בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Summary

שיטה פשוטה להקמת organoid גידול במעי העכברי העיקרי מתוארת. שיטה זו מנצלת את התכונה שתאים סרטניים במעי הגס לשרוד ולגדול לתוך organoids בתקשורת המכילות גורמי צמיחה מוגבלים, ואילו מעי גס נורמלי אפיתל לא.

Abstract

כמה שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות ועכבריות כבר הוקמו, יושרה פיזיולוגית של גידולים במעי גס, כגון מספר שכבות של תאים הבזליים, קוטביות-apical, יכולת להבחין וanoikis אינה נשמרת בשורות תאים שמקורם בסרטן מעי גס. המחקר הנוכחי מדגים שיטה לorganoids culturing העיקרי עכבר הסרטניים במעי הגס המותאמים מסאטו T et al. ^1, השומר על תכונות הפיזיולוגיות חשובות של גידולים במעי גס. שיטה זו מורכבת מאוסף עכבר מעי גס גידול רקמות, מעי גס הנורמלית הסמוכה האפיתל דיסוציאציה, מעי גס גידול עיכול תאים לתאים בודדים, הטבעת תאים סרטניים במעי הגס לmatrigel, והתרבות סלקטיבית המבוסס על העיקרון שתאים סרטניים לשמור על צמיחה בהגבלת תנאים תזונתיים בהשוואה למצב נורמלי תאי האפיתל.

את organoids הגידול הראשוני אם בודדו מעכברים מהונדסים גנטי לספק מערכת שימושית מאוד להעריך funct אוטונומי גידוליון של גנים ספציפיים. יתר על כן, את organoids הסרטניים ניתן למניפולציה גנטית על ידי וירוס המדיטציה מסירת גן; מסלולי איתות ולכן מעורבים בגידול במעי הגס יכולים להיות גם נחקרו בהרחבה על ידי ביטוי יתר או מציאה. תרבות organoids גידול הראשונית מספקת אמצעי רלוונטי ואפשרי פיסיולוגיים ללמוד את המנגנונים ושיטות טיפוליות לגידול במעי גס.

Introduction

תאי אפיתל במעי להתרבות ולהתהפך בקצב בלתי רגיל, outpacing כל רקמות אחרות בגוף חוליות ^2,3. את התאים המתחלקים, כולל תאי גזע מעיים (ISC) ותאי מעבר-הגברה להתמיין גם הפרשה (גביע, פנט וenteroendocrine) תאים או enterocytes ^3. ISC ממוקם בבסיס קריפטה. תאי פנט לרדת לעומקו של מאורות והם האריכו ימים, ואילו משפחות אחרות להעביר כלפי מעלה לסיסים ^3,4. כאן התאים נחשפים לתוכן המעיים, כולל חיידקים ולשפוך מהקצוות סיסי באמצעות מנגנון אפופטוטיים-Induced anoikis. אמנם חסר סיסי המעי הגס ותאי פנט, המנגנון לשמירה על הומאוסטזיס דומה ^4.

מסלול איתות Wnt היה מעורב במשחק תפקיד מכריע בהתפשטות מעיים וISC תחזוקה ^4. מחיקה של הדואר גורם שעתוק TCF4, מפעיל במורד הזרם של איתות Wnt, מוביל לאובדן של תאי גזע במעי ולאחר מכן פירוק של הרקמה ^5. בדומה לכך, ביטוי מהונדס של DKK1 מעכבי Wnt מפחית את התפשטות אפיתל וכלה את שושלות תאי הפרשה ^6. לעומת זאת, ביטוי יתר של אגוניסט Wnt R-spondin-1 פרוליפרציה חזקה ומהירה של תאי הקריפטה מעיים ^7.

לאור החשיבות של איתות Wnt להומאוסטזיס מעיים, מוטציות מסלול Wnt הם נצפו לעתים קרובות בסרטן מעי גס ^8. סרטן המעי הגס הוא הגורם שלישי למוות מהסרטן בארצות הברית ^9. הצריכה תזונתית עודפת עם בשר אדום ואלכוהול, פעילות גופנית מופחתת, ועוברת בירושה ומוטציות סומטיות נחשבות לגורמי סיכון לסרטן מעי גס ^10,11. Coli (APC) גן polyposis adenomatous, גורם איתות Wnt מפתח, הוא מוטציה ברוב של הרשות הפלסטיניתtients עם משפחתי, סדיר, וסרטן מעי גס קוליטיס הקשורים ^12,13. מוטציות של גורמים אחרים שהיו מעורבים במסלול איתות Wnt כולל Axin2 וβ-catenin הם נצפו גם בסרטן מעי גס ^14,15. עם זאת, המנגנון המדויק והטיפול יעיל לטיפול בסרטן המעי הגס הם עדיין חסרים. כדי להקל על החקירה של המנגנונים המולקולריים לסרטן מעי גס, שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות המייצגות את השלבים השונים של התקדמות הסרטן שונים משפיר לסוג תא אגרסיבי כבר הוקם ^16-18. שורות תאי סרטן מעי גס גרורתי עכבר עם מאפיינים שונים זמינות גם ^19,20. עם זאת, תאים ראשוניים או תרבויות organoid עדיפים על שורות תאים שינו כי הם מחקים באופן הדוק במצב vivo ולייצר יותר רלוונטית מבחינה פיזיולוגית נתונים ^21. רוב שורות תאים שמקורם מעי גס, סרטן לגדול כmonolayer מחוברת לצלחת או כהשעיות תא, lackinגרם של נטייה הפסגה-basolateral והדוקים צמתים בין תאים. כמו כן, תאי אפיתל במעי רגילים וגידול in vivo לעבור צורה ספונטנית של anoikis מכונה אפופטוזיס כמו התאים המובחנים להגיע לטיפים והסיסיים הם לשפוך ^22. תכונות אלה קשה לסכם בשורות תאים, אבל הם חשובים בתהליך ההתפתחות של סרטן מעי גס ^23. תכונות אלה נשמרות בorganoids הראשוני. בנוסף, תרבויות organoid הסרטניים לספק מערכת יעילה להערכת תפקודים אוטונומיים של גנים סרטניים בהשוואה במחקרי vivo. מניפולציה גנטית in vivo של המעי היא תהליך גוזל זמן בעיקר באמצעות יצירת מהונדס ו / או עכברים בנוקאאוט באמצעות נהגי מעי ספציפיים. עם זאת, את organoids הסרטניים הם בקלות נוחה למניפולציות גנטיות נגיפיות בתיווך ובכך כלי נהדר להערכת מנגנונים מולקולריים מדויקים. תרבויות hav organoid סרטניים במעי העיקרידואר הוכח כטכניקה אפשרית ורבת עוצמה. תרבית תאי מעי העיקרית יכולה להקים organoids מעיים פונקציונלי עם קבר ובעל מבנה סיסים במבחנה ממבוגר יחיד Lgr5 + תאי גזע ^24. ניתן להשתיל organoids אלה וengrafted לרקמת מעי פגום להתחדשות ^25. הסתגלות נוספת של תנאי התרבות עשתה organoids אפיתל דומה ממעי גס ובמעי הדק עכבר אנושי ומעי גס אפשרי ^1. לתרבות העיקרית נורמלית מעי גס האפיתל, מדיום התרבות בסיסית, כמו גם גורמי גדילה כולל EGF, Noggin, R-spondin וWnt3a הם חיוניים, ואילו מדיום התרבות בסיסי וEGF מספיק לגידול organoids גידול במעי עכבר העיקרי ^1. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד, תרבות, וליצור organoids גידול במעי הגס.

Protocol

1. בידוד גידול במעי גס ודיסוציאציה הסלולרי

1. יכול להיות מבודד מכל גידולים במעי מודל סרטן מעי גס או ספורדי מושרה טיפול. העכברים צריכים להיות מורדמים עם CO _2. נקודתיים נאספות אז, סמוקות קר מלוח פוספט שנאגרו (PBS) ונפתחו longitudinally. זהה את האזורים המכילים גידולים תוך שימוש בסטראו, לנתח עם זוג מספריים, ולשטוף עם PBS הקר.
2. דגירה שברי מעיים המכילים גידולים במאגר קלאציה EDTA (2 מ"מ EDTA, 5.6 mmol / L Na ₂ HPO _4, 8.0 mmol / L KH ₂ PO _4, 96.2 mmol / L NaCl, 1.6 mmol / L KCl, סוכרוז 43.4 mmol / L, 54.9 mmol / L-D סורביטול, 0.5 mmol / L DL-dithiothreitol במים מזוקקים) למשך 60 דקות על קרח.
3. לאחר כלצים, רוב תאי אפיתל במעי הנורמלי יהיה מנותק, ואילו תאים סרטניים יישארו מחוברים לmesenchyme. לשאוב את חיץ קלאציה המכיל תאי אפיתל נורמליםולשטוף את גידול השריד שברים עוד פעם אחת עם 5 חיץ קלאציה קר מ"ל.
4. לשאוב את חיץ קלאציה, לשטוף ברים סרטניים עם 5 מ"ל הקר 1x PBS.
5. לשאוב את PBS 1X, דגירה ברים סרטניים בחיץ עיכול (2.5% בסרום שור עוברי, יחידה / 1 מ"ל של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ"ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 200 U / מיליליטר הסוג IV collagenase, 125 מיקרוגרם / מיליליטר הסוג II dispase בשינוי הנשר בינוני של Dulbecco) במשך שעה 2 ב 37 ° C.
6. לאפשר שבר הגידול להתיישב תחת כובד נורמלי דקות 1, ולאסוף את supernatant בצינור פלקון 15 מ"ל. גלולה supernatant ההשעיה גידול התא הבודד על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות ולשטוף פעם עם 5 מ"ל PBS על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות.

2. תרבות של גידול מעיים

1. Resuspend התא גלולה גידול עם 500 PBS μl, לספור תאים סרטניים בודדים מבודדים באמצעות hemocytometer.
2. תאים סרטניים גלולה ידי סנטrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות, וresuspend אותם 5 מ"ג / מיליליטר Matrigel על קרח וצלחת ב24 גם צלחות ב15,000 תאים לכל 50 μl של Matrigel בכל טוב.
3. בואו Matrigel פלמר במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 500 מדיום תרבות μl / גם בסיס (יחידת 1 / מ"ל ​​של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ"ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 10 HEPES mmol / L , 2 המ"מ Glutamax, תוסף N2 1x, 1x תוסף B27, mmol / L N-acetylcysteine ​​1 בנשר Medium/F12 השינוי של מתקדם Dulbecco) המכיל 50 ng / EGF עכברי מ"ל.

3. תחזוקה של Organoids הוקם

1. שינוי התרבות בינונית בסיסית המכילים EGF כל 2 ימים והמעבר organoids 01:05 פעם בשבוע.
2. לpassaging, החלף את מדיום התרבות עם התרבות בינונית בסיסית טריות. מכאני לשבש organoids וMatrigel באמצעות פיפטה P1000 עם טיפים נותקו ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. ניתוק מכאני נוסף מושגת באמצעות אש מלוטש פסטר צינורטטי.
3. שטוף organoids ניתק עם 5 מ"ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות.
4. בטל supernatant, resuspend את הכדור עם Matrigel ולהוסיף מדיום התרבות כפי שתואר לעיל.

4. אחסון ושחזור של Organoids הוקם

1. עבור אחסון לטווח ארוך, להקפיא organoids בנוזל N ₂ שהם יציבים במשך לפחות 2 שנים. לorganoids המקפיא, לשבש באמצעות פיפטה P1000 עם הטיפים לחתוך ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ"ל.
2. שטוף organoids ניתק עם 5 מ"ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות.
3. בטל supernatant, resuspend את הכדור עם השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 20% בסרום שור העובר (FBS) ו -10% sulfoxide דימתיל (DMSO).
4. תאים להעביר לתוך 1.5 cryotubes מ"ל, ואז לשים את הצינורות במכל Nalgene מר פרוסטי מקפיא ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס כדי להשיג קצב קירורשל -1 מעלות צלזיוס / דקה. לאחר דגירה הלילה, להעביר צינורות לנוזל N _2.
5. להתאוששות, organoids הקפוא מופשר במהירות ב37 מעלות צלזיוס במים אמבטיה, לשטוף עם מדיום התרבות בסיסי, ספין למטה, resuspend בMatrigel והתרבות בתנאים שתוארו לעיל.

5. RNA מיצוי, מיצוי חלבון ואימונוהיסטוכימיה

1. RNA הפקה: תאים נאספים כמתואר לעיל למעבר. רנ"א הוא מבודד עם PicoPure ^TM-RNA בידוד ערכה לפי הוראות יצרן.
2. מיצוי חלבון: כדורי תא נאספים כמתואר לעיל וlysed במאגר 100 assay radioimmunoprecipitation μl (Ripa; 50 mmol / L טריס-HCl pH 7.5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% NP-40, 0.1 % SDS) עם מעכב פרוטאז 1x.
3. אימונוהיסטוכימיה: לשאוב את מדיום תרבות תא, להעביר organoids הסרטניים עם P1000 פיפטה עם טיפים נחתכו לCryo-עובש ולהקפיא באופן מיידי בTISלתבוע את מדיום הקפאה (אוקטובר) עם קרח יבש. חלקים קפואים נחתכו ב -7 מיקרומטר ומוכתם כפי שתוארו לעיל ^26.

תוצאות

מהלך הזמן של היווצרות organoid גידול במעי גס ^מדקות APC בן שלושת חודשים ^{/ +} עכבר מוצג באיור 1. ביום 0, תאים בודדים יכולים להיבחן כמה שעות לאחר ציפוי (איור 1 א). ליום 1 ביום, שרדו תאי האפיתל גידול במעי הגס עם גרעינים עקשן יכול להיבחן. ביום 3, בגודל ?...

Discussion

הפרוצדורות שתוארו בפרוטוקול זה תאפשר לבידוד והתרבות של גידולים במעי גס עכבריים ראשוניים. הפרוטוקול מותאם מעבודת הזרע נעשתה על ידי ד"ר קבוצת Clevers ^1,24,27. אנו מותאמים זמן העיכול וריכוז collagenase לקבל תשואה טובה יותר של organoids הסרטניים. השלבים הקריטיים כוללים עיכול תא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204