Protokolle für die Beurteilung der Radiofrequenz-Wechselwirkungen mit Gold-Nanopartikel und biologische Systeme für die Nicht-invasive Krebstherapie Hyperthermie

Zusammenfassung

Wir beschreiben die verwendet werden, um die Wechselwirkungen von 13,56 MHz Hochfrequenz-(RF)-Protokolle untersuchen elektrischen Felder, die mit Gold-Nanopartikel Kolloide in beiden nicht-biologischen und biologischen Systemen (in vitro / vivo). Diese Wechselwirkung ist für die Anwendung in der Krebstherapie untersucht.

Zusammenfassung

Krebs-Therapien, die weniger toxisch und invasiv als die existierende sind sehr wünschenswert. Der Einsatz von elektrischen HF-Felder, die tief in den Körper eindringen und minimale Toxizität, werden derzeit als ein brauchbares Mittel der nicht-invasiven Krebstherapie untersucht. Es ist vorgesehen, dass die Wechselwirkungen von HF-Energie mit verinnerlicht Nanopartikel (NP) kann die Wärme, die dann dazu führen kann Überhitzung (Hyperthermie) der Zelle zu befreien, schließlich endet in Zelle Nekrose.

Im Fall von nicht-biologischen Systemen stellen wir ausführliche Protokolle über die Quantifizierung der Wärme durch hochkonzentrierte NP Kolloide befreit. Für biologische Systeme, bei der in-vitro-Experimente beschreiben wir die Verfahren und Bedingungen, die zur Krebszellen, um HF-Energie effektiv aussetzen ohne Groß Medien Heizung Artefakte deutlich Verschleierung der Daten eingehalten werden müssen. Schließlich geben wir eine detaillierte Methodik foder in vivo Mausmodellen mit Eileiterleberkrebs Tumoren.

Einleitung

Die Absorption von HF-Energie, die durch biologisches Gewebe (aufgrund ihrer inhärenten elektrischen Permittivität) führt zu erhöhten Gewebetemperaturen als Funktion der Zeit, die schließlich zum Tod führt durch Hyperthermie Zelle. Es wird vermutet, dass Krebs Hyperthermie kann durch den Einsatz von Nanomaterialien, die gezielt in der Krebszelle verinnerlichen und fungieren als RF-Wärmewandler, so dass die benachbarten gesunden, normalen Zellen intakt optimiert werden. Mehrere Berichte haben bereits gezeigt, dass eine Vielzahl von Nanopartikeln kann so effektiv RF Wärmequellen, die in der Krebshilfe Nekrose ^4.1 handeln.

In dieser Hinsicht, Gold-Nanopartikel (AuNPs) ^3-5, Kohlenstoff-Nanoröhren ^ein, und Quantenpunkte ^{6, 7} spannende Eigenschaften zeigen, wenn in in vitro und in vivo RF Experimente verwendet. Obwohl die genaue Natur des Heizmechanismus dieser Nanopartikel, wenn sie einem HF-Feld ausgesetzt wird noch diskutiert wird, eine Reihe vongrundlegende Experimente mit AuNPs hat große Bedeutung sowohl NP Größe und Aggregations platziert. Es wurde gezeigt, dass nur AuNPs mit Durchmessern <10 nm wird erwärmt, wenn sie einem HF-Feld ⁸ ausgesetzt. Außerdem ist dieser Heizmechanismus signifikant abgeschwächt, wenn die AuNPs aggregiert werden. Diese Aggregation Zustand wurde auch in in-vitro-Modelle, die Bedeutung auf die Optimierung AuNP kolloidalen Stabilität innerhalb endolysomal intrazellulären Kompartimenten für eine wirksame Therapie RF ⁴ angeordnet validiert. Allerdings können die Techniken und experimentellen Grundlagen für die Erhebung und Bewertung dieser Daten problematisch sein, vor allem bei der Validierung von HF-Wärme Profile NP Kolloide.

Mehrere Berichte haben gezeigt, dass Joule Erwärmung des ionischen Hintergrund Suspension, die Nanopartikel sind in abgehängten kann die Hauptquelle der RF Wärmeproduktion und nicht die Nanopartikel selbst ^9-12 sein. Obwohl unsere jüngsten Papier ⁸ hat validiert ter von HF-Wechselwirkungen Verwendung bei der Erzeugung von Wärme aus AuNPs von Durchmessern von weniger als 10 nm, wollen wir diese Protokolle im Detail in diesem Artikel beschreiben.

Wir haben auch die Protokolle und Techniken erforderlich, um die Wirksamkeit der Hyperthermie AuNPs als Wärmemittel in in vitro und in vivo Experimente für Leberkrebsmodellen zu bewerten demonstrieren. Obwohl wir in erster Linie auf einfache Kolloide Citrat bedeckten AuNPs können die gleichen Techniken auf andere AuNP Hybride wie Antikörper-und Chemotherapie-konjugierten Komplexen angewendet werden. Durch die Beachtung dieser Grundsätze der Experimentator sollte hoffentlich in der Lage, schnell zu bewerten das Potenzial für jedes Nanomaterial, um eine effektive RF-induzierte Thermo hyperthermic Mittel sein.

Protokoll

Eine komplette Übersicht experimentellen ist in Abbildung 1 dargestellt.

Weitere Einzelheiten werden in Schritten 1-3 dargestellt.

1. Die Beurteilung RF Heizung von NP Kolloide: AuNPs als Beispiel

1. In der Regel für jede NP Probe untersucht zunächst die Probe mehrmals waschen durch eine Zentrifugation Filter mit VE-Wasser (DI) in den Hintergrund Ionen und Verunreinigungen zu entfernen. Alle Ionen und Verunreinigungen werden aus der AuNP Suspension, wenn die Flüssigkeit ausgewaschen hat ähnliche HF-Erwärmungsraten (HRS) als DI-Wasser entfernt worden sein. Dieses Reinigungsverfahren ermöglicht auch höhere Konzentrationen von Nanopartikeln zu erhalten. Es ist erwähnenswert, dass, obwohl mit AuNPs in diesem Beispiel können die Grundsätze auf andere NP Materialien aufgebracht werden.
2. Als Beispiel Reinigung einer 500-ml-Flasche im Handel erhältlich AuNPs einem Durchmesser von 5 nm und dann dafür eine 13,56-MHz-HF-Bereich der Elektroanlageeld Stärke 90 kV / m.
   1. Nehmen Sie ~ 125 ml aus dem Aktien AuNP Lösung und Spaltung zwischen sechs 50 kDa Zentrifugenfilterrohre. Zentrifugieren bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. 2 min 5 sek. Mit mehr Stammlösung entfernen gefiltert Puffer und Refill-Filter. Wiederholen, bis alle 500 ml gefiltert wurde.
   2. Ersetzen Sie die gefilterten Puffer mit einem ähnlichen Volumen von DI-Wasser und wiederholen Sie etwa 8-mal (oder bis die gefilterten Puffer RF HRs sind äquivalent zu DI-Wasser). Beachten Sie, UV-Vis-Analyse kann auch verwendet werden, um Verunreinigungen Absorptionspeaks zu überwachen. Sobald die Puffer Verunreinigungen wurden vollständig entfernt, Pipetten etwa 0,5 ml DI-Wasser in jeden Filter und resuspendieren AuNPs durch wiederholtes Pipettieren. Dies sollte die AuNPs vollständig aus dem Filter und ermöglichen eine vollständige Resuspension. Kombinieren Sie alle sechs Suspensionen in ein 15 ml-Eppendorf-Röhrchen.
   3. Sobald die AuNPs wurden gereinigt und konzentriert, analysiert die Probe mit ICP-OES-und / oder ICP-MS, UV-Vis-und Zeta-Potential für Daten auf concentration und NP Stabilität auf. SEM und / oder TEM-Analyse kann auch verwendet werden, um morphologische Daten zu erhalten. Detaillierte Probenaufbereitung für diese Techniken sind in der Literatur ⁴ gefunden werden.
3. Verwendung der in den vorhergehenden Studien ⁸ beschrieben Kanzius RF System oder Ableitungen dieses Systems stellen eine 1,3-ml-Quarzküvette zylindrischen so dass die elektrische RF-Feld in der Luft (ohne Probe vorhanden ist) wäre ~ 90 kV / m im Inneren der Küvette. Für einen Standard-Kochsalzlösung-Probe (0,9% NaCl), das elektrische Feld würde auf ~ 1,1 kV / m ist. Dies sind die ungefähren Bedingungen verwendet, damit Vergleiche zwischen unterschiedlichen Systemen erfolgen.
   1. Pipette 1,3 ml einer 1.000 mg / l Probe des gereinigten AuNP Kolloid in die Quarz-Küvette und stellen diese in den HF-Bereich. Dies kann durch die Verwendung eines kundenspezifischen Teflon Probenhalter durchgeführt werden. Aussetzen Probe zu dem RF-Feld für einen Zeitraum von 120 Sekunden oder bis die Probe 70 ° C erreicht, um eine elektrische Lichtbogenbildung oder schnelles Kochen zu verhindern. Capture die Wärmebilddaten (und Steuerflächen) mit einer IR-Kamera und zugehörige Software. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
   2. Filtern Sie die Probe durch weitere 50 kDa Zentrifuge Filter, um die AuNPs von der DI-Wasser-Puffer zu extrahieren. Neu setzen den Puffer zu dem RF-Feld, erneut dreimal. Der Unterschied zwischen der in HRs AuNP Kolloid und dem Hintergrund DI-Puffer bestimmt die HR aufgrund der AuNPs sich. Erwarten Sie, um HRs von ~ erhalten 0,3 ° C / sec und 0,05 ° C / s, eine AuNP abhängig HR von ~ 0,25 ° C / s geben. Resuspendieren der verbleibenden AuNPs aus dem Filter in 1,3 ml Wasser für in vitro / vivo-Experimente.

2. Nanopartikel-unterstützt RF-induzierte Hyperthermie: In-vitro-Studien

1. Diese in vitro-Studien können zu jeder Art von Krebs, Zelltyp, der 2D-Monoschichten aufgebracht werden. In diesem Experiment verwenden menschlichen Leberzellkarzinom abgeleitet Hep3B-Zellen.
   1. Platte ~ 50.000 cells in den vorderen drei Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen mit 1 ml Wachstumsmedium. Wiederholen Sie dies 6 Mal (drei Platten verwenden für NP Studien und drei Platten als Kontrollen). Inkubation bei 37,5 ° C für 24 h vor der Einführung der Nanopartikel. Sterilisieren NPs zunächst mit Biosicherheitswerk UV-Licht-Exposition für 5 min.
   2. In jeden gut vorstellen 0,1 ml einer 1.000 mg / L AuNP Lösung und lassen für weitere 24 Stunden. 0,1 ml Wasser in jedes Well der drei Kontrollzellplatten und auch für die 24-Stunden verlassen.
   3. Nach 24 Stunden vergangen sind, saugen die Zellmedien und waschen mit PBS, alle oberflächengebundenen AuNPs entfernen. Ersetzen Sie den Zellmedien. Die Zellen sind nun bereit für HF-Belastung.
2. Platzieren Sie jede 12-Well-Zellpack innerhalb der HF-Feld. Warten, bis die Zellen auf 31 ° C abgekühlt Einschalten des HF-Generators und setzen für 3,5 min. Die Endtemperatur der Zellmedium wird ~ 37 ° C liegen Schalten Sie das HF-Feld. Entfernen Sie die Zellen und legen Sie sie in einem Brutschrank für 24 h vor der Analyse.
   1. Zellen entfernen aus dem Inkubator und saugen Zellmedien. In 1,6 ml Zellmedium in jede Vertiefung sowie mit 0,4 ml MTT-Reagenz. Zellen für 4 Stunden inkubiert. Saugen Medien und ersetzen mit 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Legen Sie die Zellplatten auf einer Bank Wippe und lassen für 10 Minuten, damit die DMSO, die MTT-Reagenzien zu lösen. Schließlich Pipette 100 ul jeder Vertiefung in eine 96-Well-Platte und optisch ausgelesen und die bei 570 nm mit einem Plattenlesegerät wie dem SPECTROstar Nano-Plattenlesegerät.

3. Nanopartikel-unterstützt RF-induzierte Hyperthermie: In-vivo-Studien

1. Diese in-vivo-Studien kann für jede Art von Krebs, die solide Tumore in einem orthotopen Mausmodell oder Eileiter bildet angewendet werden. Im Versuch wird Hep3B Leberkrebszellen in einer Eileitertumor BALB-C Nude-Maus-Modell.
2. Hinweis: Alle in-vivo-Versuche sind in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Außerdem wurde das Protokoll demonstriert unter der Leitung und Genehmigung der University of Texas MD Anderson Cancer Centers Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.
   1. Wachsen, eine entsprechende Anzahl von Zellen (~ 100 K) in einer Zellkulturflasche mit dem geeigneten Wachstumsmedium. Inkubieren in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ für die Dauer der Zellkultur.
   2. Gönnen Zellen mit Trypsin (aus der Flasche zu lösen) und erzeugen eine Lösung von 2 Millionen Zellen für jeweils 25 ul. In die gleiche Menge Matrigel (auf Eis) und gründlich mischen, um den endgültigen Injektionslösung vorzubereiten. Spritzen Sie diese Lösung in der gewünschten Position auf der Maus die sich zurück und warten eine entsprechende Menge an Zeit für die Tumoren auf die gewünschte Größe (2-4 Wochen für die meisten Zellen) wachsen. Vor der HF-Belastung sollte BALB-C Nacktmäuse solide Tumoren Eileiter tragen 0,5-1 cm Durchmesser.
3. 1. Bereiten die Mäuse durch ANAE verwendet werden (in diesem Fall BALB-c-Nacktmäusen)sthetizing sie mit einer Lösung von Ketamin und Xylazin durch IP-Injektion. Während die Mäuse Einschlafen, halten Sie sie in einem Temperaturkammer bei 37 ° C 20 Mäusen insgesamt benötigt werden, alle Lager ähnlicher Größe Tumoren. Zehn Mäuse wird in Verbindung mit und ohne AuNPs verwendet werden (letzteres ist nur PBS-Injektionen), während die verbleibenden 10 Mäuse werden zwischen HF-exponierten und nicht-exponierten Kontrollen RF aufgeteilt werden: beide Gruppen ohne AuNP Injektionen.
   2. Einmal richtig betäubt, injizieren die AuNPs direkt in den Tumor mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel. Die AuNP ist bei einer Au-Konzentration von 200 mg / l in 0,1 ml PBS werden. Nach der Injektion mit einem OP-Tupfer, um das Blut mit einem Alkoholtupfer absorbieren und wischen Sie die Injektionsstelle.
   3. Dann montieren Sie die Maus auf den Aufnahmekopf des HF-Generators behandelt werden. Die Maus ist so positioniert werden, dass der Tumor in der Nähe des Übertragungskopfes. Schirmen Sie die Bereiche, die nicht zu behandelnden sowie sensiblentive Bereiche wie Augen, Ohren, Zehen und mit Kupferband. Seien Sie sicher, dass das Kupferband wird entsprechend Kontakt mit der Erdungsebene, so dass keine Aufladung erfolgt. Außerdem muss die Belichtungsfläche einen Abstand von mindestens 1 cm größer ist als die Größe der gewünschten Behandlungsstelle haben.
   4. Position IR-Wärmebildkamera, so dass der Tumor-und Behandlungsbereich sichtbar sind. Schalten Sie RF für 5 min. Notieren Sie die resultierende Temperaturkurve. Wenn die Therapie erreicht Temperaturen von mehr als 42 ° C Anschlag Behandlung sofort.
4. 1. Nach der HF-Belastung zu erholen die Mäuse aus der Narkose in einem warmen Raum, bis sie bei Bewusstsein sind.
   2. Wiederhole den Versuch mit der gleichen Mäuse 48 Stunden später (Schritte 3.3.1 - 3.4.1).
   3. Nach dem Experiment euthanize die Mäuse in Übereinstimmung mit institutionellen Protokolle und Prozeduren. Das Gewicht des Tumors. Für die histologische Analyse fix die Tumoren mit Formalin und betten sie in Paraffin. Tumorschnitte sind in der Regel gefärbt Witzh Hämatoxylin und Eosin und für die Messung relevanten therapeutischen Wirksamkeit, z. B. Ki-67-Ziele, gespalten Caspase-3-usw.

Ergebnisse

1. Erfassen der HF-Erwärmung von NP Kolloide: AuNPs als Beispiel.

Nach dem folgenden Abschnitt 1.1 - 1.2.3 erwarten, eine hochkonzentrierte, stabile und gereinigte Lösung von 5 nm und 10 nm Durchmesser AuNPs haben. Von den 500 ml-als gekauft Stammlösung erwarten, dass mindestens 4 ml Lösung in einer Konzentration von 1000 mg / L zu erhalten Der Unterschied in h zwischen den AuNPs und dem Hintergrund DI-Pufferlösung bei dieser Konzentration sollte ~ 0,25 ° C / s und 0,1 ° C / s für 5 nm ...

Diskussion

Diese Protokolle ermöglichen dem Experimentator, um den Umfang, in dem Nanomaterialien (in diesem Fall AuNPs) kann RF-Hyperthermie zur Behandlung von Krebs erhöhen vollständig zu analysieren. Das erste Protokoll speziell mit der Analyse der Wärmeerzeugung aus hoch-konzentriert und gereinigt AuNP Proben. Obwohl auch andere Gruppen haben die Wärmeproduktion in erster Linie von den Puffern, die die AuNPs sind und nicht in den AuNPs sich ^9-11 ausgesetzt berichtet, nutzten ihre HF-Systeme niedrigere Konzentra...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer