Protocoles pour l'évaluation des radiofréquences Interactions avec des nanoparticules d'or et les systèmes biologiques pour la thérapie du cancer hyperthermie non invasive

Résumé

Nous décrivons les protocoles utilisés pour étudier les interactions de 13,56 MHz radiofréquence (RF) électriques champs avec des colloïdes de nanoparticules d'or dans les deux systèmes non biologiques et biologiques (in vitro / in vivo). Ces interactions sont à l'étude pour des applications dans le traitement du cancer.

Résumé

les thérapies du cancer qui sont moins toxiques et invasive que leurs homologues existants sont très souhaitables. L'utilisation de RF électriques champs qui pénètrent profondément dans le corps, provoquant une toxicité minimale, sont actuellement à l'étude comme un moyen viable de traitement du cancer non invasif. Il est prévu que les interactions de l'énergie RF avec des nanoparticules internalisées (IP) peuvent libérer de la chaleur qui peut alors provoquer une surchauffe (hyperthermie) de la cellule, terminant finalement à une nécrose cellulaire.

Dans le cas des systèmes non biologiques, nous présentons des protocoles détaillés relatifs à la quantification de la chaleur dégagée par les colloïdes NP hautement concentrés. Pour les systèmes biologiques, dans le cas d'expériences in vitro, nous décrivons les techniques et les conditions qui doivent être respectées afin d'exposer efficacement les cellules cancéreuses à l'énergie RF sans vrac artefacts de chauffage médias obscurcissant considérablement les données. Enfin, nous donnons une méthodologie détaillée fou dans des modèles murins in vivo avec des tumeurs de cancer du foie ectopiques.

Introduction

L'absorption de l'énergie RF par un tissu biologique (à cause de leur permittivité électrique intrinsèque) se traduit par des températures élevées de tissu en fonction du temps, ce qui conduit finalement à la mort cellulaire par hyperthermie. On suppose que l'hyperthermie du cancer peut être optimisée par l'utilisation de nanomatériaux ciblées qui internalisent l'intérieur de la cellule cancéreuse et agissent comme des capteurs RF-thermiques, en laissant les cellules saines normales, voisins intacts. Plusieurs rapports ont déjà montré qu'une variété de IP peut agir sources de chaleur RF efficaces qui aident à la nécrose de cancer ^1-4.

À ces égards, les IP or (AuNPs) ^3-5, les nanotubes de carbone ^1, et les points quantiques ^{6, 7} ont présenté des caractéristiques intéressantes lorsqu'il est utilisé à la fois in vitro et in vivo expériences RF. Bien que la nature exacte du mécanisme de chauffage de ces NP lorsqu'ils sont exposés à un champ RF est encore en discussion, une série deexpériences fondamentales en utilisant AuNPs a accordé une grande importance à la fois sur la taille NP et états d'agrégation. Il a été montré que seuls AuNPs de diamètre <10 nm va chauffer lorsqu'il est exposé à un champ ^RF-8. En outre, ce mécanisme de chauffage est significativement atténuée lorsque les AuNPs sont agrégés. Cette condition d'agrégation a également été validé dans les modèles in vitro qui ont placé d'importance à l'optimisation AUNP stabilité colloïdale dans des compartiments intracellulaires endolysomal pour la thérapie RF efficace ^4. Cependant, les techniques et les principes expérimentales utilisées pour recueillir et évaluer ces données peut être problématique, surtout dans le cas de la validation des profils de chaleur RF de colloïdes NP.

Plusieurs rapports ont montré que l'effet Joule de la suspension ionique de fond que les IP sont en suspension dans peut-être la principale source de production de chaleur RF et pas les mêmes IP ^9-12. Bien que notre récent article ⁸ a validé til utiliser des interactions de RF dans la production de chaleur à partir de AuNPs de diamètre inférieur à 10 nm, nous visons à décrire ces protocoles plus en détail dans cet article.

Nous démontrons également les protocoles et les techniques nécessaires pour évaluer l'efficacité de AuNPs comme agents thermiques hyperthermie à la fois in vitro et in vivo pour les modèles de cancer du foie. Bien que nous nous intéressons principalement sur les colloïdes simples de AuNPs de citrate coiffés, les mêmes techniques peuvent être appliquées à d'autres hybrides tels que AUNP-anticorps et des complexes conjugué de chimiothérapie. En adhérant à ces principes, l'expérimentateur devrait, espérons être en mesure d'évaluer rapidement le potentiel pour tout nanomatériau d'être un agent hyperthermique thermique RF-induite efficace.

Protocole

Un survol complet expérimental est représenté sur la figure 1.

De plus amples détails sont décrits dans les étapes 1 à 3 ci-dessous.

Une. Évaluation de chauffage RF de NP colloïdes: AuNPs comme un exemple

1. En général, pour chaque échantillon NP objet d'une enquête, d'abord laver les échantillons à plusieurs reprises à travers un filtre de centrifugation avec (DI) de l'eau déminéralisée pour éliminer les ions et les contaminants fond. Tous les ions et les contaminants ont été retirés de la suspension AUNP lorsque le liquide lavé a des vitesses de chauffage RF similaires (RR) que de l'eau DI. Ce processus de purification permet également de fortes concentrations de NP être obtenus. Il est à noter que, bien que l'aide AuNPs dans cet exemple, les principes fondamentaux peuvent être appliqués à d'autres matières NP.
2. A titre d'exemple, une bouteille de purifier AuNPs disponibles dans le commerce d'un diamètre de 5 nm de 500 ml, puis les soumettre à un champ électrique de fi-RF 13,56 MHzchamp de force 90 kV / m.
   1. Prenez ~ 125 ml de la solution mère de AUNP et répartis entre six 50 kDa tubes de filtre de la centrifugeuse. Centrifuger à 3000 rpm. pendant 2 min 5 sec. Retirer les filtres tampons et recharge filtrés avec plus de solution stock. Répétez jusqu'à ce que tous les 500 ml a été filtré.
   2. Remplacez la solution filtrée avec un volume similaire de l'eau DI et répéter environ 8 fois (ou jusqu'à ce que les tampons RR RF filtrés sont équivalentes à l'eau DI). Notez, analyse UV-Vis peut également être utilisé pour surveiller les pics d'absorption des contaminants. Une fois les contaminants tampons ont été entièrement enlevés, pipette environ 0,5 ml d'eau déminéralisée dans chaque filtre et remettre en suspension les AuNPs par pipetage répété. Cela devrait éliminer complètement les AuNPs du filtre et permettre la pleine remise en suspension. Mélanger tous les six suspensions dans un tube de 15 ml Eppendorf.
   3. Une fois les AuNPs ont été purifiés et concentrés, d'analyser l'échantillon en utilisant l'ICP-OES et / ou ICP-MS, UV-vis et le potentiel Zeta de données sur concentration et la stabilité NP, respectivement. SEM et / ou analyse MET peuvent également être utilisés pour obtenir des données morphologiques. Préparation de l'échantillon pour ces techniques détaillées peuvent être trouvées dans la littérature ^4.
3. En utilisant le système Kanzius RF décrit dans les études précédentes ⁸ ou dérivations de ce système, placez un cylindrique cuvette de quartz de 1,3 ml de sorte que le champ électrique RF dans l'air (sans échantillon présent) serait ~ 90 kV / m à l'intérieur de la cuvette. Pour un échantillon de sérum physiologique standard (0,9% de NaCl), le champ électrique sera réduite à environ 1,1 kV / m. Ce sont les conditions approximatives utilisées pour permettre d'effectuer des comparaisons entre les différents systèmes.
   1. Pipette 1,3 ml d'un 1,000 mg / l échantillon de AUNP colloïde purifié dans la cuvette de quartz et d'introduire ce dans le champ de RF. Cela peut être fait en utilisant un porte-échantillon en Téflon sur mesure. Exposer l'échantillon au champ de RF pendant une période de 120 secondes ou jusqu'à ce que l'échantillon atteigne 70 ° C pour éviter la formation d'un arc électrique ou une ébullition rapide. Californiepture les données d'imagerie thermique (ainsi que les zones de contrôle) à l'aide d'une caméra infrarouge et le logiciel associé. Répétez cette procédure trois fois.
   2. Filtrer l'échantillon à travers un autre filtre de la centrifugeuse 50 kDa pour extraire les AuNPs à partir du tampon d'eau DI. Ré-exposer le tampon sur le champ RF, de nouveau trois fois. La différence en heures entre le colloïde AUNP et le tampon de l'eau déminéralisée de fond détermine la RH en raison des AuNPs eux-mêmes. Attendez-vous à obtenir RR de ~ 0,3 ° C / s et 0,05 ° C / sec pour donner un HR dépend AUNP de ~ 0,25 ° C / sec. Reprendre les AuNPs restants du filtre dans 1,3 ml d'eau pour expériences in vitro / in vivo.

2. Hyperthermie induite RF assistée nanoparticules: études in vitro

1. Ces études in vitro peuvent être appliqués à n'importe quel type de cancer type de cellules qui forment des monocouches 2D. Dans cette expérience, utiliser carcinome hépatocellulaire humain dérivé de cellules Hep3B.
   1. Plate ~ 50000 cells dans les trois frontales puits d'une plaque à 12 puits avec 1 ml de milieu de croissance. Répétez cette 6 fois (utiliser trois plaques pour les études NP et trois plaques de témoins). Incuber à 37,5 ° C pendant 24 heures avant d'introduire les infirmières praticiennes. Stériliser les IP de la première utilisation de biosécurité Cabinet exposition aux UV-lumière pendant 5 min.
   2. Dans chaque puits introduire 0,1 ml d'une solution 1,000 mg / L AUNP et quitter pour un autre 24 heures. Ajouter 0,1 ml d'eau dans chaque puits des trois plaques de cellules de contrôle et de laisser aussi pendant 24 heures.
   3. Après 24 heures se sont écoulées, aspirer les milieux cellulaires et laver avec du PBS pour éliminer toute AuNPs liés à la surface. Remplacez le support de cellule. Les cellules sont maintenant prêts pour l'exposition aux RF.
2. Placez chaque paquet de cellules de 12 puits dans le champ de RF. Attendez jusqu'à ce que les cellules ont refroidi à 31 ° C. Allumez le générateur RF et exposer pour 3,5 min. La température finale du milieu cellulaire sera de ~ 37 ° C. Désactiver le champ RF. Éliminer les cellules et les placer dans un incubateur pendant 24 heures avant l'analyse.
   1. Supprimer des cellules de l'incubateur et les médias de la cellule d'aspiration. Ajouter 1,6 ml de milieu de cellules dans chaque puits ainsi à 0,4 ml de réactif MTT. Incuber les cellules pendant 4 heures. Aspirer le milieu et remplacer par 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Placez les plaques de cellules sur une bascule de banc et laisser reposer 10 minutes pour permettre le DMSO pour solubiliser les réactifs de MTT. Enfin, pipette 100 pi de chaque puits dans une plaque de 96 puits et la lecture optique du puits à 570 nm en utilisant un lecteur de plaque, comme le lecteur de plaque SPECTROstar Nano.

3. Hyperthermie induite RF assistée nanoparticules: Les études in vivo

1. Ces études in vivo peuvent être appliquées à n'importe quel type de cancer qui se forme de tumeurs solides chez un modèle murin orthotopique ou ectopique. Cette expérience utilise des cellules de cancer du foie Hep3B dans un modèle de souris BALB-C ectopique de souris Nude tumorale.
2. Remarque: toutes les expériences in vivo sont exécutées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. En outre, le protocole étant démontré a été réalisée sous la direction et l'approbation de l'Université du Texas MD Anderson Cancer Centers soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC).
   1. Cultiver un nombre approprié de cellules (~ 100 k) dans un ballon de culture de tissu avec le milieu de croissance approprié. Incuber dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant toute la durée de la culture cellulaire.
   2. Traiter les cellules avec de la trypsine (à détacher du ballon) et de produire une solution de 2 millions de cellules pour tous les 25 pi. Ajouter une quantité égale de Matrigel (sur la glace) et bien mélanger pour préparer la solution finale d'injection. Injecter cette solution dans la position souhaitée sur le dos de la souris et d'attendre une période de temps appropriée pour que les tumeurs se développer jusqu'à la taille désirée (2-4 semaines pour la plupart des cellules). Avant l'exposition RF, souris nude BALB-C doivent porter tumeurs ectopiques solides 0,5-1 cm de diamètre.
3. 1. Préparer les souris à utiliser (dans ce cas BALB-C souris Nude) par anéles sthetizing avec une solution de kétamine et de xylazine par injection IP. Alors que les souris s'endorment, les garder dans une chambre à température contrôlée à 37 ° C. 20 souris au total seront nécessaires, tous portant des tumeurs de taille similaire. Dix souris seront utilisés en conjonction avec et sans AuNPs (ces derniers étant les injections de PBS), tandis que les 10 souris restantes seront réparties entre les RF-exposée témoins non exposés et RF: les deux groupes sans injections de AUNP.
   2. Une fois anesthésié, injecter les AuNPs directement dans la tumeur en utilisant une seringue de 1 cc avec une aiguille 27 G. La solution AUNP devrait être à une concentration de 200 mg de Au / L dans 0,1 ml de PBS. Après l'injection, utiliser un tampon chirurgical pour absorber le sang et essuyez le site d'injection avec un tampon imbibé d'alcool.
   3. Puis monter la souris à traiter sur la tête de réception du générateur RF. La souris doit être placé de sorte que la tumeur est le plus proche de la tête de transmission. Protéger les zones qui ne doivent pas être traités, ainsi que sensiblestion des domaines tels que les yeux, les oreilles et les orteils, avec une bande de cuivre. Assurez-vous que la bande de cuivre est en contact de façon appropriée au plan de mise à la terre de sorte qu'aucune accumulation de charge se produit. En outre, la zone d'exposition doit avoir un intervalle d'au moins 1 cm plus grande que la taille du site de traitement souhaité.
   4. Position caméra infrarouge thermique de sorte que la tumeur et la zone de traitement sont visibles. Mettez RF pendant 5 min. Enregistrer la courbe de température qui en résulte. Si le traitement permet d'obtenir des températures supérieures à 42 ° C de traitement de l'arrêt immédiatement.
4. 1. Après l'exposition aux RF récupérer la souris de l'anesthésie dans une chambre chaude jusqu'à ce qu'ils soient conscients.
   2. Répéter l'expérience avec les mêmes souris 48 heures plus tard (étapes 3.3.1 - 3.4.1).
   3. Après l'expérience, euthanasier les souris selon des protocoles et des procédures institutionnelles. Noter le poids de la tumeur. Pour l'analyse histologique fixer les tumeurs à l'aide de formol et de les intégrer dans de la paraffine. sections de tumeurs sont généralement colorées esprith hématoxyline et l'éosine et des cibles pertinentes pour évaluer l'efficacité thérapeutique, par exemple Ki-67, caspase-3, etc.

Résultats

Une. L'évaluation de chauffage RF de colloïdes NP: AuNPs titre d'exemple.

Après avoir suivi la section 1.1 - 1.2.3 s'attendre à avoir une solution très concentrée, stable et purifiée de 5 nm et 10 nm AuNPs de diamètre. De les 500 ml de solution-acheté des actions, s'attendre à obtenir au moins 4 ml d'une solution à une concentration de 1,000 mg / L. La différence en heures entre les AuNPs et la solution tampon de l'eau DI de fond à cette concentration doit ?...

Discussion

Ces protocoles permettent à l'expérimentateur d'analyser pleinement la mesure dans laquelle les nanomatériaux (dans ce cas AuNPs) peut augmenter l'hyperthermie induite RF-pour le traitement du cancer. Le premier protocole traite spécifiquement de l'analyse de la production de chaleur à partir d'échantillons AUNP hautement concentré et purifié. Bien que d'autres groupes ont rapporté la production de chaleur principalement à partir des tampons dont les AuNPs sont suspendus à l'intér...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer