プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

要約

一次マウス結腸腫瘍オルガノイドを確立するための簡単​​な方法が記載されている。通常のコロンは上皮ないのに対し、この方法では、結腸腫瘍細胞が生き残ると限られた成長因子を含む培地中でオルガノイドに成長するという特徴を利用しています。

要約

いくつかのヒトおよびマウスの大腸癌細胞株が確立された、そのような複数の細胞層、基底頂端極性、分化する能力、およびアノイキスなどの結腸腫瘍の生理学的完全性は大腸癌由来の細胞株で維持されていない。本研究では、佐藤T ら ^1、大腸腫瘍の重要な生理機能を保持してから適応培養マウスの主結腸腫瘍オルガノイドするための方法を示しています。この方法は、腫瘍細胞が正常に比べて栄養素の条件を制限する上での成長を維持するという原理に基づいて、マウスの結腸腫瘍組織収集、隣接する正常結腸上皮解離、単一細胞に結腸腫瘍細胞を消化し、マトリゲルに結腸腫瘍細胞を包埋し、選択培養から成り上皮細胞。

原発腫瘍オルガノイド遺伝子組み換えマウスから単離した場合腫瘍自律FUNCTを評価するために非常に有用なシステムを提供特定の遺伝子のイオンである。また、腫瘍オルガノイドは遺伝子送達を瞑想ウイルスによる遺伝子操作に適している、大腸の腫瘍形成に関与し、したがってシグナル伝達経路は、また広範囲に過剰発現やノックダウンして調べることができます。原発腫瘍オルガノイド文化は、結腸腫瘍形成のためのメカニズムと治療法を研究する生理学的関連性の実現可能な手段を提供します。

概要

腸管上皮細胞が増殖し、脊椎動物の体^2,3の他のすべての組織を上回る、臨時の速度で裏返します。腸管幹細胞（ISC）と通過増幅セルを含む分裂細胞、分泌（ゴブレット、パネートおよび腸内分泌細胞）または腸³のいずれかに分化する。 ISCは、陰窩の底に位置しています。パネート細胞は陰窩の一番下まで移動し、他の系統は絨毛^3,4に上向きに移行するのに対し、長寿命です。ここでは細胞が微生物を含む腸の内容にさらされているとアノイキス誘発性アポトーシスのメカニズムを介して絨毛先端から流している。コロンは絨毛とパネート細胞を欠いていますが、恒常性を維持するためのメカニズムは⁴と似ています。

Wntシグナル伝達経路は、腸の増殖およびISCメンテナンス⁴において重要な役割を果たしているに関与している。番目の削除電子転写因子TCF4、Wntシグナルの下流エフェクターは、腸管幹細胞および組織破壊⁵の後続の損失につながる。同様に、Wntシグナル阻害剤DKK1のトランスジェニック発現は、上皮増殖を減少させ、分泌細胞系統^6を枯渇させる。逆に、WntシグナルアゴニストR-スポンジン-1の過剰発現は、腸陰窩細胞⁷の強力かつ迅速な増殖を誘導する。

腸のホメオスタシスのためのWntシグナル伝達の重要性が与えられ、Wnt経路の変異は、しばしば結腸癌⁸において観察されている。大腸癌は、米国⁹のがんによる死亡の3番目の主要な原因である。赤身の肉やアルコールを過剰摂取は、身体活動の減少、そして継承と体細胞突然変異は結腸癌^10,11のリスク要因であると考えられている。大腸腺腫性ポリポーシス（APC）遺伝子、キーWntシグナル伝達因子は、PAの大部分で変異されている^12,13、家族散発、および大腸炎関連大腸癌とtients。 Axin2およびβ-カテニンを含むWntシグナル伝達経路に関与する他の因子の変異はまた、大腸癌^14,15が観察される。しかしながら、結腸癌のための正確なメカニズムで効果的な治療法はまだ欠けている。結腸癌の分子機構の調査を容易にするために、積極的な細胞型に良性の癌の進行の異なる段階を示すヒト結腸癌細胞株は^{、16〜18が}確立されている。別の転移特性を有するマウスの大腸癌細胞株もまた^19,20入手可能である。彼らは密接に生体状態の模倣や、その他の生理学的に関連データ^21を生成するので、それにもかかわらず、一次電池またはオルガノイド培養は、形質転換細胞株よりも好ましい。ほとんどの大腸癌由来の細胞ラインはlackin、板に取り付け単層としてまたは細胞懸濁液のような成長頂端 - 基底外側向きと細胞間のタイトジャンクショ​​ンのgの。分化した細胞は、絨毛の先端に到達し^、22を流しているとしても、 生体内での正常および腫瘍腸上皮細胞はアポトーシスと呼ばれるアノイキスの自発的な形を受ける。これらの機能は、細胞株で要約することが困難であるが、大腸癌²³の発達過程において重要である。これらの機能は、プライマリオルガノイドに保持されます。また、腫瘍オルガノイド培養はin vivo試験に比べて遺伝子の腫瘍の自律機能を評価するための効率的なシステムを提供する。腸のin vivoでの遺伝子操作は、腸固有のドライバを使用したトランスジェニックおよび/ ​​またはノックアウトマウスの作成 ​​を通じ、主に時間のかかるプロセスです。しかし、腫瘍オルガノイドは容易にウイルス媒介遺伝子操作の影響を受けやすいので、正確な分子メカニズムを評価するための素晴らしいツールです。プライマリ腸腫瘍オルガノイド培養HAVeが可能と強力な手法であることが実証されて。プライマリ腸細胞培養は、単一の成体LGR5 +幹細胞²⁴からin vitroでの陰窩·絨毛構造を持つ機能的な腸オルガノイドを確立することができます。これらオルガノイドは、再生²⁵損傷結腸組織に移植し、移植することができます。培養条件のさらなる適応は、マウスとヒトの大腸小腸と¹実現可能な大腸から類似の上皮オルガノイドをしていた。基礎培地とEGFがプライマリマウス結腸腫瘍オルガノイド^1を成長させるために十分であるのに対し、一次正常な結腸上皮培養、基礎培地と同様にEGF、ノギン、R-スポンジンとWnt3aは含めて成長因子のために、必要不可欠である。ここでは、単離するための詳細なプロトコルを記述し、文化、および結腸腫瘍オルガノイドを生成します。

プロトコル

1。大腸腫瘍の単離と細胞解離

1. 腸の腫瘍は、任意の散発または治療によって誘発される大腸癌モデルから単離することができる。マウスはCO ₂で安楽死させなければならない。コロン次いで、冷リン酸緩衝食塩水（PBS）でフラッシュし、収集され、長手方向に開口している。実体顕微鏡を使用して腫瘍を含む領域を特定し、ハサミで出て解剖し、冷PBSで洗浄する。
2. EDTAキレート化緩衝液（2 mMのEDTA、5.6ミリモル/ LのNa ₂ HPO _4、8.0ミリモル/ L KH ₂ PO _4、96.2ミリモル/ LのNaCl、1.6ミリモル/ LのKCl、43.4ミリモル/ Lスクロース、内腫瘍を含む腸断片をインキュベート氷上で60分間、D-ソルビトール54.9ミリモル/ L、蒸留水で0.5ミリモル/ L DL-ジチオスレイトール）。
3. 腫瘍細胞が間葉に取り付けたままになりつつキレート化した後、正常な腸上皮細胞のほとんどは、切り離される。正常上皮細胞を含むキレート化バッファをオフに吸引5mlの冷たいキレート化バッファーで残留腫瘍断片をもう一度洗う。
4. キレート化バッファをオフに吸引、5ミリリットル冷たい1×PBSで腫瘍フラグメントを洗う。
5. 1×PBS、消化バッファー（2.5％ウシ胎児血清、ペニシリンの1単位/ ml、ストレプトマイシンを1μg/ mlであり、2.5 ngのアムホテリシンB、200 U / mlのIV型コラゲナーゼの/ mlでインキュベート腫瘍フラグメントをオフ吸引37℃で2時間125ダルベッコ改変イーグル培地でμgの/ mlのII型ディスパーゼ）℃、
6. 腫瘍フラグメントは1分間通常の重力下で落ち着く、と15ミリリットルファルコンチューブに上清を回収することができます。ペレット3分間200×gで遠心分離し、3分間200×gで遠心分離することによって5ミリリットルPBSで1回洗浄することにより、単一細胞腫瘍サスペンション上澄み。

2。腸腫瘍の文化

1. 500μlのPBSで腫瘍細胞ペレットを再懸濁し、血球計を用いて単離し、単一腫瘍細胞を数える。
2. セントによってペレット腫瘍細胞3分間200 xgでrifuging、およびウェルあたりマトリゲル50μlの当たり15,000細胞で24ウェルプレートに氷と皿の上に5 mg / mlのマトリゲルでそれらを再懸濁します。
3. マトリゲルは、37℃で15分間重合し、500よく基底/μlの培地（ペニシリン1単位/ ml、ストレプトマイシンを1μg/ mlの、および2.5 ngの/アムホテリシンB mlの、10ミリモル/ L HEPES追加してみましょう、2mMのグルタマックス、1X N2サプリメント、1X B27サプリメント、アドバンストダルベッコ改変イーグルMedium/F12 1ミリモル/ L N-アセチルシステイン）は50 ngの/ mlのマウスEGFを含む。

3。設立オルガノイドのメンテナンス

1. 週に一度、EGF 2日おきと通路オルガノイド1:5に含む基礎培地を変更します。
2. 継代のために、新鮮な基礎培地に培地を交換してください。機械的に遮断するヒントP1000ピペットを用いオルガノイドとマトリゲルを混乱させると15ミリリットルファルコンチューブに移す。さらに、機械的な解離は、火災磨かパスツールパイプを用いて達成されるって。
3. 2分間200 xgで基礎培地と遠心分離機5mlの解離オルガノイドを洗ってください。
4. 上清を捨て、マトリゲルでペレットを再懸濁し、上記のように培地を追加します。

4。ストレージと設立オルガノイドの回収

1. 長期保存の場合は、少なくとも2年間安定である液体N ₂中オルガノイドを凍結。凍結オルガノイドの場合、ヒントはカットオフと15ミリリットルファルコンチューブに移すとP1000ピペットを使用して混乱させる。
2. 2分間200 xgで基礎培地と遠心分離機5mlの解離オルガノイドを洗ってください。
3. 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でペレットを再懸濁し、上清を捨てる。
4. 1.5 mlのクライオチューブに転送細胞は、その後℃の冷凍庫で冷却速度を達成するために-80でナルゲンミスターフロスティ冷凍コンテナとストアにチューブを入れて-1の°C /分。一晩インキュベートした後、液体N ₂にチューブを移す。
5. 回復のために、冷凍オルガノイドは急速に、上記の条件をマトリゲルと文化の中で再懸濁し、スピンダウン、基礎培地で洗浄し、37℃の水浴中で解凍されています。

5。 RNA抽出、タンパク質抽出と免疫組織化学

1. RNA抽出：通路について上述したように細胞を収集する。 RNAは、製造業者の指示に従ってPicoPure ^TM RNAアイソレーションキットで分離されています。
2. タンパク質抽出：細胞ペレットを上記のように、100μlの放射線免疫アッセイ緩​​衝液（RIPAで溶解集められ、50ミリモル/ LのTris-HCl pH7.5で、150ミリモル/ LのNaCl、2ミリモル/ L EDTA、1％NP-40、0.1 1xのプロテアーゼ阻害剤％SDS）。
3. 免疫組織化学：細胞培養​​培地をオフに吸引し、クライオ金型にカットオフヒントをP1000ピペットで腫瘍オルガノイドを転送し、TISですぐに凍結ドライアイスで凍結培地（OCT）を訴える。凍結切片は7μmで ​​切断し、以前²⁶説明したように染色した。

結果

^{/ +}マウスは、 図1に示されている3ヶ月のApc ^分から結腸腫瘍オルガノイド形成の時間経過。 0日目に、単一細胞をプレーティング（ 図1A）に続く数時間を観察することができた。 1日目、で耐火核を有する上皮細胞を観察することができた結腸腫瘍を生き延びた。 3日目に、細胞の大きさは倍増した。 6日目、オルガノイドの大きさは10倍以上に?...

ディスカッション

このプロトコルで説明する実験手順は、プライマリマウス大腸腫瘍の単離および培養のためにできるようになります。プロトコルは博士Cleversグループ^1,24,27によって行わ精液の仕事から構成されている。我々は、腫瘍オルガノイドの良い収量を得るために消化時間とコラゲナーゼ濃度を最適化しました。重要なステップは、単一のセル、マトリゲル再懸濁、および選択培養への腫瘍細...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204