Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

Resumo

Um método simples para determinar murino organóide tumor de cólon primário é descrito. Este método utiliza o recurso de que as células tumorais de cólon sobreviver e crescer em Organóides em meios contendo fatores de crescimento limitadas, enquanto cólon normais do epitélio não.

Resumo

Várias linhas celulares de cancro de cólon humano e murino foram estabelecidas, a integridade fisiológica de tumores do cólon, tais como diversas camadas de células, de polaridade apical-basal, a capacidade de diferenciar e anoikis não são mantidos em linhas celulares derivadas do cancro do cólon. O presente estudo demonstra um método para a cultura primária Organóides tumorais de cólon de rato adaptados de Sato T et al. ^1, que mantém as características fisiológicas importantes de tumores do cólon. Este método consiste na recolha de tecido de tumor do cólon do rato, do epitélio do cólon normal adjacente dissociação, as células de tumor do cólon de digestão em células individuais, a incorporação de células tumorais de cólon em matrigel e cultura selectivo de acordo com o princípio de que as células tumorais manter o crescimento em condições limitantes de nutrientes em relação ao normal células epiteliais.

Os Organóides tumor primário se isolados de camundongos geneticamente modificados fornecer um sistema muito útil para avaliar Esta função autônoma tumorião de genes específicos. Além disso, os Organóides tumorais são passíveis de manipulação genética de vírus meditado entrega gene, portanto vias de sinalização envolvidas na carcinogênese do cólon também pode ser amplamente investigado pela superexpressão ou knockdown. Principal cultura Organóides tumor fornece um meio fisiológicas relevantes e viáveis ​​para estudar os mecanismos e modalidades terapêuticas para tumorigenesis cólon.

Introdução

As células epiteliais intestinais proliferar e virar a um ritmo extraordinário, superando todos os outros tecidos do corpo dos vertebrados ^2,3. As células que se dividem, incluindo as células-tronco intestinais (ISC) e células transit-amplificação diferenciar em qualquer secretora (taça, Paneth e enteroendócrinas) células ou enterócitos ^3. A ISC está localizado na base da cripta. Células Paneth mover para a parte inferior das criptas e são de longa duração, ao passo que outras linhagens migrar para cima, para as vilosidades ^3,4. Aqui, as células são expostas ao conteúdo, incluindo a microbiota intestinal e são eliminados a partir das pontas das vilosidades, através de um mecanismo de apoptose induzida por anoikis. Embora a falta de vilosidades do cólon e células de Paneth, o mecanismo para manutenção da homeostase é semelhante ^4.

A via de sinalização Wnt tem sido implicada em desempenhar um papel fundamental na proliferação intestinal e ISC manutenção ^4. Supressão do diae factor de transcrição TCF4, um efector a jusante de sinalização de Wnt, leva à perda de células estaminais intestinais e subsequente degradação do tecido ^5. Do mesmo modo, a expressão transgénica do DKK1 inibidor Wnt reduz a proliferação epitelial e esgota ⁶ linhagens de células secretoras. Por outro lado, a superexpressão do agonista R-spondin Wnt-1 induz a proliferação potente e rápida das células cripta intestinais ^7.

Dada a importância da via de sinalização Wnt para a homeostase intestinal, mutações via WNT são freqüentemente observadas no câncer de cólon ^8. O cancro do cólon é a terceira principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos ^9. Ingestão em excesso de carne vermelha e álcool, atividade física reduzida, e herdou e mutações somáticas são considerados fatores de risco de câncer de cólon ^10,11. O gene da polipose adenomatosa coli (APC), um factor de sinalização Wnt-chave, está mutado na maioria dos papacientes com DA familial, esporádico, e colite associada ao câncer de cólon ^12,13. Mutações de outros fatores envolvidos na via de sinalização Wnt incluindo Axin2 e β-catenina também são observados no câncer de cólon ^14,15. No entanto, o mecanismo preciso e tratamento eficaz para o câncer de cólon ainda estão faltando. Para facilitar a investigação sobre os mecanismos moleculares para o cancro do cólon, as linhas celulares de cancro de cólon humano que representam fases diferentes da progressão de um cancro benigno para um tipo de célula agressivo foram estabelecidas ^16-18. Rato linhagens celulares de carcinoma de cólon com diferentes propriedades metastáticas também estão disponíveis ^19,20. No entanto, as células primárias ou culturas organóide são preferidos sobre linhas de células transformadas, porque eles imitam de perto o estado em vivo e gerar mais fisiologicamente relevante de dados ^21. A maioria das linhas de cancro do cólon, células derivadas crescer como monocamadas ligado à placa ou como suspensões de células, lacking de orientação apical-basolateral e junções apertadas entre as células. Além disso, as células epiteliais intestinais normais e tumorais in vivo, sofrem de forma espontânea de apoptose anoikis denominado como as células diferenciadas atingir as pontas das vilosidades e ²² são eliminados. Estas características são difíceis de recapitular em linhas de células, mas são importantes no processo de desenvolvimento de cancro do cólon ^23. Estas características são mantidas em Organóides primários. Além disso, as culturas organóide tumor fornecem um sistema eficiente para avaliar as funções autónomas de genes tumorais em comparação com os estudos in vivo. A manipulação genética in vivo do intestino é um processo demorado, principalmente através da criação de transgênicos e / ou camundongos knockout usando drivers específicos de intestino. No entanto, os Organóides tumorais são facilmente passíveis de manipulações genéticas mediadas virais e, portanto, uma ótima ferramenta para avaliar mecanismos moleculares precisos. Primários intestinais culturas organoide tumorais have foi demonstrado ser uma técnica viável e poderosa. Cultura de células intestinal primária pode estabelecer Organóides intestinais funcionais, com estrutura da cripta-vilosidade in vitro a partir de um único adulto Lgr5 + células-tronco ^24. Estes Organóides podem ser transplantadas e enxertados no tecido do cólon danificado para a regeneração ^25. Além disso adaptação das condições de cultura fez Organóides epiteliais do cólon semelhantes rato e do intestino delgado e do cólon humano ¹ viável. Para a cultura primária de cólon normal, epitélio, meio de cultura basal, assim como fatores de crescimento, incluindo EGF, Noggin, R-spondin e Wnt3a são essenciais, enquanto meio de cultura basal e EGF é suficiente para o cultivo de rato cólon Organóides tumores primários ^1. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar, cultura e gerar Organóides tumor do cólon.

Protocolo

1. Colon isolamento do tumor e dissociação celular

1. Tumores intestinais podem ser isolados a partir de qualquer modelo de cancro do cólon ou esporádica induzida pelo tratamento. Os ratos devem ser sacrificados com CO _2. Dois pontos são então recolhidos, lavados com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e abertos longitudinalmente. Identificar as regiões que contêm tumores usando um microscópio estereoscópico, dissecar com um par de tesouras, e lave com água fria PBS.
2. Incubar fragmentos intestinais tumores em tampão contendo quelante EDTA (EDTA 2 mM, 5,6 mmol / L de Na ₂ HPO _4, 8,0 mmol / l _de KH ₂ PO _4, 96,2 mmol / L de NaCl, 1,6 mmol / L de KCl, 43,4 mmol / L de sacarose, 54,9 mmol / L de D-sorbitol, 0,5 mmol / L de DL-ditiotreitol em água destilada) durante 60 min em gelo.
3. Depois de quelação, a maior parte das células epiteliais intestinais normais serão separadas, enquanto que as células tumorais irão permanecer ligada ao mesênquima. Aspirar fora o tampão de quelação contendo células epiteliais normaise lavar o tumor remanescente fragmentos mais uma vez com 5 ml de tampão frio de quelação.
4. Aspirar fora do tampão de quelação, lave fragmentos do tumor com 5 ml frio 1x PBS.
5. Aspirar fora da 1x PBS, incubar fragmentos tumorais em tampão de digestão (2,5% de soro fetal bovino, 1 unidade / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina, e 2,5 ng / ml de anfotericina B, 200 U / mL de colagenase tipo IV, 125 ug / ml de tipo II dispase em Meio Eagle Modificado por Dulbecco) durante 2 horas a 37 ° C.
6. Permitir que o fragmento de tumor que se contentar com a gravidade normal para 1 min, e recolher o sobrenadante em um tubo falcon de 15 ml. Pellet a única célula do tumor suspensão sobrenadante por centrifugação a 200 xg durante 3 minutos e lavar uma vez com 5 ml de PBS por centrifugação a 200 xg durante 3 min.

2. Cultura de tumor intestinal

1. Ressuspender o sedimento de células tumorais com 500 mL PBS, contagem de células tumorais únicas isoladas usando um hemocitômetro.
2. Pellet células tumorais por centorifuging a 200 xg durante 3 minutos, e voltar a suspender-los em 5 mg / ml de Matrigel em gelo e a placa em placas de 24 poços a 15.000 células por 50 pi por poço de Matrigel.
3. Deixe o Matrigel polimerizar durante 15 minutos a 37 ° C e adicionar 500 uL / ​​poço de meio de cultura basal (1 unidade / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina, e 2,5 ng / ml de anfotericina B, 10 mmol / L de HEPES , Glutamax 2 mM, 1x suplemento N2, 1x suplemento de B27, 1 mmol / L de N-acetilcisteína em Avançado do Medium/F12 Eagle modificado por Dulbecco) que continha 50 ng / ml de EGF murino.

3. Manutenção de Organóides Fundada

1. Alterar meio de cultura basal contendo EGF a cada 2 dias e passagem Organóides 01:05 uma vez por semana.
2. Para passaging, substituir o meio de cultura com meio de cultura basal fresco. Mecanicamente perturbar Organóides e Matrigel usando uma pipeta P1000 com pontas cortadas e transferir para um tubo falcon de 15 ml. Além disso dissociação mecânica é conseguida usando um tubo de fogo Pasteur polidaTte.
3. Lavar Organóides dissociadas com 5 ml de meio de cultura basal e centrifugar a 200 xg durante 2 min.
4. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com Matrigel e adicionar meio de cultura, tal como descrito acima.

4. Armazenamento e Recuperação de Organóides Fundada

1. Para armazenamento a longo prazo, congelar Organóides em _N2 líquido, que são estáveis ​​durante pelo menos 2 anos. Para Organóides congelamento, romper com uma pipeta P1000 com as pontas cortadas e transferir para um tubo falcon de 15 ml.
2. Lavar Organóides dissociadas com 5 ml de meio de cultura basal e centrifugar a 200 xg durante 2 min.
3. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
4. Transferir as células em 1,5 ml criotubos, em seguida, colocar os tubos em um Mr. Frosty recipiente de congelamento Nalgene e armazenar em um freezer -80 ° C para atingir a taxa de resfriamentode -1 ° C / min. Após incubação durante a noite, para transferir os tubos _N2 líquido.
5. Para a recuperação, os Organóides congelados são rapidamente descongeladas em 37 ° C em banho-maria, lave com meio de cultura basal, girar, ressuspender em Matrigel e cultura, com as condições descritas acima.

5. Extração de RNA, extração de proteínas e imuno-histoquímica

1. Extracção de ARN: as células são colhidas como descrito acima para a passagem. O RNA é isolado com o PicoPure RNA Isolation Kit ^TM de acordo com as instruções do fabricante.
2. Extracção de Proteína: As pelotas de células são recolhidas como descrito acima e foram lisadas em 100 ul de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l de NaCl, 2 mmol / L de EDTA, 1% de NP-40, 0,1 % SDS), 1x com inibidor da protease.
3. Imunohistoquímica: Aspirar off meio de cultura celular, transferir Organóides tumorais com P1000 pipeta com as pontas cortadas em Cryo-mofo e congelar imediatamente em tisprocessar meio de congelamento (OCT) com gelo seco. Secções congeladas foram cortadas em 7 um e coradas como descrito previamente ^26.

Resultados

O curso de tempo da formação de um tumor do cólon organóide de um período de três meses de idade, Apc ^{min /} rato ⁺ é mostrada na Figura 1. No dia 0, as células individuais podem ser observadas várias horas após plaqueamento (Figura 1A). No dia 1, sobreviveu cólon células epiteliais tumorais com núcleos refratário pode ser observado. No dia 3, o tamanho das células duplicou. No dia 6, o tamanho da organóide expandida mais do que dez vezes, e...

Discussão

Os procedimentos experimentais descritos no presente protocolo irá permitir o isolamento e cultura de tumores do cólon de murino primários. O protocolo é uma adaptação do trabalho seminal realizado pelo Dr. grupo Clevers ^1,24,27. Nós otimizamos o tempo de digestão e da concentração de colagenase para obter um melhor rendimento de Organóides tumorais. As etapas críticas incluem a digestão tumor de células em células individuais, Matrigel ressuspensão e cultura seletiva. Para a digestão de cél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204