פרוטוקולים להערכת אינטראקציות גל רדיו עם זהב חלקיקים ומערכות ביולוגיות ללא פולשני היפרתרמיה טיפול בסרטן

Summary

אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים כדי לחקור את האינטראקציות של גלי רדיו MHz 13.56 (RF) חשמליים שדות עם קולואידים nanoparticle הזהב בשתי מערכות שאינן ביולוגיות וביולוגיות (במבחנה / vivo). אינטראקציות אלה נחקרות עבור יישומים בטיפול בסרטן.

Abstract

טיפולים בסרטן שהם פחות רעילים ופולשניים יותר מאשר העמיתים הקיימים שלהם הם רצויים מאוד. השימוש בשדות חשמליים-RF הלחדור עמוק לתוך הגוף, גורם לרעילות מינימאלית, נמצאים בשלבי למדו כאמצעי קיימא של טיפול בסרטן שאינו פולשני. הוא חזה כי האינטראקציות של אנרגיית RF עם חלקיקים הפנימו (NPS) יכולות לשחרר חום אז מה שיכול לגרום להתחממות יתר (היפרתרמיה) של התא, סופו של דבר הסתיימו בנימק תא.

במקרה של מערכות שאינן ביולוגיות, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים הנוגעים לכימות החום שוחרר על ידי קולואידים NP-מרוכזים מאוד. למערכות ביולוגיות, במקרה של ניסויים במבחנה, אנו מתארים את הטכניקות ותנאים אשר חייב להיות דבקים במטרה לחשוף ביעילות תאים סרטניים לאנרגיית RF בלי חפצי חימום תקשורת בתפזורת מסתירים באופן משמעותי את הנתונים. לבסוף, אנחנו נותנים f המתודולוגיה מפורטתאו במודלי עכבר vivo עם גידולים סרטניים בכבד מחוץ לרחם.

Introduction

קליטתם של גלים אלקטרומגנטיים ברקמה ביולוגית (עקב permittivity החשמלי הטבוע בם) גורמת לטמפרטורות גבוהות לרקמות כפונקציה של זמן, מה שמוביל בסופו המוות של תאים על ידי היפרתרמיה. השערה הוא כי היפרתרמיה הסרטן יכולה להיות מותאמת באמצעות ננו הממוקד שיפנימו בתוך התא הסרטני ולפעול כמתמר RF-תרמי, עוזב את התאים נורמלים, השכנה בריאה ללא פגע. מספר דיווחים, כבר הראו כי מגוון של NPS יכול לפעול מקורות חום RF יעילים כמו שסיוע בנימק סרטן ^1-4.

בנושאים אלו, של צירופים שמנים מיודע זהב (AuNPs) ^3-5, צינורות פחמן ^1, ונקודות קוונטיות ^{6, 7} הפגינו מאפיינים מרגשים כאשר נעשה שימוש הן במבחנה ובניסויים בRF vivo. למרות שאופיו של מנגנון החימום של NPS אלה כאשר הם נחשפים לRF-שדה המדויק עדיין נדון, סדרה שלניסויים בסיסיים באמצעות AuNPs יש להציב חשיבות רבה משני גודל NP ומדינות צבירה. זה היה הראה כי AuNPs רק עם קטרים ​​<10 ננומטר יהיה חום כאשר הם נחשפים לשדה ^RF-8. כמו כן, מנגנון חימום זו נחלש באופן משמעותי כאשר AuNPs יקובצו. מצב צבירה זו תוקף גם בתוך במבחנה מודלים שהונחו על חשיבות אופטימיזציה של יציבות colloidal AuNP בתוך תאים תאיים endolysomal לטיפול RF יעיל ^4. עם זאת, הטכניקות ועקרונות ניסיוניים המשמשים לאיסוף והערכת נתונים זה יכולים להיות בעייתיים, במיוחד במקרה של אימות פרופילי חום RF מקולואידים NP.

מספר דיווחים הראו כי חימום ג'אול של ההשעיה יונית הרקע שהצירופים השמנים מיודע מושעים ביכול להיות המקור העיקרי לייצור חום RF ולא של הצירופים השמנים מיודע עצמם ^9-12. למרות שהנייר האחרון שלנו ⁸ יש תוקף לאהוא משתמש באינטראקציות RF ביצירת חום מAuNPs של קטרים ​​פחות מ -10 ננומטר, אנו שואפים לתאר את הפרוטוקולים הללו בפירוט רב יותר לאורך מאמר זה.

אנחנו גם מדגימים את הפרוטוקולים וטכניקות הדרושות כדי להעריך את היעילות של AuNPs כסוכני תרמית hyperthermic בשני במבחנה ובניסויי vivo עבור דגמי הסרטן כבד. למרות שאנו מתמקדים בעיקר בקולואידים פשוטים של AuNPs הכתיר ציטראט, ניתן ליישם את אותן הטכניקות לכלאי AuNP אחרים כגון ונוגדני מתחמי כימותרפיה מצומדות. על ידי הקפדה על עקרונות אלה בניסויים צריכים לקוות שיוכלו להעריך את הפוטנציאל עבור כל nanomaterial להיות סוכן hyperthermic תרמית מושרה RF יעיל במהירות.

Protocol

מבט ניסיוני שלם מתואר באיור 1.

פרטים נוספים מתוארים בשלבי 1-3 להלן.

1. RF חימום הערכה של קולואידים NP: AuNPs כדוגמה

1. באופן כללי, עבור כל דגימת NP נחקרת, לשטוף ראשון המדגם מספר פעמים דרך מסנן צנטריפוגה עם מים deionized (DI) כדי להסיר יוני רקע ומזהמים. כל היונים והמזהמים יהיו הוסרו מהשעית AuNP כאשר יש לו את הנוזל ששטף את שיעורים דומים RF חימום (HRS) כמים די. תהליך טיהור זה גם מאפשר לריכוזים גבוהים יותר של NPS כדי להתקבל. ראוי לציין כי למרות שהשימוש בAuNPs בדוגמא זו, ניתן ליישם את עקרונות יסוד לחומרי NP אחרים.
2. כדוגמא, לטהר את בקבוק 500 מיליליטר של AuNPs זמין המסחרית של ננומטר קוטר 5 ולאחר מכן להעמיד אותם לשדה RF 13.56 MHz של חשמל-Fiישנות ק ו / מ 'כוח 90.
   1. קח ~ 125 מיליליטר מפתרון AuNP המניות ופיצול בין שישה 50 צינורות מסנן צנטריפוגות kDa. צנטריפוגה ב 3,000 סל"ד. במשך 2 דקות 5 שניות. הסר את מסנני חיץ ומילוי מסוננים עם יותר פתרון מניות. חזור על פעולה עד שכל 500 מיליליטר סונן.
   2. החלף את המאגר המסונן עם נפח דומה של מים די וחזור כ 8 פעמים (או עד HRs RF חיץ הסינון שווה למים די). שים לב, גם ניתוח UV-Vis יכול לשמש כדי לפקח על פסגות קליטה מזהמים. ברגע שהחומרים מזהמים החיץ הוסרו באופן מלא, כ 0.5 מים די מיליליטר פיפטה לכל מסנן וresuspend AuNPs ידי pipetting חוזר ונשנה. זה אמור להסיר לחלוטין את AuNPs מהמסנן ולאפשר לresuspension מלא. מערבבים את כל שש ההשעיות לתוך צינור 15 מיליליטר Eppendorf אחד.
   3. ברגע שAuNPs היה מטוהרים מרוכזים, לנתח את המדגם באמצעות ICP-OES ו / או ICP-MS, UV מול פוטנציאל זיטה לנתונים על concentration ויציבות NP, בהתאמה. גם SEM ו / או ניתוח TEM יכולה לשמש כדי לקבל נתונים מורפולוגיים. ניתן למצוא הכנת מדגם מפורטת לטכניקות אלה בספרות ^4.
3. שימוש במערכת Kanzius RF תוארה במחקרים קודמים ^8, או נגזרות של מערכת זו, הנח קובט קוורץ גלילי 1.3 מיליליטר, כך שהשדה החשמלי RF באוויר (ללא נוכחות מדגם) יהיה ~ 90 ק ו / מ 'בתוך קובט. למדגם מלוח סטנדרטי (0.9% NaCl) החשמלי השדה יהיה מופחת ל~ 1.1 ק ו / מ '. אלה הם התנאים המשוערים משמשים כדי לאפשר השוואות להתבצע בין מערכות שונות.
   1. פיפטה 1.3 מיליליטר של מדגם 1,000 מ"ג / ליטר של קולואיד AuNP מטוהר אל קובט קוורץ ולהציג את זה לRF-השדה. ניתן לעשות זאת באמצעות בעל מדגם טפלון שהותקן. לחשוף את המדגם כדי RF-השדה לתקופה של 120 שניות או עד המדגם מגיע 70 מעלות צלזיוס כדי למנוע קשתי חשמלי או רתיחה מהירה. Capture נתוני הדמיה התרמיים (כמו גם באזורי בקרה) באמצעות מצלמת IR ותוכנה נלווית. חזור על תהליך זה שלוש פעמים.
   2. סנן את המדגם באמצעות מסנן אחר צנטריפוגות 50 kDa כדי לחלץ את AuNPs ממאגר המים די. Re-לחשוף את החיץ לRF-השדה, שוב שלוש פעמים. ההבדל בHRs בין קולואיד AuNP ומאגר המים DI הרקע קובע HR בשל AuNPs עצמם. מצפה לקבל שעות של ~ 0.3 ° C / sec ו0.05 ° C / sec לתת HR התלוי AuNP של ~ 0.25 ° C / sec. Resuspend AuNPs שנותר מאת המסנן ב1.3 מיליליטר מים במבחנה / vivo ניסויים.

2. היפרתרמיה-Induced RF בסיוע Nanoparticle: במבחנה

1. ניתן ליישם מחקרים במבחנה אלה לכל סוג של סוג סרטן תאים היוצרים monolayers 2D. בניסוי זה ישתמש קרצינומה hepatocellular אדם נגזרת תאי Hep3B.
   1. צלחת ~ 50,000 cells בשלוש בארות מול 12 גם צלחת עם 1 מיליליטר של תקשורת צמיחה. חזור על פעולה זו 6 פעמים (להשתמש בשלוש צלחות ללימודי NP ושלוש צלחות כקבוצת ביקורת). לדגור על 37.5 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני הצגה של הצירופים השמנים מיודע. לעקר צירופים שמנים מיודע ראשון באמצעות חשיפה לקרינת UV-אור בטיחות ביולוגית קבינט למשך 5 דקות.
   2. לכל אחד גם להציג 0.1 מיליליטר של פתרון 1,000 מ"ג / ליטר AuNP ולהשאיר למשך שעה 24 אחרת. הוסף 0.1 מיליליטר של מים לתוך באר כל אחד משלוש צלחות תא השליטה וגם לצאת ל24 שעות.
   3. לאחר 24 שעות חלפו, לשאוב את התקשורת הסלולרי ולשטוף עם PBS להסיר כל AuNPs מאוגד פני השטח. החלף את המדיה הסלולרי. תאים מוכנים לחשיפת RF עכשיו.
2. מניחים כל חבילה סלולרי 12 גם בתוך RF-השדה. חכה עד שהתאים מקורר ביום 31 ° C. הפעל את מחולל RF ולחשוף ל3.5 דקות. הטמפרטורה הסופית של התקשורת הסלולרי תהיה ~ 37 ° C. כבה את שדה ה-RF. הסר את התאים ולמקם אותם בחממה ל24 שעות לפני הניתוח.
   1. הסרת תאים מן החממה ותקשורת סלולרי לשאוב. הוספת 1.6 מיליליטר של תקשורת סלולרי לכל אחד גם כן ב0.4 מיליליטר של מגיב MTT. דגירה תאים למשך 4 שעות. מדיה ולשאוב להחליף עם 2 ml של sulfoxide דימתיל (DMSO). מקם את צלחות תא על נדנדה ספסל ולהשאיר למשך 10 דקות כדי לאפשר לsolubilize DMSO ריאגנטים MTT. לבסוף, של כל פיפטה 100 μl גם לתוך צלחת 96 היטב ואופטי לקרוא גם ב 570 ננומטר באמצעות קורא צלחת כגון קורא צלחת SPECTROstar Nano.

3. היפרתרמיה-Induced RF בסיוע Nanoparticle: במחקרי vivo

1. ניתן ליישם במחקרי vivo האלה לכל סוג של סרטן היוצר בגידולים מוצקים מודל Murine orthotopic או מחוץ לרחם. ניסוי זה נעשה שימוש בתאי סרטן כבד Hep3B במודל מחוץ לרחם גידול BALB-C עירום עכבר.
2. הערה: כל in vivo הניסויים מבוצעים בהתאם לכל הנחיות רלוונטיות, תקנות וגופים רגולטוריים. כמו כן, הפרוטוקול שמפגינים בוצע בהכוונה ובאישור ועדת אוניברסיטת טקסס MD Anderson Cancer מרכזים המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).
   1. תגדל מספר מתאים של תאים (~ 100 k) בבקבוק בתרבית רקמה עם מדיום הגידול המתאים. דגירה בחממה 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך תרבית תאים.
   2. טיפול בתאים עם טריפסין (להתנתק מהבקבוק) ולייצר פתרון של 2 מיליון תאים לכל 25 μl. מוסיף כמות שווה של Matrigel (על קרח) ומערבבים היטב כדי להכין את פתרון ההזרמה הסופי. להזריק את הפתרון הזה למיקום הרצוי על הגב של העכבר ולהמתין פרק זמן הולם לגידולים לגדול לגודל הרצוי (2-4 שבועות למרבית התאים). לפני כן חשיפת RF, עכברי עירום BALB-C צריכים לשאת בגידולים מוצקים אקטופי 0.5-1 סנטימטר קוטר.
3. 1. הכן את העכברים לשימוש (במקרה זה עכברי עירום BALB-C) על ידי anaesthetizing עם תמיסה של קטמין ו xylazine ידי הזרקת ה-IP. בעוד העכברים להירדם, לשמור אותם בתא טמפרטורה מבוקר על 37 ° C. 20 עכברים בסך הכל יהיה צורך, כל גידולים בגודל דומים הנושאים. עשרה עכברים יהיו להשתמש בשילוב עם ובלי AuNPs (הזריקות רק להיות האחרונות PBS) ואילו 10 העכברים הנותרים יחולקו בין בקרות RF-נחשפו ושלא נחשף RF: שני קבוצות ללא זריקות AuNP.
   2. ברגע שהורדם כראוי, להזריק AuNPs ישירות לתוך הגידול באמצעות מזרק 1 סמ"ק עם מחט G 27. פתרון AuNP צריך להיות בריכוז של Au 200 מ"ג / ליטר ב0.1 מיליליטר של PBS. לאחר הזרקה, יש להשתמש בספוגית ניתוחית לספוג דם ולנגב את אזור הזריקה עם אלכוהול לנגב.
   3. ואז לעלות על העכבר כדי להיות מטופלים על ראש המקבל של גנרטור RF. העכבר חייב להיות ממוקם כך שהגידול הוא הקרוב ביותר לראש השידור. הגן על האזורים שאינם שיתייחסו אליו, כמו גם Sensitive תחומים כגון עיניים, אוזניים, ידות ורגליים, עם סרט נחושת. הקפד שקלטת הנחושת כראוי יצירת קשר עם מטוס ההארקה, כך שאף הצטברות תשלום מתרחשת. כמו כן, באזור החשיפה חייב להיות פער של סנטימטר לפחות 1 יותר מגודלו של אתר הטיפול הרצוי.
   4. מצלמה תרמית IR העמדה, כך ששטח טיפול הגידול וגלוי. הדלק RF למשך 5 דקות. הקלט את עקומת טמפרטורה וכתוצאה מכך. אם טיפול משיג טמפרטורות להפסיק טיפול גדול יותר מאשר 42 ° C באופן מיידי.
4. 1. לאחר חשיפת RF לשחזר את העכברים מהרדמה בחדר חמים עד שהם מודעים.
   2. חזור על הניסוי עם אותה שעה עכברי 48 מאוחר יותר (השלבים 3.3.1 - 3.4.1).
   3. לאחר הניסוי, להרדים עכברים על פי פרוטוקולים והליכים מוסדיים. רשום את משקליו של הגידול. לניתוח היסטולוגית לתקן את הגידולים באמצעות פורמלין ולהטביע אותם בפרפין. סעיפי גידול בדרך כלל הם מוכתמים שנינותhematoxylin שעות ו eosin ועבור מטרות רלוונטיות ליעילות טיפולית מודדת, למשל קי 67, ביקע caspase-3, וכו '.

תוצאות

1. הערכת חימום RF של קולואידים NP: AuNPs לדוגמא ירושלים.

לאחר ביצוע סעיף 1.1 - 1.2.3 מצפה לקבל פתרון מרוכז מאוד, יציב, ומטוהר של ננומטר 5 ו10 AuNPs קוטר ננומטר. מהמ"ל 500 כנרכש פתרון מניות, מצפה להשיג לפחות 4 מיליליטר של תמיסה בריכוז של 1,000 מ"ג / ל &...

Discussion

פרוטוקולים אלה מאפשרים בניסויים על מנת לנתח את איזו המידה ננו (מקרה זה AuNPs) יכול להגדיל היפרתרמיה-Induced RF לטיפול בסרטן אופן מלא. הפרוטוקול הראשון דווקא עוסק בניתוח ייצור חום מדגימות AuNP מרוכזת מאוד ומטוהרות. אם כי קבוצות אחרות דיווחו על ייצור חום בעיקר החוצצים שAuNPs הם תל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer