Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

Riepilogo

Esaminiamo i nostri risultati recenti sull'integrazione di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su un telefono cellulare utilizzando compatte e convenienti opto-fluidici allegati. Questi cellulare basato micro-dispositivi di analisi può essere utile per l'analisi citometrica, ad esempio per eseguire operazioni di conteggio cellulari diversi e per high throughput screening di campioni di acqua, ad esempio in impostazioni delle risorse limitate.

Abstract

Microscopia a fluorescenza e citometria a flusso sono ampiamente utilizzati strumenti nella ricerca biomedica e diagnosi clinica. Tuttavia questi dispositivi sono in generale relativamente ingombranti e costosi, rendendoli meno efficaci nelle impostazioni delle risorse limitate. Per far fronte a queste limitazioni potenzialmente, abbiamo recentemente dimostrato l'integrazione di ampio campo di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su telefoni cellulari utilizzando compatto, leggero, e costo-efficacia opto-fluidici allegati. Nel nostro disegno citometria di flusso, le cellule sono contrassegnati in modo fluorescente lavata attraverso un canale microfluidico che è posizionata sopra l'esistente cellulare telecamera. Alimentati a batteria diodi emettitori di luce (LED) sono di testa accoppiata al lato di questo chip microfluidica, che agisce efficacemente come una guida d'onda multimodale lastra, dove viene guidato la luce di eccitazione per eccitare uniformemente gli obiettivi fluorescenti. Il telefono cellulare fotocamera registra un film lasso di tempo di cellule fluorescenti fluisce attraversoil canale microfluidico, dove vengono elaborate le cornici digitali di questo film per contare il numero di cellule marcate nella soluzione bersaglio di interesse. Utilizzando un simile opto-fluidico disegno, possiamo anche un'immagine queste cellule contrassegnati in modo fluorescente in modalità statica es intramezzando particelle fluorescenti tra due vetrini e catturare le loro immagini fluorescenti utilizzando il telefono cellulare fotocamera, che possono raggiungere una risoluzione spaziale di esempio ~ 10 micron su un grande campo di vista di ~ 81 mm ^2. Questo telefono cellulare basato fluorescente citofluorimetria imaging e microscopia piattaforma potrebbe essere utile specialmente in impostazioni di risorse limitate, per esempio il conteggio delle cellule T CD4 + verso il monitoraggio dei pazienti HIV + o per il rilevamento di acqua da parassiti nell'acqua potabile.

Introduzione

Microscopia e citometria a flusso sono ampiamente utilizzate tecniche di ^1-12 nella ricerca biomedica e scientifica, nonché la diagnosi clinica per il conteggio e la caratterizzazione di vari tipi di cellule. Tuttavia, microscopi convenzionali e flusso-citometria strumenti sono relativamente complesse e costose, che limita il loro uso principalmente alla laboratori centrali consolidate. Recentemente abbiamo sviluppato un citometria compatto e leggero dispositivo di imaging a fluorescenza e microscopia integrato su un telefono cellulare, che mostra la promessa ^13,14 a costi contenuti tradurre microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e le relative micro tecniche di analisi di ambienti con risorse limitate per applicazioni di telemedicina vari settori: la salute globale.

Nel optofluidic citometria a flusso di configurazione (vedere ad esempio la Figura 1C e 1D), una custom-designed polydimethysiloxane (PDMS) canale in base microfluidica è positioned davanti al telefono cellulare fotocamera-unità, dove emettitori di luce a diodi (LED) sono accoppiate di testa ai bordi del canale. Questo chip microfluidica, unito all'interno campione liquido, forma un opto-fluidico guida d'onda planare (composto ad esempio PDMS-liquido-PDMS) tale che la luce di eccitazione è guidata per pompare uniformemente i campioni etichettati fluorescenti all'interno del micro-canali. L'emissione di fluorescenza da questi oggetti etichettati, ad esempio, le cellule, è ulteriormente ripreso attraverso una lente aggiuntiva collocata subito dopo il telefono cellulare fotocamera unità ed è mappato sul cellulare Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) sensore di immagine. Poiché l'emissione fluorescente viene raccolto perpendicolare al percorso di luce di eccitazione, un filtro di assorbimento di plastica poco costoso è sufficiente rimuovere la luce diffusa di eccitazione e può fornire un discreto campo scuro sfondo necessaria per l'imaging fluorescente. Utilizzando un simile opto-fluidico disegno, possiamo anche l'immagine degli oggetti fluorescenti in static modalità (vedi figura 1A e 1B), in cui sono le particelle fluorescenti sandwich tra due vetrini invece di fluire attraverso un canale microfluidico e l'emissione fluorescente da queste particelle fluorescenti vengono catturati dal telefono cellulare sensore di immagine CMOS per conteggio di particelle e caratterizzazione. Sulla base delle diverse esigenze applicative, citometria a flusso o grande campo di microscopia a fluorescenza possono essere scelti. Per esempio, cellulare dispositivo citometria di flusso potrebbe essere particolarmente utile per lo screening di grandi volumi di campioni liquidi (ad esempio alcuni ml) per la rilevazione di cellule rare o patogeni.

In questo manoscritto passiamo in rassegna alcuni dei nostri recenti risultati sull'integrazione di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su un telefono cellulare utilizzando compatte e convenienti opto-fluidici allegati. Questi cellulare a base di micro-analisi, citometria di imaging e le piattaforme di rilevamento in grado di fornire diverse opportunitàper la diagnostica di telemedicina e point-of-care, in particolare impatto la nostra lotta contro le sfide della salute globale nelle regioni delle risorse limitate del mondo.

Protocollo

In questa sezione, si introducono i protocolli sperimentali per il nostro cellulare in base a grande campo microscopia a fluorescenza ¹³ e opto-fluidici piattaforma di citometria di imaging ^14. Useremo perline fluorescenti e contrassegnati in modo fluorescente le cellule bianche del sangue per testare queste piattaforme di imaging.

A. Preparazione del telefono cellulare Basato Wide-field microscopio a fluorescenza e Opto-fluidico citometro a flusso Imaging

Il telefono cellulare in base a grande campo microscopio a fluorescenza o citometria a flusso è costituito da due parti principali: un telefono con fotocamera e un compatto opto-fluidico aggiuntivo allegato.

1. La fotocamera del telefono

Mentre le tecniche presentate sono applicabili a qualsiasi telefono cellulare con fotocamera, abbiamo scelto Sony Erickson Aino come base per questi dispositivi. Questo cellulare ha un ~ 8 MegaPixel RGB sensore CMOS installato su di esso e un obiettivo incorporato che ha una lunghezza focale (f 1) di ~ 4,65 millimetri.

2. Opto-fluidico Attachment per Wide-field microscopia a fluorescenza

L'allegato ottico è stato progettato da Autodesk ed è stampato da un Elite Dimension stampante 3-D con materiale termoplastico ABSplus. In questo processo di stampa, materiali modello e il supporto vengono riscaldati in una testa di estrusione all'interno della stampante e si depositano a strati su una base di modellazione. Quando questo passaggio è completato, il materiale di supporto può essere dissolto, lasciando un solido modello 3D del prototipo desiderato nostro disegno allegato ottico composto da LEDs (centro lunghezza d'onda a 470 nm ~, Digikey), un filtro di plastica (# NT54-46, Edmund ottiche), un vassoio campioni, e una lente piano-convessa f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Tutti i led e filtri di plastica può essere facilmente modificato in base spettri dei fluorofori. I passaggi per assemblare questo opto-fluidico allegato comprendono:

1. Posizionare la lente nell'attacco Nella sua posizione specifica porta-lente.
2. Posizionare il filtro in plastica sul vassoio filtro e farlo scorrere in l'attacco, o nastro adesivo il filtro in plastica di fronte al telefono cellulare fotocamera.
3. Inserire il vassoio LED in allegato.
4. Porre i vetrini campione di vetro nel cassetto campione. Far scorrere il vassoio dei campioni in attacco. Affronta i LED verso il campione.
5. Agganciare l'attacco sul telefono cellulare, in modo tale che la lente in più è direttamente in contatto con il telefono cellulare fotocamera.
6. Utilizzare l'interruttore per il sequestro conservativo per accendere il LED.
7. Immagine il campione di interesse con il telefono cellulare telecamera usando la sua "modalità notturna".

3. Opto-fluidico di collegamento per Citometria Imaging fluorescente

Quando vi è la necessità di schermare grandi volumi di campioni liquidi per la rilevazione di eventi rari, optofluidic dispositivo di citometria di flusso potrebbe essere preferito. Siamo in grado di modificare il nostro ampio settore del design microscopio a fluorescenza e di convertirlo in un citofluorimetro, wqui una base PDMS canale microfluidico vengono usati per fornire continuamente il campione di liquido attraverso il volume di imaging. Il collegamento ottico è progettato anche da Autodesk e stampato da Dimension Elite stampante 3-D. Si compone anche di LED (lunghezza d'onda centrale a ~ 470 nm, Digikey), un filtro in plastica (# NT54-46, Edmund Optics), un vassoio di campione e una lente asferica (f = 4.5 mm) (prodotto # C230TME-A; Thorlab). I passaggi per assemblare questo opto-fluidico allegato comprendono:

1. Posizionare la lente asferica in allegato.
2. Posizionare il filtro in plastica sul vassoio filtro e farlo scorrere in l'attacco, o nastro adesivo il filtro in plastica di fronte alla lente della fotocamera del cellulare.
3. Far scorrere il canale microfluidica nello stesso opto-fluidico attacco.
4. Agganciare l'attacco sul telefono cellulare in modo tale che la lente in più è direttamente in contatto con il telefono cellulare fotocamera.
5. Utilizzare l'interruttore per il sequestro conservativo per accendere il LED.
6. Collegare il microfluidic canale per la pompa a siringa e consegnare il campione di liquido nel dispositivo microfluidico ad una portata costante.
7. Cattura un filmato delle cellule fluorescenti / particelle che attraversano il canale microfluidica utilizzando la modalità video del telefono cellulare fotocamera.

B. Preparazione del campione

4. Preparazione di Micro-particelle fluorescenti Campioni

1. Perline fluorescenti con diametro di 10 micron (perline rosse: prodotto # F8834 eccitazione / emissione 580nm/605nm, perline verdi: prodotti # F8836: eccitazione / emissione 505nm/515nm) vengono acquistati da Invitrogen (Carlsbad, CA).
2. Miscelare 10 ml di perline verdi fluorescenti, 10 microlitri di rosso perline fluorescenti con 40 ml di acqua deionizzata.
3. Place10 pl di questa miscela tallone su un vetrino utilizzando una micropipetta e mettere un altro vetrino sulla parte superiore di esso per realizzare una struttura a sandwich.
4. Inserisci questa struttura a sandwich nel cassetto campione e farla scorrere nel telefono cellulare attaccamento.

5. Preparazione del marcato in modo fluorescente globuli bianchi

1. Prendere SYTO16 acido nucleico fluorescente etichettatura kit (# S7578, Life Technology) e tampone fosfato salino (PBS) fuori dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente.
2. Trasferire 200 microlitri campione di sangue intero da provetta di raccolta del sangue con EDTA a 1,5 ml tubetto polistirolo (# 05-408-129, Fisher Scientific).
3. Aggiungere 1 ml di tampone di globuli rossi lisante (# R7757, Sigma-Aldrich) per il campione di 200 pl di sangue intero e mescolare accuratamente.
4. Dopo 5 min, centrifugare il campione lisato sangue e rimuovere la soluzione surnatante.
5. Risospendere il pellet di cellule bianche del sangue in 200 microlitri di buffer PBS e mescolare delicatamente.
6. Aggiungere 5 l 1 mM SYTO16 soluzione del campione di globuli bianchi. Avvolgere il campione con un foglio di alluminio e incubare in ambiente buio per ~ 30 min.
7. Centrifugare il campione di nuovo. Surnatante viene rimosso e l'etichetta bianca del sangue pellet cellulare è ri-Sospese in PBS.
8. Microlitri 5-10 etichettato bianco cella campione sangue liquido ad un vetrino, e posizionare un foglio secondo coperchio sulla parte superiore del campione.
9. Inserire la diapositiva campione inserita nel vassoio di campione e l'immagine utilizzando il telefono cellulare microscopio a fluorescenza.

In alternativa

10. Continuamente consegnare le cellule bianche del sangue fluorescente etichettati attraverso un canale microfluidica utilizzando una pompa siringa automatica, ma anche di acquisizione di un filmato fluorescente microscopica delle cellule che scorrono con il telefono cellulare fotocamera in modalità video. È necessario inoltre sottolineare che una pompa a siringa portatile alimentato a batteria o anche forza di gravità può essere utilizzato per guidare il flusso attraverso il canale microfluidico.

Risultati

Con il nostro opto-fluidico di pompaggio / eccitazione schema (figure 1C e 1D), le cellule marcate fluorescente può essere continuamente consegnato nel canale microfluidica utilizzando una pompa a siringa, mentre il telefono cellulare fotocamera registra una time-lapse film fluorescente microscopica delle cellule che scorre. Questi film fluorescenti possono essere rapidamente analizzati utilizzando contorno rilevamento e algoritmi di monitoraggio ^14,15 per determinare automa...

Discussione

Abbiamo presentato i nostri risultati recenti sul telefono cellulare basato ampio campo microscopia a fluorescenza e opto-fluidici citometria a flusso di immagini utilizzando leggeri e compatti opto-fluidici allegati a telefoni cellulari fotocamere. Grazie a questa tecnologia piattaforma abbiamo ripreso oggetti fluorescenti incluse micro-particelle ed etichettati globuli bianchi in campioni di sangue intero. Pertanto, questo compatto ed economico cellulare set di strumenti basati imaging a fluorescenza può essere utile...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell-phone	Sony	Sony Ericsson Aino
Plano-convex lens	Edmund Optics	# NT45-302
Aspherical lens	Thorlab	# C230TME-A
Filter	Edmund Optics	#NT54-46
Blue LED	Digikey	#365-1201-ND
Battery	Digikey	#P032-ND
Polystyrene tube	Fisher Scientific	#05-408-129
Red blood cell lysing buffer	Sigma Aldrich	R7757
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Red fluorescent beads (10 μm)	Life Technologies	#F8834
Green fluorescent beads (10 μm)	Life Technologies	#F8836
SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling	Life Technologies	# S7578