Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו בודקים את התוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. מכשירים הבוסס טלפון הסלולרי אלה מייקרו ניתוח עשויים להיות שימושיים לניתוח cytometric, כגון ביצוע משימות ספירת תאים שונות, כמו גם לתפוקה גבוהה הקרנה של דוגמה, דגימות מים בגדרות משאבים מוגבלות.

Abstract

מיקרוסקופיה פלורסנט וcytometry זרימה משמשות כלים נרחבים במחקר ביו ואבחון קליני. עם זאת מכשירים אלה באופן כללי יחסית מסורבלים ויקרים, מה שהופך אותם פחות יעיל בהגדרות המשאבים המוגבלות. פוטנציאלי כדי לטפל במגבלות אלה, אנו הוכחנו לאחרונה את השילוב של מיקרוסקופ שדה רחב ניאון וכלי cytometry זרימת הדמיה בתא טלפוני שימוש קל משקל קומפקטי, וקבצים מצורפים חסכוניים Opto-fluidic. בעיצוב cytometry הזרימה שלנו, תאים שכותרתו fluorescently סמוקים דרך ערוץ microfluidic שממוקם מעל יחידת המצלמה הקיימת בטלפון סלולרי. דיודות מופעלות סוללה פולט אור (LEDs) הן קת מצמידה לצד זה שבב microfluidic, אשר למעשה מתפקד כמוליך גל מצב מרובה לוח, שבו אור העירור מונחה אחיד כדי להלהיב את מטרות ניאון. המצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות של תאי הניאון זורמים דרךערוץ microfluidic, שם את המסגרות הדיגיטליות של הסרט הזה מעובדים כדי לספור את מספר התאים שכותרתו בתוך יעד הפתרון של עניין. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת תאים אלה שכותרתו fluorescently במצב סטטי על ידי רבדה למשל את חלקיקי הניאון בין שתי שקופיות זכוכית ולכידה התמונות שלהם הניאון באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי, שיכול להשיג רזולוציה מרחבית של דוגמה ~ 10 מיקרומטר מעל שדה של נוף גדול מאוד של ~ 81 מ"מ 2. טלפון נייד זה מבוסס cytometry זרימת הדמית ניאון ופלטפורמה מיקרוסקופית עשויה להיות שימושית במיוחד בהגדרות משאבים מוגבלות, למשל לספירה של CD4 + תאי T כלפי ניטור של HIV + חולים או לגילוי של טפילי מים שמקורן במי שתייה.

Introduction

מיקרוסקופיה וזרימת cytometry נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות 1-12 במחקר ביו ומדעי, כמו גם אבחון קליני לספירה ואפיון של סוגי תאים שונים. עם זאת, מיקרוסקופים קונבנציונליים ומכשירי הזרימה cytometry הם יחסית מורכבים ויקרים, אשר מגביל את השימוש בם למעבדות מרכזיות מבוססות היטב בעיקר. לאחרונה פתחנו cytometry קומפקטי וקל משקל ניאון הדמיה ומיקרוסקופיה מכשיר משולב בטלפון סלולרי, 13,14 אשר מראה הבטחה לחסכוני לתרגם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זרימת cytometry וטכניקות הקשורות לניתוח מייקרו לסביבות משאבים מוגבלים עבור טלרפואה יישומים שונים המשפיעים על בריאות העולמית.

בתצורת optofluidic הזרימה cytometry (ראה איור 1C למשל ו1D), polydimethysiloxane ערוץ אישית מעוצב-(PDMS) מבוסס microfluidic הוא positioneד בחזית תא טלפון מצלמת היחידה, בי-דיודות פולט אור (LEDs) הן הקת מצמידות לשולי הערוץ. שבב microfluidic זה, יחד עם הנוזל בתוך המדגם, מהווה מוליך גל מישורי Opto-fluidic (מורכב מלמשל PDMS הנוזלי-PDMS), כך שאור העירור מונחה אחיד לשאוב את הדגימות שכותרת הניאון בתוך ערוץ מייקרו. פליטת הקרינה מן האובייקטים שכותרתו אלו, תאים למשל, הוא צלם עוד יותר באמצעות עדשה נוספת הונחה מייד אחרי הטלפון סלולארי מצלמת היחידה והוא ממופה על תחמוצת מתכת-סמיקונדקטור חיישן משלימת הטלפון סלולרי (CMOS) תמונה. מאז פליטת הניאון נאספת בניצב לנתיב אור העירור, מסנן קליטת פלסטיק זול מספיק כדי להסיר את אור העירור המפוזר ויכול לספק רקע הגון כהה תחום נדרש הדמית ניאון. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת אובייקטי הניאון בstatic מצב (ראה איור 1A ו-1B), שבו חלקיקי הניאון הם דחוקים בין 2 כוס מחליק במקום זורם בתעלת microfluidic ופליטת חלקיקי ניאון ניאון מאלה שנתפסו על ידי חיישן CMOS הטלפון סלולארי תמונה לספירת חלקיקים ו אפיון. בהתבסס על דרישות שונות של יישומים, cytometry זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב ניתן לבחור. לדוגמה, מכשיר cytometry זרימת טלפון נייד יכול להיות שימושי במיוחד לסינון כמויות גדולות של דגימות נוזליות (למשל כמה מ"ל) לזיהוי של תאים או פתוגנים נדירים.

בכתב יד זה אנו סוקרים כמה מהתוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. ניתוח מייקרו אלה טלפון סלולרי מבוסס, cytometry ההדמיה ופלטפורמות חישה יכולים לספק הזדמנויות שונותלטלרפואה ונקודה של טיפול אבחון, במיוחד משפיע מאבקנו נגד אתגרי בריאות העולמיות באזורים מוגבלים משאבים של העולם.

Protocol

בסעיף זה, אנחנו מציגים את פרוטוקולי הניסוי למיקרוסקופיה טלפון נייד המבוססת השדה רחב פלואורסצנטי 13 ופלטפורמת cytometry Opto-fluidic הדמית 14. אנו נשתמש בחרוזי ניאון ותאי דם לבן שכותרתו fluorescently לבחון פלטפורמות הדמיה אלה.

הכנת א טלפון סלולרי מבוססת פלורסנט מיקרוסקופ שדה רחב וCytometer תזרים ההדמיה Opto-fluidic

מיקרוסקופ הטלפון סלולרי המבוסס השדה רחב פלורסנט או cytometer זרימה מורכבת משני חלקים עיקריים: טלפון מצלמה וOpto-fluidic הקומפקטי תוספת על קובץ מצורף.

1. טלפון המצלמה

בעוד שהטכניקות שהוצגו חלות על כמעט כל טלפון מצלמה, בחר סוני אריקסון Aino כבסיס למכשירים אלו. תא הטלפון הזה יש ~ חיישן 8 מגה פיקסל RGB CMOS ולהתקין עליו ומובנה בעדשה שיש אורך מוקד (ו 1) של ~ 4.65 מ"מ.

2. קובץ מצורף Opto-fluidic למיקרוסקופיה פלורסנט שדה רחב

הקובץ המצורף האופטי הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס במדפסת עלית 3-D ממד באמצעות חומר תרמופלסטי ABSplus. בתהליך הדפסה זה, חומרי מודל ותמיכה מחוממים בראש חול בתוך המדפסת ומופקדים שכבה אחרת שכבה על בסיס דוגמנות. כאשר שלב זה הושלם, חומר העזר ניתן להמס, עוזב מודל 3D חזק של אב הטיפוס הרצוי העיצוב המצורף האופטי שלנו מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, ועדשת f 2 Plano-קמורה מ"מ = 15 (# NT45-302, אדמונד אופטיקה). כל הנוריות ומסנני פלסטיק ניתן לשנות בקלות על בסיס הספקטרום של fluorophores. הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים:

  1. מניח את העדשה בקובץ המצורף בעמדת בעל העדשה הספציפית שלה.
  2. הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק מול עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  3. הכנס את מגש LED לקובץ המצורף.
  4. הנח את שקופיות זכוכית המדגם למגש המדגם. חלק את מגש המדגם לקובץ המצורף. להתמודד עם הנוריות כלפי המדגם.
  5. קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  6. השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות.
  7. תמונת מדגם עניינים עם יחידת המצלמה בטלפון סלולרי באמצעות "מצב הלילה" שלה.

3. קובץ מצורף Opto-fluidic לCytometry ההדמיה פלורסנט

כאשר יש צורך להקרין כמויות גדולות של דגימות נוזליות לצורך זיהוי של אירועים נדירים, מכשיר cytometry זרימת optofluidic יכול להיות עדיף. אנחנו יכולים לשנות את עיצוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב שלנו ולהפוך אותו לcytometer זרימה, Wכאן ערוץ microfluidic מבוסס PDMS משמש כדי לספק דגימת נוזל הרף דרך נפח ההדמיה. קובץ המצורף האופטי גם הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס על ידי מדפסת ממד 3 D-עלית. הוא גם מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, וaspherical עדשה (F = 4.5 מ"מ) (מוצר # C230TME-; Thorlab). הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים:

  1. הנח Aspherical העדשה לקובץ המצורף.
  2. הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק בחזית עדשת המצלמה של הטלפון הסלולרית.
  3. חלק את ערוץ microfluidic לאותו הקובץ מצורף Opto-fluidic.
  4. קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שהעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  5. השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות.
  6. חבר microfluidic ערוץ למשאבת המזרק ולספק דגימת הנוזל לתוך מכשיר microfluidic בקצב זרימה קבועה.
  7. צלם סרט של תאים / חלקיקים זורמים דרך ערוץ microfluidic שימוש במצב הווידאו של המצלמה בטלפון סלולארי הניאון.

לדוגמא הכנת B.

4. הכנת דוגמאות פלורסנט מייקר חלקיקים

  1. חרוזי ניאון עם קוטר 10 מיקרומטר (חרוזים אדומים: מוצר # F8834 עירור / פליטת 580nm/605nm; חרוזים ירוקים: מוצר # F8836: עירור / פליטת 505nm/515nm) נרכשים מInvitrogen (קרלסבד, קליפורניה).
  2. מערבב 10 μl של חרוזי ניאון ירוקים, 10 μl של חרוזי ניאון אדומים עם 40 μl מי DI.
  3. Place10 μl של תערובת חרוז זה בשקופית זכוכית באמצעות micropipette ולשים שקופית כוס נוספת בחלק העליון שלו כדי להפוך את מבנה כריך.
  4. הכנס מבנה הכריך הזה למגש המדגם וחלק אותו לקובץ המצורף בטלפון נייד.

5. הכנה של תאי דם לבן שכותרתו fluorescently

  1. קח חומצה SYTO16 תיוג ערכת גרעין ניאון (# S7578, טכנולוגית חיים) ונאגר מלוחים פוספט (PBS) יצא מהמקרר ולהביא אותם לטמפרטורת חדר.
  2. העברת דגימת דם כל μl 200 מצינור איסוף דם EDTA לצינור פוליסטירן מ"ל 1.5 (# 05-408-129, הפישר סיינטיפיק).
  3. הוסף 1 מיליליטר חיץ תאי דם אדום lysing (# R7757, סיגמה אולדריץ) למדגם 200 μl כל הדם והמערבב היטב.
  4. לאחר 5 דקות, סרכזת דגימת דם lysed ולהסיר את פתרון supernatant.
  5. Resuspend תאי הדם הלבנה הגלולה לחיץ PBS 200 μl ועדינות לערבב אותם.
  6. הוסף SYTO16 פתרון 5 μl 1 מ"מ לדגימת תאי הדם הלבנה. עטוף את המדגם ברדיד אלומיניום ולדגור בסביבה חשוכה ל~ 30 דקות.
  7. צנטריפוגה המדגם שוב. Supernatant מוסר ומתויג תא הכדורי דם הלבן מחדשמושעה לחיץ PBS.
  8. הנח μl 5-10 כותרת דגימת נוזל תא דם לבנה כדי להחליק כיסוי, והנח את תלוש עטיפה שנייה בחלק העליון של המדגם.
  9. הכנס את שקופית המדגם דחוק למגש המדגם ותדמיתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הטלפון סלולרי.

לחלופין

  1. רף לספק את תאי דם הלבן שכותרתו fluorescently דרך ערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק אוטומטית, גם בעת הקלטת סרט מיקרוסקופי ניאון של תאים זורמים באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי במצב וידאו. אנחנו צריכים גם להדגיש כי משאבה ניידת מופעלת סוללת מזרק או אפילו כוח המשיכה יכולה להיות מנוצלת כדי להסיע את הזרימה דרך ערוץ microfluidic.

תוצאות

עם שאיבת Opto-fluidic / ערכה (1C 1D ותרשימים) עירור שלנו, תאים שכותרתו fluorescently יכולים להיות מועברים באופן רציף לערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק בזמן שהמצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות ניאון מיקרוסקופי של התאים זורמים. סרטי ניאון אלה לאחר מכן ניתן לנתח במהירות ב...

Discussion

יש לנו הצגנו התוצאות האחרונות שלנו בטלפון סלולרי המבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב וזרימת cytometry הדמית Opto-fluidic שימוש קל משקל וקומפקטיים לצרף קבצי Opto-fluidic למצלמות טלפונים סלולריים. שימוש בפלטפורמה טכנולוגית זו אנו צלמנו אובייקטי ניאון לרבות חלקיקי מייקרו ותאי דם ל?...

Disclosures

ד"ר Ozcan הוא המייסד של חברת סטארט אפ שמטרה למסחר את ההדמיה ממוחשבת וכלים מיקרוסקופים.

Acknowledgements

א Ozcan תודה מכיר את התמיכה בפרס לנשיאות קריירה המוקדם עבור מדענים ומהנדסים (PECASE), של משרד לחקר צבא (נרו) בפרס חוקר צעיר, הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס קריירה, משרד מחקר של צי (ONR) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס במאי החדש ממציא DP2OD006427 ממשרדו של המנהל, המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name CompanyCatalog Number Comments
Cell-phoneSonySony Ericsson Aino 
Plano-convex lensEdmund Optics# NT45-302 
Aspherical lensThorlab# C230TME-A 
FilterEdmund Optics#NT54-46 
Blue LEDDigikey#365-1201-ND 
BatteryDigikey#P032-ND 
Polystyrene tubeFisher Scientific#05-408-129 
Red blood cell lysing bufferSigma AldrichR7757 
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KITDow Corning  
Red fluorescent beads (10 μm)Life Technologies#F8834 
Green fluorescent beads (10 μm)Life Technologies#F8836 
SYTO16 nucleic acid fluorescent labelingLife Technologies# S7578 

References

  1. Sklar, L. A. . Flow Cytometry for BioTechnology. , (2005).
  2. Nunez, R. . Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , (2001).
  3. Mertz, J. . Introduction to optical microscopy. , (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
  6. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
  7. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
  11. Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
  12. Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -. W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
  13. Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -. W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
  14. Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
  15. Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
  16. Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
  17. Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
  18. Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering74cytometryTELE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved