Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz kompakt ve maliyet-etkin opto-akışkan ekleri kullanarak bir cep telefonu üzerinde floresan mikroskop ve görüntüleme flow sitometri araçlarının entegrasyonu bizim son sonuçlarını gözden geçirin. Bu cep telefonu tabanlı mikro-analiz cihazları gibi kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda, örneğin su örneklerinin yüksek verimli tarama yanı sıra çeşitli hücre sayım görevleri yapmak gibi, sitometrik analizi için yararlı olabilir.

Özet

Floresan mikroskobu ve akım sitometri yaygın biyomedikal araştırmalar ve klinik tanıda kullanılan araçlardır. Ancak bu cihazlar kısıtlı kaynak ayarlarında onları daha az etkin hale getirilmesi, genel olarak nispeten hantal ve pahalı. Potansiyel olarak bu sınırlamaları gidermek için, son zamanlarda kompakt, hafif ve uygun maliyetli opto-akışkan ekleri kullanarak cep telefonları geniş alan floresan mikroskop ve görüntüleme flow sitometri araçlarının entegrasyonu göstermiştir. Bizim flow sitometri tasarımı, floresan etiketli hücreleri mevcut cep telefonu kamera ünitesi yukarıda konumlandırılmış bir mikroakışkan kanal boşaltıldı. Akü ile çalışan ışık yayan diyot (LED) etkin uyarma ışık eşit floresan hedefleri heyecanlandırmak için yönlendirilir bir multi-mode levha dalga olarak görür bu mikroakışkan çip, tarafına popo-birleştiğinde vardır. Cep telefonu kamera akan floresan hücrelerinin zaman atlamalı film kaydederBu filmin dijital çerçeveleri ilgi hedef çözüm içinde etiketli hücreleri saymak için işlenir mikroakışkan kanal. Biz bu floresan etiketli hücreleri örneğin iki cam slaytlar arasındaki floresan parçacıkların sandviç ve örneğin bir uzaysal çözünürlüğü elde edebilirsiniz cep telefonu kamera kullanarak floresan görüntüler yakalayarak statik modda görüntü de, benzer bir opto-akışkan tasarımı kullanarak, ~ ~ 81 mm 2 çok geniş bir görüş alanı görüntüsü üzerine 10 mikron. Bu cep telefonu floresan görüntüleme akım sitometri dayanır ve mikroskopi platformu CD4 + HIV + hastalarda izlenmesi doğru veya içme suyu su-kaynaklı parazitler tespit için T hücrelerinin sayımı örn, özellikle kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda yararlı olabilir.

Giriş

Mikroskopi ve akım sitometri yaygın biyomedikal ve bilimsel araştırma teknikleri 1-12 yanı sıra çeşitli hücre tipleri sayımı ve karakterizasyonu için klinik tanı kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel mikroskop ve akım sitometri enstrümanlar yoğunlukla köklü merkez laboratuarlar kullanımlarını kısıtlar, hangi nispeten karmaşık ve pahalıdır. Son zamanlarda biz ümit vaat hangi bir cep telefonu, 13,14 entegre kompakt ve hafif bir floresan görüntüleme sitometri ve mikroskopi cihazı geliştirdik maliyet-etkin için kaynak kısıtlı ortamlar için floresan mikroskobu, akım sitometri ve ilgili mikro-analiz teknikleri çevirmek küresel sağlık etkileyen çeşitli teletıp uygulamaları.

Optofluidic akım sitometri yapılandırmada (örn. Şekil 1C ve 1D bakın), özel tasarlanmış polydimethysiloxane (PDMS) tabanlı mikroakışkan kanal bir pozisyonda olduğunuışık yayan diyot (LED) kanalın kenarlarına popo-birleştiğinde cep telefonu kamera ünitesi önünde d. Bu mikroakışkan çip birlikte, sıvı numune içinde birlikte uyarma ışığı eşit mikro kanal içinde flüoresan etiketli örnekler pompalamak için yönlendirilir, bu gibi bir opto-akışkan düzlemsel dalga kılavuzu (örneğin PDMS-sıvı-PDMS için oluşan) oluşturur. Bu etiketli nesneleri floresans emisyon, örneğin hücreler, daha cep telefonu kamera ünitesi hemen sonra yerleştirilen ek bir lens aracılığıyla görüntülü ve cep telefonu Tamamlayıcı Metal-Oksit-Yarıiletken (CMOS) görüntü sensörünün üzerine eşleştirilir. Floresan emisyon uyarma ışık yoluna dik toplanan bu yana, ucuz bir plastik emme filtresi dağınık uyarma ışığa çıkarmak için yeterli olduğunu ve floresan görüntüleme için gerekli iyi bir karanlık alan arkaplan sağlayabilir. Bu görüntü, stat floresan nesneleri aynı zamanda, benzer bir opto-akışkan dizayn kullanarak,floresan parçacıkların iki cam arasına sıkıştırılmıştır hangi ic mod (Şekil 1A ve 1B), cep telefonu CMOS görüntü partikül sayımı için sensör ve tarafından yakalanan yerine bu floresan parçacıkların bir mikroakışkan kanal ve floresan emisyon yoluyla akan slaytlar karakterizasyonu. Farklı uygulama gereksinimleri, flow sitometri veya geniş alan floresan mikroskop İstinaden seçilebilir. Örneğin, cep telefonu akım sitometri cihazı nadir hücre veya patojenlerin tespiti için sıvı örnekler (birkaç mL gibi) büyük hacimli tarama için özellikle yararlı olabilir.

Bu yazıda kompakt ve maliyet-etkin opto-akışkan ekleri kullanarak bir cep telefonu üzerinde floresan mikroskop ve görüntüleme flow sitometri araçlarının entegrasyonu bizim son bazı sonuçları gözden geçirin. Bu cep telefonu tabanlı mikro-analiz, görüntüleme sitometri ve algılama platformları çeşitli fırsatlar sağlayabilirTeletıp ve nokta-of-bakım teşhis için, özellikle dünyanın kısıtlı kaynak bölgelerinde küresel sağlık sorunları karşı mücadeleyi etkileyen.

Protokol

Bu bölümde, bizim cep telefonu tabanlı geniş alan floresan mikroskobu 13 ve opto-akışkan görüntüleme sitometri platformu 14 deneysel protokolleri tanıtmak. Biz bu görüntüleme platformlar sınamak için floresan boncuk ve floresan etiketli beyaz kan hücreleri kullanır.

Cep telefonu A. Hazırlık Geniş alan Floresan Mikroskop ve Opto-akışkan Görüntüleme Akış Sitometresi sonucu

Bir kameralı cep telefonu ve eklenti eklemek-kompakt bir opto-akışkan: cep telefonu tabanlı geniş alan floresan mikroskop ya flowsitometri iki ana bölümden oluşmaktadır.

1. Kameralı Telefon

Sunulan tekniklerin hemen hemen her cep telefonu için geçerli olsa da, biz bu cihazlar için üs olarak Sony Erickson Aino seçtiniz. Bu cep telefonu üzerinde yüklü bir ~ 8 MegaPiksel RGB CMOS sensör ve bir odak uzaklığı (f 1) ~ 4.65 mm olan yerleşik bir objektife sahip.

2. Geniş alan Floresan Mikroskopi için Opto-akışkan Eklenti

Optik eki Autodesk tarafından tasarlanmış ve ABSplus termoplastik malzeme kullanılarak 3 boyutlu yazıcı bir boyut Elite tarafından yazdırılır. Bu baskı süreci, model ve destek malzemeleri yazıcının içinde bir ekstrüzyon kafası ısıtılır ve bir modelleme kaide üzerinde tabaka tabaka yatırılır. Bu adım tamamlandıktan sonra, destek malzemesi, bizim optik bağlanma dizayn LED (~ 470 nm 'de orta dalga boyu, Digikey), plastik bir filtre (# NT54-46, Edmund oluşan arzu edilen prototipin bir sağlam bir 3D modeli bırakarak, çözülebilir Optik), örnek bir tepsi ve bir yüzü düz diğeri dışbükey mercek f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optik). Tüm LED'ler ve plastik filtreler kolayca floroforlar 'spektrumları dayalı değiştirilebilir. Bu opto-akışkan eki montajı için adımlar şunlardır:

  1. Kendine özgü lens kabı içindeki pozisyonlarını eki içine mercek yerleştirin.
  2. Filtre tepsisine plastik filtre yerleştirin ve eki içine kaydırın veya bant cep telefonu kamera lensi önündeki plastik filtre.
  3. Eki içine LED tepsiyi takın.
  4. Örnek tepsisine örnek cam slaytlar yerleştirin. Eki içine numune tepsisini kaydırın. Örnek doğru LED'ler Yüz.
  5. Fazladan bir objektifin doğrudan cep telefonu kamera merceği ile temas halinde olduğu gibi, cep telefonu üzerine eki klipsleyin.
  6. LED'lerini açmak için eki üzerindeki düğmeyi kullanın.
  7. Onun "gece modu" kullanılarak cep telefonu kamera ünitesi ile ilgi resmi örnek.

3. Floresan Görüntüleme Cytometry Opto-akışkan Eklenti

Nadir olayların tespiti için sıvı örnekler büyük miktarlarda taranması için bir ihtiyaç olduğu zaman, optofluidic akış sitometri cihazı tercih edilebilmektedir. Biz geniş alan floresan mikroskop tasarımını değiştirmek ve bir akış sitometresinin, w haline dönüştürebilirsinizburada bir PDMS tabanlı mikro kanal sürekli olarak görüntüleme hacmi içinden geçerek sıvı örnek vermek için kullanılır. Optik eki ayrıca Autodesk tarafından tasarlanan ve Dimension tarafından Elite 3-D yazıcı yazdırılır. Ayrıca LED (~ 470 nm merkezi dalgaboyu, Digikey), bir plastik filtre (# NT54-46, Edmund Optik), örnek bir tepsi ve bir asferik lens (f = 4,5 mm) (Ürün # C230TME-A oluşur; Thorlab). Bu opto-akışkan eki montajı için adımlar şunlardır:

  1. Ek parçaya asferik mercek yerleştirin.
  2. Filtre tepsisine plastik filtre yerleştirin ve eki oturtun; veya bant cep telefonu kamera objektifi önünde plastik filtre.
  3. Aynı opto-akışkan ek parçaya mikroakışkan kanal kaydırın.
  4. Fazladan bir objektifin doğrudan cep telefonu kamera merceği ile temas halinde olduğu gibi cep telefonu üzerine eki klipsleyin.
  5. LED'lerini açmak için eki üzerindeki düğmeyi kullanın.
  6. Mikroakışkanlar bağlayınic şırınga pompası kanal ve sabit bir akış hızında mikroakışkan cihazın içine sıvı numune teslim.
  7. Floresan hücre / cep telefonu kamera video modu kullanarak mikroakışkan kanal akan parçacıkların bir film çekin.

B. Numune Hazırlama

4. Floresan Mikro-parçacık Örneklerinin Hazırlanması

  1. 10 mikron çapı (: Ürün # F8834 uyarma / 580nm/605nm emisyon, yeşil boncuk: kırmızı boncuklar Ürün # F8836: uyarma / emisyon 505nm/515nm) ile Floresan boncuk Invitrogen (Carlsbad, CA) satın alınır.
  2. Yeşil floresan boncuklar, distile su, 40 ul ile kırmızı flöresanlı boncuklar 10 ul 10 ul karıştırılır.
  3. Bir mikropipet ve bir sandviç yapı oluşturabilmek için bunun üstüne başka bir cam slayt koymak kullanarak bir cam slayt üzerine bu boncuk karışımın Place10 ul.
  4. Örnek tepsisine Bu sandviç yapı takın ve cep telefonu eki içine kaydırın.

5. Floresan etiketli Akyuvarlar hazırlanması

  1. SYTO16 nükleik asit fluoresan etiketleme kiti (# S7578, Life Technology) ve fosfat al salin (PBS) buzdolabından dışarı arabelleğe alınmış ve oda sıcaklığına getirin.
  2. EDTA'lı kan toplama tüpü 1,5 ml polistiren tüp (# 05-408-129, Fisher Scientific) 200 ul tam kan numunesi aktarın.
  3. İyice 200 ul tam kan numunesi ve karıştırın (# R7757, Sigma-Aldrich) 1 ml eritrosit parçalama tamponu ekleyin.
  4. 5 dakika sonra, erimiş kan örneği santrifüjden sonra üstte yüzen madde çözeltisi çıkarın.
  5. 200 ul PBS tamponu içine beyaz kan hücre pelletini tekrar ve yavaşça karıştırın.
  6. Beyaz kan hücre örneği 5 ul 1 mM SYTO16 çözeltisi ekleyin. ~ 30 dakika karanlık bir ortamda alüminyum folyo ve inkübe ile örnek sarın.
  7. Yine örnek santrifüjleyin. Süpernatant kaldırılır ve etiketlenmiş beyaz kan hücresi pelet tekrar edilirPBS tamponu içine-askıya.
  8. Bir kapak kayma için beyaz kan hücresi sıvı örneği etiketli 5-10 ul yerleştirin ve numunenin üstüne ikinci bir kapak kayma yerleştirin.
  9. Numune tepsisi ve görüntüyü cep telefonu floresan mikroskop kullanarak içine sıkışmış örnek slayt yerleştirin.

Alternatif olarak

  1. Sürekli aynı zamanda video modunda cep telefonu kamera kullanarak akan hücre floresan mikroskobik filmi çekerken, otomatik şırınga pompa kullanarak bir mikroakışkan kanal aracılığıyla floresan etiketli beyaz kan hücreleri teslim. Ayrıca, taşınabilir bir pille çalışan bir şırınga pompası ya da yerçekimi kuvveti mikroakışkan kanalı ile akış sürmek için kullanılabilir vurgulamak gerekir.

Sonuçlar

Cep telefonu kamera akan hücrelerin bir zaman yitirmez floresan mikroskobik film kaydeder iken bizim pompalama opto-akışkan / eksitasyon şeması (Şekil 1C ve 1D) ile, floresan etiketli hücreleri sürekli bir şırınga pompası ile mikroakışkan kanal içine teslim edilebilir. Bu floresan filmler daha sonra hızlı bir şekilde floresan görüntüleme akış-sitometrisi fonksiyonu alarak, otomatik olarak tam sayı ve mikroakış kanalları üzerinden akan hücre yoğunluğu belir...

Tartışmalar

Biz geniş alan floresan mikroskopi ve cep telefonu kameraları için hafif ve kompakt opto-akışkan ekleri kullanarak opto-akışkan görüntüleme flow sitometri tabanlı cep telefonu bizim son sonuçlar sundu. Bu platform teknolojisi kullanarak biz mikro-parçacıklar ve tam kan örneklerinde etiketli beyaz kan hücreleri dahil olmak üzere floresan nesneleri görüntülendi. Bu nedenle, bu kompakt ve maliyet-etkin cep telefonu tabanlı floresan görüntüleme araç kendi CD4 HIV + hastalarda izlenmesi gibi çeşitl...

Açıklamalar

Dr Özcan hesaplamalı görüntüleme ve mikroskop araçları ticarileştirmek amaçlayan bir start-up şirketi kurucusu.

Teşekkürler

A. Özcan minnetle Fen ve Mühendislik için Cumhurbaşkanlığı Erken Kariyer Ödülü (PECASE) da desteğiyle kabul Ordu Araştırma Bürosu (ARO) Genç Araştırmacı Ödülü, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) KARİYER Ödülü, Donanma Araştırma Bürosu (ONR) Genç Araştırmacı Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Müdürü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi Direktörü sitesindeki New Yenilikçisi Ödülü DP2OD006427.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Name CompanyCatalog Number Comments
Cell-phoneSonySony Ericsson Aino 
Plano-convex lensEdmund Optics# NT45-302 
Aspherical lensThorlab# C230TME-A 
FilterEdmund Optics#NT54-46 
Blue LEDDigikey#365-1201-ND 
BatteryDigikey#P032-ND 
Polystyrene tubeFisher Scientific#05-408-129 
Red blood cell lysing bufferSigma AldrichR7757 
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KITDow Corning  
Red fluorescent beads (10 μm)Life Technologies#F8834 
Green fluorescent beads (10 μm)Life Technologies#F8836 
SYTO16 nucleic acid fluorescent labelingLife Technologies# S7578 

Referanslar

  1. Sklar, L. A. . Flow Cytometry for BioTechnology. , (2005).
  2. Nunez, R. . Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , (2001).
  3. Mertz, J. . Introduction to optical microscopy. , (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
  6. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
  7. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
  11. Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
  12. Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -. W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
  13. Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -. W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
  14. Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
  15. Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
  16. Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
  17. Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
  18. Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 74Biyomedikal M hendisli iT pH cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiElektrik M hendisli iTelet pTan teknikleri ve prosed rlerDiagnostik G r nt lemeMikroskopiOptik ve FotonikOptikfloresan mikroskopg r nt leme ak m sitometricep telefonu mikroskobuTele t pk resel sa l kkablosuz sa l kklinik teknikleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır