Protocolli per la valutazione radiofrequenza interazioni con nanoparticelle di oro e Sistemi Biologici per la non-invasiva Ipertermia Cancer Therapy

Riepilogo

Descriviamo i protocolli utilizzati per studiare le interazioni di 13,56 MHz a radiofrequenza (RF) elettrici-campi con colloidi nanoparticelle d'oro in entrambi i sistemi non biologici e biologici (in vitro / vivo). Queste interazioni sono studiati per applicazioni nella terapia del cancro.

Abstract

Terapie del cancro che sono meno tossiche e invasivo rispetto ai loro omologhi esistenti sono altamente desiderabili. L'uso di RF elettrici campi che penetrano in profondità nel corpo, causando minima tossicità, sono attualmente in fase di studio come mezzo vitale di terapia del cancro non invasivo. E 'previsto che le interazioni di energia RF con nanoparticelle internalizzate (NP) possono liberare calore che può quindi causare surriscaldamento (ipertermia) della cella, infine termina in necrosi cellulare.

Nel caso di sistemi non biologici, presentiamo protocolli dettagliati relativi alla quantificazione del calore liberato dai colloidi NP altamente concentrati. Per i sistemi biologici, nel caso di esperimenti in vitro, si descrivono le tecniche e le condizioni che devono essere rispettate al fine di esporre in modo efficace le cellule tumorali a radiofrequenza senza massa artefatti di riscaldamento del materiale che oscurano in modo significativo i dati. Infine, diamo una dettagliata metodologia fo in modelli in vivo del mouse con tumori epatici ectopiche.

Introduzione

L'assorbimento di energia RF da tessuto biologico (per la loro permettività elettrica intrinseca) si traduce in temperature elevate tessuto in funzione del tempo, che conduce infine alla morte cellulare da ipertermia. Si ipotizza che l'ipertermia il cancro può essere ottimizzato attraverso l'utilizzo di nanomateriali mirati che internalizzano all'interno della cellula tumorale e agiscono come trasduttori RF-termici, lasciando intatte le cellule normali circostanti, sane. Diversi studi hanno già dimostrato che una varietà di NP può agire fonti di calore RF come efficace che aiuti il cancro necrosi ^1-4.

In questi saluti, NP oro (AuNPs) ^3-5, nanotubi di carbonio ^1, e punti quantici ^{6, 7} hanno esposto le caratteristiche emozionanti quando viene utilizzato sia in vitro ed in esperimenti RF vivo. Sebbene l'esatta natura del meccanismo di riscaldamento di queste NP quando esposti ad un campo RF è ancora in discussione, una serie diesperimenti fondamentali che utilizzano AuNPs ha posto grande importanza sia formato NP e stati di aggregazione. E 'stato dimostrato che solo AuNPs con diametro <10 nm si riscalda quando esposti ad un campo ^RF-8. Inoltre, questo meccanismo di riscaldamento viene notevolmente attenuato quando i AuNPs vengono aggregati. Questa condizione di aggregazione è stato validato anche all'interno di modelli in vitro che hanno posto l'importanza su ottimizzare AuNP stabilità colloidale entro compartimenti intracellulari endolysomal di efficace terapia RF ^4. Tuttavia, le tecniche ei principi sperimentali utilizzati per raccogliere e valutare questi dati possono essere problematico, soprattutto nel caso di convalida profili termici RF da colloidi NP.

Diversi studi hanno dimostrato che il riscaldamento Joule dello sfondo sospensione ionica che i PN sono sospese in può essere la principale fonte di produzione di calore RF e non NP stessi ^9-12. Anche se il nostro recente articolo ⁸ ha convalidato tegli usa delle interazioni RF nel generare calore da AuNPs di diametro inferiore a 10 nm, ci proponiamo di descrivere questi protocolli più in dettaglio in questo articolo.

Abbiamo anche dimostrare i protocolli e le tecniche per valutare l'efficacia di AuNPs come agenti termici hyperthermic sia in vitro e in vivo per modelli di cancro al fegato. Anche se ci concentriamo principalmente su semplici colloidi di AuNPs citrato-capped, le stesse tecniche possono essere applicate ad altri ibridi AUNP come anticorpi e complessi chemioterapia-coniugato. Aderendo a tali principi il sperimentalista spera, dovrebbe essere in grado di valutare rapidamente il potenziale per qualsiasi nanomateriale ad essere un efficace agente ipertermica termico RF-indotta.

Protocollo

Una panoramica completa sperimentale è illustrato nella Figura 1.

Ulteriori dettagli sono descritti nei passaggi 1-3 sotto.

1. Valutare RF riscaldamento di NP Colloids: AuNPs come esempio

1. In generale, per ogni campione indagato NP, prima lavare più volte il campione attraverso un filtro centrifugazione con acqua deionizzata (DI) per rimuovere ioni di sfondo e contaminanti. Tutti gli ioni e contaminanti sono stati rimossi dalla sospensione AuNP quando il liquido che viene lavato fuori ha tassi di riscaldamento RF simili (HR) come acqua deionizzata. Questo processo di purificazione consente anche di alte concentrazioni di NP da ottenere. Vale la pena notare che anche se usando AuNPs in questo esempio, i principi fondamentali possono essere applicati ad altri materiali NP.
2. Come esempio, purificare una bottiglia da 500 ml di AuNPs disponibili in commercio di diametro 5 nm e poi sottoporli ad un campo RF 13,56 MHz di elettrico-fiELD forza 90 kV / m.
   1. Prendere ~ 125 ml di soluzione madre AuNP e diviso tra i sei 50 tubi filtranti centrifuga kDa. Centrifugare a 3.000 giri. per 2 min 5 sec. Rimuovere i filtri tampone e ricarica filtrati con il resto dello stock soluzione. Ripetere fino a quando tutti i 500 ml è stata filtrata.
   2. Sostituire il buffer filtrato con un simile volume di acqua deionizzata e ripetere circa 8 volte (o fino a quando gli HR RF tampone filtrati equivalenti a acqua deionizzata). Nota, analisi UV-Vis può anche essere utilizzato per monitorare picchi di assorbimento di contaminanti. Una volta che i contaminanti tampone sono stati, pipetta circa 0,5 ml di acqua deionizzata completamente rimosso in ogni filtro e sospendere nuovamente le AuNPs pipettando ripetuta. Questo dovrebbe rimuovere completamente i AuNPs dal filtro e consentire la completa risospensione. Unire tutte e sei le sospensioni in una provetta da 15 ml Eppendorf.
   3. Una volta che i AuNPs sono stati purificati e concentrati, analizzare il campione utilizzando ICP-OES e / o ICP-MS, UV-vis e il potenziale Zeta per i dati relativi concentration e stabilità NP, rispettivamente. SEM e / o analisi TEM può essere utilizzato anche per ottenere dati morfologici. Preparazione del campione estesa di queste tecniche possono essere trovate in letteratura ^4.
3. Utilizzando il sistema Kanzius RF descritto in studi precedenti ^8, o derivazioni di questo sistema, posizionare un 1,3 ml cilindrica quarzo cuvetta in modo che il campo elettrico RF in aria (senza campione presente) sarebbe ~ 90 kV / m all'interno della cuvetta. Per un esempio di soluzione salina normale (0,9% NaCl) il campo elettrico si ridurrebbe a ~ 1,1 kV / m. Queste sono le condizioni approssimative utilizzati per consentire raffronti tra sistemi diversi.
   1. Pipettare 1,3 ml di un campione di 1.000 mg / l di purificato AuNP colloide nella cuvetta di quarzo e introdurlo in RF-campo. Questo può essere fatto utilizzando un portacampioni Teflon fuoriserie. Esporre campione al campo RF per un periodo di 120 secondi o fino a quando il campione raggiunge i 70 ° C per evitare la formazione di arco elettrico o bollitura rapida. Capture i dati di imaging termico (così come aree di controllo) utilizzando una telecamera a infrarossi e software associato. Ripetere questa procedura per tre volte.
   2. Filtrare il campione attraverso un altro filtro centrifuga 50 kDa per estrarre i AuNPs dal buffer di acqua deionizzata. Riesporre il buffer RF-campo, di nuovo tre volte. La differenza in ore tra il colloide AuNP e l'accumulo acqua DI sfondo determina la HR causa delle AuNPs stessi. Aspettatevi di ottenere HRs di ~ 0,3 ° C / sec e 0,05 ° C / sec per dare un HR dipendente AuNP di circa 0,25 ° C / sec. Risospendere le restanti AuNPs dal filtro in 1,3 ml di acqua per vitro esperimenti in vivo /.

2. Nanoparticelle assistita RF-ipertermia indotta: studi in vitro

1. Questi studi in vitro possono essere applicate a qualsiasi tipo di tipo cellula tumorale che formano monostrati 2D. In questo esperimento utilizzare carcinoma epatocellulare umano cellule derivate Hep3B.
   1. Piatto ~ 50.000 cells nella parte anteriore tre pozzetti di una piastra 12 pozzetti con 1 ml di terreno di coltura. Ripetere questo 6 volte (utilizzare tre piastre per Studi NP e tre piastre come controlli). Incubare a 37,5 ° C per 24 ore prima di introdurre gli NP. Sterilizzare NP primo utilizzo BioSafety Cabinet esposizione ai raggi UV-luce per 5 min.
   2. In ogni pozzetto introdurre 0,1 ml di una soluzione di 1,000 mg / L AuNP e lasciare per un altro 24 ore. Aggiungere 0,1 ml di acqua in ciascun pozzetto delle tre piastre delle celle di controllo e lasciare anche per 24 ore.
   3. Dopo 24 ore sono passati, aspirare i media di cellule e lavare con PBS per rimuovere eventuali AuNPs-bound superficie. Sostituire il supporto cella. Le cellule sono ora pronti per l'esposizione alle radiofrequenze.
2. Posizionare ogni pacco cella 12, ben all'interno della RF-campo. Attendere che le cellule si sono raffreddati a 31 ° C. Accendere il generatore di radiofrequenza ed esporre per 3,5 min. La temperatura finale del supporto cella sarà ~ 37 ° C. Spegnere il campo RF. Rimuovere le cellule e metterli in un incubatore per 24 ore prima dell'analisi.
   1. rimuovere le cellule dal termostato e mezzi cellulare aspirare. Aggiungere 1,6 ml di mezzo di cellule in ciascun pozzetto e 0,4 ml di reagente MTT. Incubare le cellule per 4 ore. Aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Posizionare le piastre di celle in un rocker panchina e lasciare per 10 minuti per consentire al DMSO per solubilizzare i reagenti MTT. Infine, pipetta 100 microlitri di ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e otticamente leggere il pozzetto a 570 nm usando un lettore di piastre, come il lettore di piastre SPECTROstar Nano.

3. Nanoparticelle assistita RF-ipertermia indotta: studi in vivo

1. Questi studi in vivo possono essere applicate a qualsiasi tipo di cancro che si forma tumori solidi in un modello murino ortotopico o ectopica. Questo esperimento utilizza le cellule tumorali del fegato Hep3B in un tumore BALB-C modello di topo nudo ectopica.
2. Nota: tutti gli esperimenti in vivo sono eseguite in conformità con tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Inoltre, il protocollo essendo dimostrato è stato eseguito sotto la guida e l'approvazione della University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC).
   1. Crescere un numero appropriato di cellule (~ 100 k) in un pallone di coltura tissutale con il mezzo di crescita appropriato. Incubare in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ per la durata di coltura cellulare.
   2. Trattamento di cellule con tripsina (per staccare dal pallone) e produrre una soluzione di 2 milioni di cellule per ogni 25 ml. Aggiungere una quantità uguale di Matrigel (su ghiaccio) e mescolare accuratamente per preparare la soluzione ultima iniezione. Iniettare questa soluzione nella posizione desiderata sul dorso del mouse e attendere un tempo adeguato per i tumori di crescere alla dimensione desiderata (2-4 settimane per la maggior parte delle cellule). Prima esposizione a RF, BALB-C topi nudi dovrebbero sopportare tumori solidi ectopiche 0,5-1 cm di diametro.
3. 1. Preparare i topi da utilizzare (in questo caso BALB-C topi nudi) da anaeli sthetizing con una soluzione di chetamina e xilazina per iniezione IP. Mentre i topi sono in calo addormentato, tenerli in una camera a temperatura controllata a 37 ° C. Saranno necessari 20 topi in totale, tutti i portatori di tumori di dimensioni simili. Dieci topi saranno utilizzati in combinazione con e senza AuNPs (che è di soli iniezioni PBS), mentre i restanti 10 topi saranno divisi tra controlli RF-esposti non RF-vista e: entrambi i gruppi senza iniezioni AUNP.
   2. Una volta adeguatamente anestetizzato, iniettare i AuNPs direttamente nel tumore con una siringa da 1 cc con un ago G 27. La soluzione AuNP dovrebbe essere ad una concentrazione di Au 200 mg / L in 0,1 ml di PBS. Dopo l'iniezione, utilizzare un tampone chirurgico per assorbire il sangue e pulire il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool.
   3. Poi montare il mouse da trattare sulla testa di ricezione del generatore RF. Il mouse deve essere posizionato in modo che il tumore è più vicina alla testa trasmissione. Proteggere le aree che non devono essere trattati, così come sensibilitiva aree come gli occhi, le orecchie e le dita dei piedi, con nastro di rame. Assicurarsi che il nastro di rame è adeguatamente contattando il piano di messa a terra in modo che non si verifichino accumulo di cariche. Inoltre, la zona di esposizione deve avere una distanza di almeno 1 cm maggiore della dimensione del sito di trattamento desiderato.
   4. Termocamera posizione IR in modo che il tumore e zona di trattamento sono visibili. Attivare RF per 5 min. Registrare la curva della temperatura risultante. Se la terapia raggiunge temperature superiori a 42 ° C per trattamenti fermata immediatamente.
4. 1. Dopo l'esposizione RF recuperare i topi dall'anestesia in una camera calda fino a quando non sono coscienti.
   2. Ripetere l'esperimento con la stessa topi 48 ore più tardi (punti 3.3.1 - 3.4.1).
   3. Dopo l'esperimento, i topi eutanasia secondo protocolli e procedure istituzionali. Registrare il peso del tumore. Per l'analisi istologica fissare i tumori con formalina e incorporarli in paraffina. Sezioni tumorali sono in genere macchiati spiritoh ematossilina e eosina e di obiettivi rilevanti per misurare l'efficacia terapeutica, ad esempio Ki-67, spaccati caspasi-3, ecc.

Risultati

1. Valutare il riscaldamento RF NP colloidi: AuNPs come esempio.

Dopo aver seguito la sezione 1.1 - 1.2.3 aspettano di avere una soluzione stabile, e purificato altamente concentrata su 5 nm e 10 nm AuNPs diametro. Dai 500 ml as-acquistato soluzione madre, si aspettano di ottenere almeno 4 ml di soluzione ad una concentrazione di 1000 mg / L. La differenza in ore tra i AuNPs e la soluzione tampone acqua DI sfondo a questa concentrazione dovrebbe essere ~ 0,25 ° C / sec e 0,1 ° C / sec per 5 n...

Discussione

Questi protocolli consentono sperimentatore analizzare compiutamente la misura in cui nanomateriali (in questo caso AuNPs) può aumentare ipertermia indotta da radiofrequenza per il trattamento del cancro. Il primo protocollo si occupa specificamente di analizzare la produzione di calore da campioni AUNP altamente concentrato e purificato. Sebbene altri gruppi hanno riportato la produzione di calore principalmente dai buffer che le AuNPs sono sospesi e non gli stessi AuNPs ^9-11, i loro sistemi RF utilizzate c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer