferos ingeniería genética NSC.

Protocolo

Este procedimiento es conforme con los requisitos de Yale IACUC. Los científicos deberían asegurarse de que las directrices sean aprobadas IACUC y siguió de acuerdo a sus necesidades institucionales.

1. Sección 1. Preparación de ADN Pipettes, soluciones y Vidrio

1. Generar alta pureza (OD 260/280> 1,80) alta concentración (mg / l> 2,5) libre de endotoxinas ADN.
2. Preparar 0,9% de solución salina y el filtro estéril a través de un filtro de 22 micras.
3. Colocar 10 cm fuego pulido tubos capilares de vidrio de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) en un modelo PP-830 Narishige PC-10 extractor de pipeta de vidrio con un alambre de Kanthal. Conjunto extractor para una tracción paso ponderado en 70.5 ° C. Rompa las puntas con unas pinzas circulares e inspeccionar bajo un microscopio de disección para los bordes dentados. Puntas cónicas y se coloca bajo una lámpara UV durante 15 min. Pipetas Pulled deben ser marcadas en 2 mm del borde de la punta.
4. Preparar 0,1% peso / volumen verde rápido solutipor mezcla filtrada estéril solución salina al 0,9% con el verde de secado rápido.

2. Sección 2. Preparación de los animales, pipeta de vidrio de carga y de inyección de plásmido

1. Retire el día postnatal 0-1 crías en jaulas individuales, en lugar de un plato de Petri de vidrio previamente enfriado a 4 ° C, y luego colocar en hielo húmedo.
2. Después de aproximadamente 5 min, determinar el estado de anestesia mediante la utilización de la respuesta pellizco pie. Si no hay movimiento, las crías sometidas a la inyección intraventricular.
3. Es importante señalar que la combinación de verde rápido, ADN, y la solución salina puede dar como resultado la rápida evaporación, cristalización, y el bloqueo de pipetas de vidrio. Por lo tanto, generar una solución madre y parte alícuota de 1-2 l sobre Parafilm inmediatamente antes de las inyecciones.
4. Aspirar todo el volumen alícuota con la pipeta de vidrio tirado.
5. Sostenga la cabeza del cachorro entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante.
6. Encienda una lámparad sostenga la cabeza del cachorro a las afueras del haz de luz. Si es necesario, poner en solución salina cabeza para reducir la cantidad de luz reflejada por las crías. Los ventrículos ahora debe estar iluminado.
7. Con la mano dominante, inserte la aguja en el ventrículo lateral más cercano a usted (Figura 1A y 1B). El sitio de inyección debe ser de aproximadamente equidistante de esta sutura y el ojo y 2 mm lateral a la sutura sagital. Insertar sacó la pipeta hasta la marca de 2 mm para un cachorro P0, que debería asegurar la penetración en el ventrículo lateral. Coincidentemente, es posible que vea el relleno de líquido cefalorraquídeo en la pipeta de la liberación de la presión intracraneal. Para reducir la presión intracraneal, lo que ayuda a la inyección de plásmido, aflojar su control sobre la cabeza de la pup.Step 2,8. Inyectar aproximadamente 0,5 l de plásmido en el ventrículo lateral utilizando un inyector de aire a presión (Picospritzer, Parker).

3. Sección 3. La electroporación y la recuperación

1. Set la tensión del generador de electroporación para 5 impulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 voltios, con intervalos de 950 mseg. La especificidad espacial de la electroporación del plásmido está dictada por la direccionalidad de transferencia de carga. Debe prestarse atención dada a la colocación dada la heterogeneidad de las poblaciones de células madre a lo largo de la SVZ ^8. Las diferencias en las tasas de proliferación y el destino celular se han identificado lugares ventral-dorsal y caudal ^{rostral-9,10.}
2. Una vez que el plásmido se inyecta, introducir los electrodos de pinza en PBS. Este paso es maximizar la transferencia de carga y para evitar quemaduras causadas por la resistividad.
3. Coloque el electrodo positivo en la pared lateral dorsal del cachorro cerca de la oreja ipsilateral al sitio de la inyección de plásmido (Figura 1C y 1D). Coloque el electrodo negativo en el hemisferio contralateral lateral ventral al cachorro hocico.
4. Iniciar la transferencia actual presionando los foots pulsobruja pedal y barrer los electrodos de dorsal a lateral utilizando ~ 25 ° intervalos angulares.
5. Lugar a electroporación cachorros en una almohadilla de calentamiento durante 5 min. Gire suavemente crías cada 30 segundos con una estimulación suave.

Resultados

Neonatales subventricular resultados zona de electroporación en el etiquetado de casi toda la glía radial contigua a la zona dorsal, lateral dorsal subventricular, y lateral siguiendo el "barrido" de movimiento del electrodo de pinza (Figura 1E). Sin embargo, la electroporación se pueden adaptar a los requisitos del experimento respectivo pero no barriendo el electrodo y el uso de la colocación y orientación específicos tal como se detalla en el vídeo. Por ejemplo, desde la glía radial...

Discusión

Aquí detalle la técnica de electroporación SVZ neonatal, una técnica para etiquetar rápidamente y con firmeza y manipular células SVZ madre y su progenie. Hay varias ventajas que la electroporación tiene en comparación con otras técnicas. En primer lugar, dado el etiquetado focal de células, uno es capaz de discernir celulares autónomos efectos autónomos y no por células. Segunda manipulación, genética utilizando sistemas inducibles permite comparar los efectos antes o después de la integración sinápti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Pesado tubo de borosilicato pulido	Sutter Instrument	BF150-110-10
Dual-Stage vidrio Micropipetas Puller	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Generador de impulsos de onda cuadrada	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fibra óptica Fuente de luz	Fisher Scientific	12-562-36
Tungsteno Halógenolámpara	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instrumentos	052-0312-900