JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג II Δku80 זנים של Toxoplasma gondii כדי לייצר ביעילות מחיקות גן ממוקדת והחלפות גן לאנליזה גנומית תפקודית.

Abstract

מניפולציה גנטית ממוקדת באמצעות הומולוגי רקומבינציה היא שיטת בחירה של אנליזה גנומית תפקודית לקבל תצוגה מפורטת של תפקוד גן והפנוטיפ (ים). הפיתוח של זנים מוטנטים עם מחיקות ממוקדות, מוטציות גנטיות ממוקדות, תפקוד גן כהשלמה, ו / או גנים מתויגים מספק אסטרטגיות חזקות כדי לטפל בתפקוד גן, במיוחד אם מניפולציות גנטיות אלה יכולים להיות ממוקדות ביעילות למוקד הגן של עניין באמצעות תיווך אינטגרציה על ידי לחיצה כפולה לחצות הומולוגי רקומבינציה.

בשל שיעור גבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה, אנליזה גנומית התפקודית של Toxoplasma gondii היה מוגבל בעבר על ידי העדר שיטות יעילות למיקוד מחיקות גנים והחלפות גן ללוקוסים גנטיים ספציפיים. לאחרונה, ביטל את המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II זנים של ט gondii ידי מחיקת encodin הגןגרם החלבון 1,2 KU80. את Δku80 הזנים להתנהג כרגיל במהלך tachyzoite (אקוטי) וbradyzoite (כרוני) שלבים במבחנה ובחי ולהציג למעשה תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה. זני ku80 Δ לעשות מחקרים גנומיים פונקציונליים אפשריים בגן היחיד, כמו גם בקנה מידת הגנום 1-4.

כאן אנו מדווחים שיטות לשימוש בסוג זה אני וזנים מסוג II Δku80Δhxgprt לקדם גישות המתמקדות בגנים ב ט gondii. אנו מתארים שיטות יעילות להפקת מחיקות גנים, תחליפי גנים, וגנים מתויגים על ידי החדרה או מחיקה ממוקדות של הסמן (HXGPRT) phosphoribosyltransferase hypoxanthine-xanthine-גואנין לבחירה. הגן תאר מיקוד פרוטוקול יכול לשמש במגוון רחב של דרכים בΔku80 זנים לקדם ניתוח פונקציונלי של הגנום הטפיל ולפתח זנים יחידים שנושאיםמרובים ממוקד מניפולציות גנטיות. יישום שיטה זו גנטית והמבחנים פנוטיפי הבאים יחשוף היבטים בסיסיים וייחודיים של הביולוגיה של ט ' gondii ופתוגנים אנושיים משמעותיים נלווים הגורמים למלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Introduction

Toxoplasma gondii הוא טפיל שלעתים קרובות protozoan תאי מחייב שכיח וכרוני מדביק מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם 5. ההערכה היא כי יותר מ 1 מליארד בני אדם כיום ונגוע כרוני על ידי פתוגן זה. בנוסף לחשיבות של מחלה הנגרמת על ידי ט gondii זיהום, הזמינות הגוברת של כלים ניסיוניים, משאבי גנומיקה עוצמה 6, קלה בצמיחת מבחנה ומודלי עכבר מצוין עשה ט gondii מערכת מודל מוביל למחקר הרחב יותר של פתוגנים אוקריוטים תאיים וטפילי apicomplexan משמעותיים אחרים הגורמים למחלות הרסניות כגון מלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. מגבלה משמעותית של Toxoplasma gondii כאורגניזם מודל כבר לא יעילה ההתאוששות של צאצאים שנושאים ממוקדות מניפולציות גנטיות. זה probleמ 'במיקוד גן בשל תדירות נמוכה של הומולוגי רקומבינציה יחסית לתדר הגבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה בזני הבר מסוג של ט gondii גם כאשר ה-DNA הומולוגיה נרחבת ניתן במולקולות מטרת דנ"א המשמשים במחקרים גנטיים 2.

לאחרונה חסמו גנטי המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II Toxoplasma gondii זנים של ידי מחיקת גן מקודד החלבון 1,2 KU80. סוג כתוצאה מכך אני וזנים מסוג II Δ ku80 מפגינים שיעורי צמיחה נורמלים, גודל והתנהגות הן במבחנה in vivo במהלך tachyzoite ושלבי bradyzoite במבחנה ובחי, עם זאת, זנים אלה מפגינים בעצם תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה וזה הפנוטיפ מגביר את הסבירות של מהירות צאצאי בידוד רצוי של מניפולציות גנטיות ממוקדות על ידי כמה מאה עד כמה אףUSand פי 1,2,4. השימוש האחרון בקהילה רחבה של סוגים והזנים שאני סוג II Δ ku80 יש ramped באופן משמעותי את הקצב, מגוון, כמו גם את שיעור ההצלחה של גישות גנטיות ממוקדים בט gondii 1-4,8-13. כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף לממוקד מחיקת גן, החלפת גן, ותיוג גן בזני Δ ku80 של ט gondii. נדגים לנו כיצד לעצב ומהימן למקד מניפולציות גנטיות לגנים ספציפיים או לוקוסים גנטיים בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii.

Protocol

1. גן המיקוד למחוק גן של עניין

פרוטוקול זה מיועד לדור יעיל של זן מוטציה שיש מחיקת גן ממוקדת בלוקוס גנטי מוגדר. ט שתואר קודם לכן סמן gondii hypoxanthine-xanthine-גואנין phosphoribosyltransferase (HXGPRT) לבחירתו נעשה שימוש בפרוטוקול זה להכנסת סמן בטוחה ואמינה בעקבות חומצת mycophenolic וxanthine (MPA + X) מבחר 14-16. פרוטוקול זה משתמש בשיטת אימות וחסכונית לבניית מולקולות DNA מיקוד המבוססות על שמרי שיבוט recombinational 17,18. כמה פרוטוקולים חלופיים זמינים מסחרי לבניית מולקולות מיקוד רקומביננטי באמצעות שיטות שיבוט recombinational חיידקים, שיטות מבחנה recombinational שיבוט, או איחוי ה-PCR. הפרוטוקול המתואר להלן מספק את היעילות והאמינות הגבוהה ביותר הכוללים של מחלים משובטים פסקאותITES בעלי מחיקת גן ממוקדת בזני Δ ku80 של ט gondii.

1.1 הכנת מיקוד DNA

  1. גש 6 ToxoDB (http://www.toxodb.org) להשיג רצפים גנטיים לגן של עניין (GOI).

הערה: יש לקבל רצפי גנום מסוג I, II או רצף הגנום III במסד הנתונים, כי הוא קרוב ביותר למתח להיות מניפולציות ToxoDB. לדוגמה: GT1 לר"ה וME49 לPru.

  1. פריימרים ספציפי חפיפה עיצוב שמעצימים את 5 'ו 3' צלעות מיקוד הגנומי של הגן של עניין (GOI) הכוללים 33 נ"ב חפיפה עם מעבורת שמרי וקטור pRS416 (או לחלופין pRS426) ולשלב 33 נ"ב חפיפה עם הסמן לבחירה ( HXGPRT) (איורים 1 א '-B). הוסף אתר אנזים הגבלה ייחודי בכל צבע יסוד בשני הקצוות של 5 'אגפים 'ND 3 הגנומי מיקוד, להציב בין 33 נ"ב והחפיפה T. רצף פריימר gondii ספציפי (ים) (איורים 1 א '-B).

הערה: יותר מ -30 נ"ב חפיפה נדרשת לשיבוט רקומבינציה שמרים יעיל. אגפי מיקוד הגנומי 5 '3 ו' נועדו להגביר את שברי DNA ספציפיים בין 800 ל -1,400 נקודות בסיס המגדירים את מחיקה ממוקדת. להיות מודע לכך שצלעות קצרות יותר באופן משמעותי להפחית את המיקוד ביעילות Δ Δ ku80 hxgprt רקע 2.

  1. PCR להגביר 'אגף היעד באמצעות פריימרים F1 וR1, וPCR להגביר 3' 5 אגף היעד באמצעות פריימר F2 ו R2 (איורים 1 א-C) מהדנ"א הגנומי 3. בנפרד, PCR להגביר ~ 2 HXPGRT גן KBP כולל משויך 5 'ו 3' dhfr איגוף אזורים של קלטת pminiHXGPRT cDNA HXGPRT 14 באמצעות פריימרים HXF וHXR(איורים 1 ב-C).

שים לב: Amplify אגפי היעד באמצעות הדנ"א הגנומי מהלחץ של ההורים להיות transfected.

הערה: הנח את סמן HXGPRT בכיוון קדימה ביחס ל5 'ו 3' DNA מיקוד אגפים כדי להקל על מניפולציות גנטיות יעילות שלאחר מכן, כגון ההסרה ממוקדת של HXGPRT מהלוקוס המשובש.

  1. ודא גדלי מוצר PCR נכונים על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ולהעריך את ריכוז ה-DNA שבר שימוש בתקני ג'ל agarose או שיטה אחרת לקביעת ריכוז ה-DNA.
  2. צור aliquots שמרים מוסמכים כפי שתואר בGietz וSchiestly 17.
  3. שלב 50 ng של 5 'אגף מיקוד גנומי, 50 ng של 3' אגף מיקוד גנומי, 100 ng של סמן בחירת HXGPRT, ו50 ng של וקטור הסעות לינארית עם סטרילי H 2 O על מנת להשיג נפח סופי של 10 -20 μl. להפוך שמרים מוכשרים עם שלושה מוצרי ה-PCR ושמרים-E. וקטור מעבורת coli לשיבוט recombinational באמצעות הפרוטוקול שתואר על ידי Gietz וSchiestly 17. צלחת הפכה שמרים על צלחות אגר בינוניות מינימאליות אורציל מינוס ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים.

הערה: ההרכבה של הורה, "אגף היעד, סמן HXGPRT, ו3 'פלסמיד 5 אגף היעד היא הקל על ידי החפיפה מהונדסות 33 נ"ב בין קטעי דנ"א (איורים 1 א'-B) ומתווכת על ידי הומולוגי רקומבינציה ב שמרים.

  1. שמרי קציר על ידי הוספת 2 מ"ל של YPAD 2x לצלחות אורציל מינוס ומגרד בעדינות כדי לסלק מושבות מבלי לשבש את אגר. צנטריפוגה פתרון השמרים במשך 5 דקות ב 5000 XG וזורקים supernatant.
  2. Resuspend שמרים גלולה ב 250 μl של מאגר המכיל resuspension RNaseA ולהוסיף 50 - 100 μl שלחרוזי זכוכית CID שטופים לפתרון. מערבולת במשך 5 דקות במהירות הגבוהה ביותר כדי לרסק את תאי שמרים.
  3. לאפשר לחרוזי הזכוכית להתיישב לחלק התחתון של הצינור ולהעביר את supernatant לצינור 2 מיליליטר אפנדורף.
  4. לבודד את ה-DNA שמרים באמצעות ערכת בידוד DNA miniprep, resuspending בנפח סופי של 100 ~ μl.
  5. מערבבים את 2 ה-DNA שמרי μl (~ 50 ng) עם 40 μl של DH10B electroporation המוסמכת א coli שמר על קרח.
  6. מעבירים את הפתרון לפער קובט 2 מ"מ צונן electroporation וelectroporate התאים חיידקיים ב2.4 ק"ג וולט ו129 Ω.
  7. תאי הצלה על ידי הוספת 0.8 מיליליטר מרק SOC לכל פתרון העברה לצינור פלקון Snap-כובע 14 מ"ל קובט ו. דגירה תאים ב 37 ° C על תוף גלגלת ל40 - 60 דקות.
  8. צלחת ה coli על 2XYT + אמפיצילין (AMP) צלחות ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. בחר ~ 6 - 8 מושבות אחת ולגדול ב3 מ"ל 2XYT + AMP ל~ 16 שעות ב 37 ° C.
  10. הכן את 30% מניות מקפיא גליצרול של כל א שיבוט coli.
  11. לבודד pΔGOI פלסמיד מE. השיבוטים coli באמצעות ערכת miniprep, resuspending בנפח סופי של 100 ~ μl.
  12. לאמת pΔGOI באמצעות אנזים הגבלה מעכל למדוד את גודל פלסמיד דנ"א ולאמת את ה-DNA pΔGOI הצפוי פסי דפוסים.
  13. לסיים אימות של pΔGOI על ידי רצפי DNA של אגפי מיקוד גנומית כדי לאמת את רצף ה-DNA 100% המבוססים על נתונים שרצף הגנום ב5 '3 ו' http://www.ToxoDB.org.

הערה: הומולוגיה ברצף כמעט מושלם הוא חיונית למקסם את יעילות גן מיקוד 3 שכן כל הבדל זוג בסיס מהווה קיצוץ מקביל באורך של הומולוגיה מושלמת.

הערה: רצף הגנום של זן Δku80 סוג II המבוסס על Pru ההורי stגשם אינו זמין בשלב זה. עבודה זו משתמשת ברצף הגנום סוג II ME49 כגנום הפונדקאי עבור הזן מסוג II Δ ku80. בהתבסס על נתונים ברצף במספר הלוקוסים גנטיים, הערכה הוא שהגנום ME49 והגנום Pru תערוכת פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד בתדר של ~ 1 לכל 10,000 נוקלאוטידים, או פחות.

  1. צור> 200 מיקרוגרם של מניית pΔGOI ידי inoculating ~ 2XYT + תרבות לילה מיליליטר AMP 250 עם מניות גליצרול מה תוקף שיבוט miniprep coli.
  2. בודד פלסמיד דנ"א pΔGOI מהתרבות הגדולה באמצעות ערכת בידוד DNA maxiprep, resuspending בנפח סופי של ~ 1,000 μl.
  3. חזור על אנזים הגבלה מעכל, או רצפי DNA של pΔGOI maxiprep DNA כדי לאמת את מולקולת הדנ"א המיקוד הנכונה לפני transfection.
  4. Linearize ~ pΔGOI מיקרוגרם 15 ב '5 סוף משתמש באנזים ההגבלה הייחודי X (RE.X)אתר בנוי לעכל לתוך אגף '5 היעד (האיורים 1B).

הערה: גן המיקוד בט gondii דורש מינימום של ~ 10 מיקרוגרם של ה-DNA כדי להשיג מיקוד יעיל של מיקוד תדירות אירועים במוקד הגן של עניין 2.

  1. לאמת ינאריזציה של pΔGOI ולקבוע את ריכוז ה-DNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose או שיטה חלופית.

הערה: אם מערכת העיכול אנזים הגבלה ב5 'אגף לא יניב ינאריזציה מלאה, 3 תוכננו "אתר הייחודי RE.Y לעכל יכול לשמש כאתר חלופי לינאריזציה של pΔGOI.

הערה: מולקולת הדנ"א מיקוד לינארית לחלוטין היא חיונית להצלחת גן המיקוד ידי הומולוגי רקומבינציה בזני ku80 Δ.

  1. לנטרל את אנזים ההגבלה על ידי incubating ב 68 מעלות צלזיוס למשך 15 - 20 דקות.
  2. להכין לפחות 15 מיקרוגרם של פלסמיד לינארית ב100 μl של סטרילי H 2 O. החנות לינארית pΔGOI ב -20 ° C עד למועד transfection.

1.2 הכנת ט טפילי gondii, transfection, בחירה, subcloning, אימות, ארכיונים ותחזוקה של זני מניפולציות גנטית

שיטות כלליות לתרבות ולמניפולציה של ט gondii ב( HFF) פיברובלסטים תאי עורלת אדם מתואר 19-21. זני Δ Δ ku80 hxgprt לשכפל בדרך כלל במדיום זיהום טפיל (מדיום חיוני נשרים מינימאלי (EMEM) מדיום גידול בתוספת 1% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% מדילול מניות 100x antimycotic-אנטיביוטי) 1,2. יש לבצע את כל העבודה עם gondii Toxoplasma באמצעות בטיחות ביולוגית ברמת 2 נהלים. ט gondii RHΔ ku80 2 לקלףזן ntal נוצר מזן RHΔ hxgprt ממעבדת רוס 14. זן PruΔku80 1 ההורי נוצר מPruΔhxgprt (Pru זן gniaud BSG-4 22) המכיל סמן יציבות משולב CAT בחירה וחלבון (GFP) כתב ניאון ירוק תחת השליטה של אמרגן LDH2 הספציפי bradyzoite הבמה.

  1. לחסן ס"מ בקבוק 25 2 המכיל תאי HFF מחוברות עם 1 x 10 6 סוג קיימא אני טפילי hxgprt Δ Δ ku80 RH, או לחסן שתי 25 ס"מ 2 צלוחיות עם 2 x 10 6 קיימא סוג II Prugniaud (Pru) טפילי Δ Δ ku80 hxgprt.

הערה: טפילי קיימא מוגדרים כטפילים תאיים שזה עתה lysed החוצה.

הערה: בקנה מידה זה מספק מספר מספיק של טפילי קיימא עבור שלושה ניסויי transfection.

  1. בדוק את התרבויות נגועות Δ Δ ku80 hxgprt ~ 68-72 שעות לאחר הזיהום. לאמת את הנוכחות של טפילי קיימא ו~ 90 - תמוגה 95% מתאי HFF לתכנן את העיתוי המדויק של transfection.

הערה: הבידוד של טפילים טריים egressed הוא חיוני להצלחתו של פרוטוקול זה בגלל כדאיות טפיל נמוכה תבטל מיקוד גן יעילות.

  1. להתסיס טפילי קיימא לפתרון על ידי סגירת המכסה התוספת החותם על בקבוקון 25 ס"מ 2 במרץ ולנער את הבקבוק קדימה ואחורה כדי להתסיס את הטפילים מעל פני השטח ללא צמיחה מתיז נוזל על החלק הפנימי של המכסה או הצוואר של הבקבוק .

הערה: טפיל קציר אינו דורש פרוטוקול שחרור מזרק מחט לסוג I אוהקלד זנים השני Δ ku80.

  1. מעבירים את פתרון הטפיל למזרק 10 מ"ל מצורף למחזיק מסנן המכיל קרום מיקרומטר 3 ולמקם את יחידת המסנן בחלק העליון של צינור פתוח 15 מיליליטר הברגה כובע. מזרק לסנן את הטפילים לתוך צינור הברגה כובע 15 מ"ל.

הערה: סינון הטפילים דרך הקרום מסיר תאים נגועים ופסולת תאיים.

  1. קבע את ריכוז הטפיל (צורות tachyzoite לכל מ"ל) באמצעות hemocytometer.

הערה: אופציונלי: שימוש בפתרון הטפיל, הקים ויצרה יחידת לוחית (PFU) assay 21 שיהיה לקרוא 7 - 8 ימים לאחר מכן כדי לקבוע כדאיות נאותה של טפילי transfected (PFU לtachyzoite יחס ≥ 0.2).

  1. טפילים כדוריים ל7 דקות ב 1400 XG ולשאוב supernatant ל~ 0.4 מ"ל מבלי להפריע גלולה הטפיל. ספין למשך 2 דקות ב1,400 XG ולשאוב supernatant שנותרו ל~ 0.01 מ"ל מבלי להפריע גלולה טפילה.
  2. Resuspend גלולה הטפיל על ידי מצליף התחתון של הצינור ולהוסיף מייד cytomix חיץ 23 (1.33x ריכוז) לגלולת הטפיל להשיג ריכוז טפיל של 4 - 5 x 10 7 / טפילי cytomix מ"ל.

שימו לב: השמט תוספת של ה-ATP וגלוטתיון לcytomix מאז תוספות אלה לא לשפר את היעילות של גן המיקוד.

  1. הפשירי aliquot μl 100 של pΔGOI ינארית מפרוטוקול 1.1 (שלב 26).
  2. העבר 0.3 מ"ל של פתרון cytomix הטפיל (~ 1.3-1.6 x 10 7 טפילים) ל100 μl של ינארית pΔGOI מהפרוטוקול 1.1 (שלב 26), ולהעביר את כל 0.4 מיליליטר הטפיל + תמהיל pΔGOI מייד לפער מ"מ 2 צונן electroporation קובט.
  3. Electroporate הטפילים ב1.4 קילו וולט ו24 Ω.
  4. מיללא קובט transfection בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ~ לאחר מכן להעביר את כל התוכן של קובט transfection לתוך בקבוק 150 ס"מ 2 המכיל תאי HFF מחוברות עם 30 מיליליטר מדיום זיהום ודגירת התרבות נגועה בן לילה.
  5. בחירה להתחיל בחומצה mycophenolic + xanthine (MPA + X) ~ 20 שעות לאחר transfection (איור 2 א) על ידי החלפת מדיום הזיהום עם MPA + X בינוני בחירה (MPA (25 מיקרוגרם / מ"ל) וxanthine (50 מיקרוגרם / מ"ל) ב בינוני זיהום).

הערה: נא לא להפריע MPA הדגירה + X בקבוקון בחירה.

  1. להעריך את המספר הכולל של PFUs בMPA + X בקבוק מבחר ~ 8 ימים לאחר transfection על ידי בדיקה ויזואלית השכבה. לוודא את נוכחותו של פיתוח אזורי PFUs ובריאים של זיהום על ידי מיקרוסקופ אור.

הערה: אם הפלאק אינו גלוי ליום 8, לשמור את הבחירה ולפקח על סימנים של להדביקמאז יון זנים מוטנטים יכול להיות שיעור כפול מופחת.

הערה: יש את זני הטפיל ku80 Δ Δ hxgprt רקע נמוך ביותר של אירועים בלתי רצויים nontargeted, המאפשר לבידוד המוצלח של זנים מוטנטים עם חמור למדי, אבל פגמי צמיחה לא קטלניים. אם גן הוא חיוני ולא ניתן למחוק אותו, transfection הראשונית, או עבר אוכלוסיית טפיל לאחר מכן, עשויה לחשוף פנוטיפ שבו הטפילים יפסיקו לשכפל במהלך הבחירה כאוכלוסייה מחליטה knockouts ממוקד.

  1. לנער את הבקבוק כמו בשלב 3 כדי לסלק טפילים תאיים מmonolayer [אחרי לוחות גלויים פיתחו] כדי ליצור פתרון טפיל. העברה ~ 0.5 מ"ל של פתרון הטפיל מMPA + X בקבוקון בחירה ל25 ס"מ 2 MPA + X בקבוקון המכיל מבחר תאי HFF מחוברות (לייעד זו התרבות לעבור 1A).
  2. לעקור טפילS ב150 ס"מ המקוריים 2 MPA + X בקבוק מבחר ~ 3 ימים לאחר מכן והעברה ~ פתרון טפיל מ"ל 0.5 ל 25 ס"מ שני MPA 2 + X בקבוקון המכיל מבחר תאי HFF מחוברות (לייעד 1B לעבור התרבות זו).
  3. תאפשר אזורים של זיהום לפתח במעבר 1A ו / או להעביר לצלוחיות 1B ~ 5 ימים. מבחינה ויזואלית לאמת על ידי מיקרוסקופ אור שעוברים וצלוחיות 1A 1B להכיל מינימום של 25 PFUs קיימא עם אזורים בריאים של זיהום.
  4. לבחור או לעבור או בקבוק 1A 1B לעבור למעבר בהמשך MPA + X בינוני בבחירת 25 ס"מ 2 צלוחיות. לשמור על מעבר תחת MPA + מבחר X.

הערה: טפילים חייבים להיות מתורבתים עבור מספר מספיק של דורות כדי למחוק episomes מתמיד nonintegrated מהאוכלוסייה לפני subcloning. אל תבצע subcloning לפני 20 ימים לאחר transfection לסוג שאני RH Δ Δ ku80 hxgprt, או לפני 25 ימים לאחר transfection עבורטפילים מסוג II Pru Δ Δ ku80 hxgprt כדי לאפשר מספיק זמן כדי לדלל episomes nonintegrated 1,2.

  1. טפילי subclone במגש 96, גם המכיל תאי HFF מחוברות עם MPA + X בינוני בחירה. להכין מגש אחד בריכוז של טפיל 1 / טוב ומגש שני בריכוז של 2 טפילים / כן.

הערה: טפילי subclone שlysed לאחרונה (~ 90 - 95% מתאי HFF בבקבוקון 25 ס"מ 2) כדי להבטיח שיש לי טפילי כדאיות גבוהה.

הערה: מסגרת הזמן האופטימלית לאחר transfection לsubcloning הוקמה על ידי מדידת מהירות איך מתעוררים טפילים ממוקדים בהצלחה בתדירות גבוהה באוכלוסייה 1 שנבחרה.

  1. המשך למעבר האוכלוסייה העיקרית של טפילי transfected בMPA בינוני + מבחר X באמצעות לוח הזמנים של מעבר שבועי של הדבקה בקבוקון 25 ס"מ 2 HFF עם 10 μl של הפתרון הטפיל.

הערה: אם שיבוטים נושאים את מחיקת הגן ממוקדת (knockouts) אינם מתקבלים מsubcloning הראשון בשלב 18, resubclone את הטפילים מהאוכלוסייה נשמרה ברציפות ~ 10 - 12 שבועות שלאחר transfection.

הערה: אחת סיבות מחיקת גן לא מתקבלת נובע מהתמדת episomal של כמה פלסמידים pΔGOI. התמדת Episomal נקבעה על ידי הרצפים הכלולים ב5 'ו3' חביות מיקוד גנומית, ולא תופיע לנבוע מהמרכיב הגנטי HXGPRT. כ 5 - 10% מפלסמידים מיקוד מפגינים התמדת episomal משמעותית שמחייבת זמן של subcloning מאוחר יותר כדי לאפשר לאוכלוסיית טפיל מספר מספיק של פעמים דור לדלל את episomes מתמיד ולפתור את האוכלוסייה לintegrants היציב בעיקר.

    t = "20">
  1. ציון 96, גם מגש 6 - 7 ימים לאחר subcloning (סוג I טפילים) או 7 - 8 ימים לאחר subcloning (טפילים מסוג II) לבארות המכילים PFU יחיד שנוצר כאזור אחד של זיהום במיקרוסקופ אור ב או 40X או כוח 60x. סמן נקודה קטנה על מכסה מגש 96, גם לייעד את המיקום של PFU בבאר.
  2. מערבבים את התוכן של כל המכיל גם PFU יחיד באמצעות פיפטה נקבעה על 50 μl (200 טיפ μl) על ידי הפניית זרימת נוזל מעל PFU לפזר טפילים בבאר.

הערה: ערבוב גם מאיץ תמוגה טפיל של monolayer HFF. סוג I זני RH יהיה lyse גם ~ 4 ימים לאחר ערבוב, טפילים מסוג II Pru יהיה lyse גם ~ 5 ימים לאחר הערבוב.

  1. בחר תריסר lysed בארות (שיבוטים) ושריטה בחלקו התחתון של כל אחד מאלה באמצעות בארות lysed 0.5-10 קצה פיפטה μl בה בעת ציור, עד 6 μl של פתרון טפיל. טרנסfer 6 μl של פתרון לטפיל גם במגש 24 גם מכיל תאי HFF מחוברות ב1 מ"ל MPA + X בינוני בחירה.

הערה: זה חיוני כדי לגרד את תחתית הבאר כדי לשמור על הפתיחה נשאה מקצה פיפטה במגע מתמיד עם טפילים הנמצאים בתחתית הבאר.

  1. לפקח על המגש 24 גם לתמוגה של תאי HFF.

הערה: סוג I טפילי RH יהיה בדרך כלל lyse גם בפורמט 24 גם ב~ 4 ימים. טפילים מסוג II Pru יהיו בדרך כלל lyse גם ב~ 5 ימים.

  1. העבר 2 μl של פתרון טפיל קיימא גרד מהתחתית של כל טוב בפורמט 24 גם לרווחת המקבילה מגש 24 גם חדש המכיל תאי HFF מחוברות ו1 מיליליטר MPA + X בינוני בחירה בכל טוב.

הערה: כל השיבוטים וקווי הטפילים יכולים להיות ברציפות עיקרימזרקה על ידי העברת 2 μl של פתרון בר קיימא טפיל כל 7 ימים בפורמט מגש 24 גם זה.

  1. ודאו שטפילים הועברו בהצלחה למגש 24 גם חדש על ידי בדיקה ויזואלית עם מיקרוסקופ אור ~ לאחר חלוף 18 שעות.
  2. טפילי אסיף מבארות lysed של מגש 24 גם מצעד 23-24 או באמצעות 1 מ"ל או 10 מ"ל פיפטה ולהעביר את הפתרון לטפיל צינור Eppendorf.
  3. גלולה הטפילים ב1,400 x גרם במשך 7 דקות, לשטוף פעם בפוספט מיליליטר 1 נאגרו מלוח (PBS), ושוב בגלולה 1,400 x גרם במשך 3 דקות.
  4. לשאוב PBS מהגלול, לאחר מכן להוסיף 200 μl של PBS לגלולה לresuspend את הטפילים. להקפיא את פתרון הטפיל ב -80 ° C עד בידוד ה-DNA.
  5. לבודד את ה-DNA טפיל משיבוט באמצעות minikit בידוד DNA רקמות.
  6. לאמת את מחיקת הגן הממוקדת (נוק אאוט) על ידי ה-PCR באמצעות פריימרים אימות הנתונים (2A-C). מבחןהעדרו של אזור הקידוד הפונקציונלי של הגן של עניין ושימוש CxF מעלה הזרם ומורד זרם צילום חזה פריימרים DNA הגנומי (איורים 2A-B) בדיקה לנוכחות של מוצרי ה-PCR כי ההיקף האגפים הגנומי המיקוד וHXGPRT להפגין נכון 5 'ו 3 'ממוקד אינטגרציה של גן HXGPRT למוקד הגן נמחק.

הערה: צבעי יסוד לאימות חייב להיות ייחודיים לגן של עניין או תוצאה חיובית כוזבת ניתן להשיג. עיצוב פריימר יכול להיות מאומת על http://www.toxodb.org על ידי פיצוץ רצפי פריימר לגנום (ים) כדי לאמת פריימרים ייחודיים.

  1. שיבוטים טפילים מעבר בלוח זמנים שבועי כמתואר בשלב 24. לאחר המחיקה הממוקדת אומתה, בחירה המתמשכת בMPA + X היא אופציונלית.
  2. שיבוטים ארכיון טפיל על ידי הכנת מניות מקפיא. טפילים תאיים גלולהמתאי HFF lysed ב25 ס"מ 2 בקבוק תרבות, תקשורת ולהסיר בעדינות resuspend טפיל גלולה במדיום הקפאת תרבית תאים בריכוז טפיל> 4 x 10 7 טפילים לכל מ"ל. העבר aliquots לcryovials וטפילים בחנות ללא הגבלת זמן בחנקן נוזלי, או ב -80 ° C.

2. מחיקה של HXGPRT

פרוטוקול זה מיועד להסרת סמן HXGPRT מהאתר של השתלבותו בגנום של זן מניפולציות גנטית Δ ku80. הסרת HXGPRT מאפשרת התאוששות סמן והדור של זנים עם מניפולציות גנטיות מרובות באמצעות בחירות בלבד המבוססות על HXGPRT 1-3. בעוד הפרוטוקול המפורט להלן מתאר את השיטה כדי למקד מחדש את מוקד למחוק HXGPRT, יש לציין שהסרת HXGPRT במוקד הגן של עניין גם מאפשרת שילוב מחדש בו זמנית של הגן פראי הסוג (גomplementation), אינטגרציה מחדש של גן המוטנטי, כמו גם אינטגרציה מחדש של גן מתויג (N-או C-מסוף ה-GFP, HA תג, וכו ',), המאפשרת מגוון רחב של מניפולציות גנטיות. את מנגנוני פעולה ו24 מיקוד פרוטוקולים באמצעות בחירות 6 thioxanthine כבר תאר 1-3,15 בעבר.

2.1 מחיקה HXGPRT

  1. בלו הסמן לבחירת HXGPRT מpΔGOI על ידי לעכל עם RE.Z לחתוך באתרי אנזים ההגבלה הייחודיים איגוף HXGPRT (איור 1).
  2. ודא עיכול של DNA מלא על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. בודד גדול יותר של שתי הלהקות מג'ל agarose.

הערה: הגדול של שתי הלהקות מכיל פלסמיד יחד עם אגפי יעד DNA 5 '3 ו', אך לא את גן HXGPRT.

  1. הנח את סעיף agarose המכיל את להקת ה-DNA הגדולה בשוכב טור ספיןגרם שטוחה ג'ל על הממברנה. ספין העמודה ב13,000 x גרם במשך 4 דקות ב RT. הוסף סטרילי H 2 O לזרימה דרך להביא את הנפח ל -100 μl.

הערה: שיטות מסחריות אחרות זמינות לבודד DNA מagarose.

  1. תתרכז-DNA על ידי הממטרים EtOH, resuspending DNA בנפח סופי של 18 μl סטרילי H 2 O.
  2. מערבבים μl 1 של ה-DNA המרוכזת עם 7 מ"ל H 2 O, קשירת חיץ 10x μl 1 ו 1-DNA האנזים T4 μl (5 יחידות) ואת מקום התגובה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לייצר pΔGOIc (pΔGOIclean) (איור 3 א).

הערה: יכולים להיות מתוכננים ברי DNA עם קצות DNA המכילים RE.Z וכללו בשלב זה כדי ליצור פלסמידים המתאימים לשילוב מחדש ממוקד של הגן פראי הסוג (שלמה), ממוקד אינטגרציה מחדש של גן המוטנטי, כמו גם ממוקד שילוב מחדש של גן מתויג(N-או C-מסוף ה-GFP, HA תג, וכו ').

  1. לדלל את 2x התגובה עם סטרילי H 2 O לפני electroporation.
  2. להפוך לpΔGOIc E. coli כמו בפרוטוקול 1.1 לsubclone, לבודד, ולאמת את הפלסמיד מיקוד. אז linearize pΔGOIc לקראת transfection (ראה שלבים 1.1.11 ל1.1.26).
  3. חזור על פרוטוקול transfection הטפיל כפי שתואר בפרוטוקול 1.2 (שלבי 1 עד 11).

הערה: לפני ביצוע צעדים 1 עד 8, ודא שהסרה ממוקדת של HXGPRT אינו ריאלי בזן המוטציה. להדביק ס"מ בקבוק 150 2 תאי HFF מחוברות עם 1 x 10 6 tachyzoites של זן המוטציה באמצעות מדיום בחירה (200 מיקרוגרם / 6TX בזיהום בינוני מ"ל) ומניח את הבקבוק בassay PFU 6 thioxanthine (6TX). בדוק את הבקבוק 8 ​​ימים לאחר מכן כדי לוודא שאין (או מעט מאוד; <10) PFU גלויים, שהוא חיוני כדי לקבוע, כי potenגן Tial מיקוד יעילות יעלה בכל חזרה ספונטני פוטנציאל של הזן מוטנטי לפנוטיפ עם ביטוי HXGPRT מופחת (פנוטיפ התנגדות 6TX).

הערה: כ 5 - 10% מאתרי האינטגרציה HXGPRT תערוכת תדר משמעותי וספונטני של התנגדות 6TX למרות שסמן HXGPRT משולב עדיין באתר הממוקד (ראה סעיף נציג תוצאות להסבר).

  1. בגין בחירת 6TX ~ 20 שעות לאחר transfection על ידי שינוי הבינוני בבקבוק 150 ס"מ 2 עד בינוני בחירת 6TX.

הערה: נא לא להפריע את הבקבוק ל~ 10 ימים לאחר transfection.

  1. בדוק את הבקבוק להיווצרות PFU ביום 10 - לאחר transfection 12 (סוג I טפילים) או יום 10 - 16 לאחר transfection (טפילים מסוג II).

הערה: Parasites להיות ממוקדים למחיקה של HXGPRT לא יתחיל לגדול תחת בחירת 6TX עד הגן וmRNA HXGPRT נמחק, וחלבון HXGPRT שיורי הוא מובטל.

  1. לנער את בקבוק הבחירה כדי ליצור פתרון טפיל, והעברת 0.5-1.0 מ"ל של פתרון הטפיל לבקבוק 25 ס"מ חדש 2 המכילים תאי HFF מחוברות ו5 בינוני בחירת 6TX מ"ל. חזור על ההעברה מ150 ס"מ 2 העיקרי ל2 צלוחיות החדשות 25 ס"מ פעם ביום למשך יומיים נוספים.

הערה: דגימה מרובה מגדילה את הסיכוי של לכידת טפילים ממוקדים קיימא שאיבדו את גן HXGPRT.

  1. בדוק את 25 ס"מ 2 צלוחיות ~ 5 ימים לאחר הדבקה כדי לוודא את נוכחותו של פיתוח PFUs עם אזורים של טפילים משכפלים בריאים. פיק צלוחיות אחד או שתיים המכילות אזורים של זיהום.

הערה: טפילים נמחקו מלשכפל את גן HXGPRT בקצב צמיחה נורמלי בבחירת 6TX.

  1. המשך למעבר הטפילים במדיום בחירת 6TX.
  2. Subclone אוכלוסיית הטפיל לאחר 25 - 30 ימים של בחירה. הגדר את המגש 96, גם אחד עם ~ 1 טפיל / וגם אחר עם ~ 2 טפילים / כן.
  3. הכן את ה-DNA הטפיל משיבוטים מבודדים ולשמור על שיבוטים בתרבות פורמט 24 גם על פי פרוטוקול 1.2 (צעדים 19-29).
  4. לאמת מחיקה של HXGPRT על ידי PCR באמצעות האסטרטגיה שמתואר באיורים 3A-B.

3. תיוג C-מסוף של חלבונים

פרוטוקול זה מיועד לתיוג C-מסוף של חלבונים על ידי מיקוד התג לשילוב באמצעות צלב כפול מעל הומולוגי רקומבינציה בלוקוס הגנומי של הגן באמצעות MPA + X מבחר 2,4. פרוטוקול זה עובד ביעילות, כי "רצף 5 dhfr של HXGPRT סמן הוא אזור תוקף במלוא פונקציונלי "3 מתורגם לגנים אחרים 2,4.

3.1 תיוג C-מסוף ישיר של חלבונים בלוקוסים גנטיים אנדוגניים

  1. מיקוד צור pΔGOItag פלסמיד לבנות באמצעות שיבוט recombinational שמרים (איור 4) ושיטות שתוארו בפרוטוקול 1.1. 5 'אגף מיקוד הגנומי מכיל את 800 עד 1,200 נ"ב האחרון של אזור קידוד (או הדנ"א הגנומי) של GOI, למעט קודון הסיום הוא עבר לעמדת 3' לתג על פי בחירה (ר 'תג, תג Myc, התג שלו , וכו ')
  2. צור החדרה הממוקדת של תג C-המסוף בלוקוס אנדוגני של קידוד חלבון הגן על ידי ביצוע השלבים בפרוטוקול 1.1 ו -1.2 שימוש באסטרטגיה שתוארה (איור 4).
  3. ודא החדרת תג C-המסוף במוקד גן אנדוגני משתמש באסטרטגית ה-PCR.
  4. למקד אותו מחדש לוקוס הגן תוך שימוש בשיטות שתוארו בפרוטוקול 1 ופרוטוקול 2 לדחק הסמן לבחירת HXGPRT ליצור מוקד גן אנדוגני מוסדר דווקא שמבטא חלבון מתויג. פרוטוקול זה גם משחזרת את הסמן לבחירת HXGPRT שניתן להשתמש בו שוב כדי למקד את מוקד אחר בזן המתויג (ראה פרוטוקול 1).

תוצאות

תבנית מפורטת מסופקת לבניית פלסמיד מיקוד למחוק גן, כולל מיקום של אתרי אנזים הגבלה והדור של פריימרים המאפשרים מיקוד גנטי ואימות של גן מיקוד, כמו גם בניית פלסמיד למחיקה הבאה של HXGPRT ב תהליך בשלב יחיד (איורים 1 א-C, איור 2 א, איור 3 א). סכמטי כללית מוצג לביצוע מחיקת גן ממוקד (איור 2 א), לזוגות פריימר משמשים כדי לאמת את המחיקה של נוקאאוט, למשל, אני סוג rop18 (איור 2), ותוצאות מייצגות של אימות PCR מוצגות (איור 2 ג). תוצאת נציג זו מוצגת כדי להמחיש את מגוון רחב של תוצאות שניתן להשיג בלוקוסים גנטיים שקשה יחסית ליעד. מחיקת גן ממוקדת בהצלחה תגרום להיעדרות של הגן של במוצר terest PCR (1 PCR), הנוכחות של 3 'מיקוד אגף גנומית (PCR2), ואת הנוכחות של הסמן לבחירת HXGPRT המשולב כראוי בין 5' צלעות מיקוד הגנומי '3 המגדירות את המחיקה (PCR3 וPCR4) ו . 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9, ו -11 הם תוקף מחיקות גן ממוקדות (knockouts) שבו החליף את HXGPRT GOI (איור 2 ג).

שיבוט שאינו מכיל מחיקת גן יכול להיות מיוצג על ידי מגוון רחב של דפוסי banding. בדרך כלל, שיבוט ללא מחיקת גן יהיה במראה את הלחץ ההורי (דפוס הורי) עם להקות שנצפו לPCR1 וPCR2, אך לא לPCR3 או PCR4 כפי שניתן לראות לשיבוטי 1 ו -2 (איור 2 ג). "דפוס הורי" זה נובע מכמה מנגנונים אפשריים. לפעמים, טפילים עמידים MPA נבחרו לשאת episomes מתמיד nonintegrated של pΔGOI מיקוד פלסמיד, ונציין, כי בחירת המשך לעתים קרובות מאלצת episomes אלהלשלב. אנחנו גם שומרים קצת רקע נדיר בסוג I Δ ku80 מתח בשל שילוב לא מכוון של pΔGOI מיקוד פלסמיד, המכיל cDNA HXGPRT הביע באמצעות אלמנטים של פרומוטר DHFR 5 '3 ו', או למוקד או לDHFR HXGPRT נמחק באופן חלקי לוקוס 14. אמנם האירוע הנדיר הזה הוא שילוב ממוקד, זה לא היה שילוב המיועד ומשמש כנקודת מפתח שיש לזכור בעיצוב כל אסטרטגית החלפת גנים. הומולוגיה-DNA גדול יותר מ -120 נ"ב נשא על pΔGOI המיקוד שלך לפלסמיד עשויה לספק אתר חלופי לרקומבינציה בku80 זני Δ 2 שיכולים לתת בחזרה רקע בלתי רצוי. בסוג הזן השני Pru Δ ku80 רקע זה מצטמצם או לא קיים בהשוואה להקלדה אני משום הסמן לבחירת HXGPRT מבוסס על סוג I רצפים שיש לי פולימורפיזמים נוקלאוטיד בהשוואה עם ה-DNA מסוג II המקטין באופן משמעותי רקע נדיר זו בניסויים בשימוש בסוג השני Pru Δ ku80 זן 1. אם מוקד גן חיוני (לא ניתן למחוק), או שיש גן נמוך מאוד מיקוד תדירות במוקד, או אם מתמיד [nonintegrated] episomes לא בוטל בקלות באמצעות צמיחה ובחירה, דפוס הורי זה ישלוט הדפוס שנצפה בMPA שיבוטים עמידים. לחלופין, מולקולת הדנ"א המיקוד לעתים נצפתה לשלב רק ב 5 'או 3' אגף מיקוד הגנומי ולהקה הוא ציין גם עבור PCR3 או PCR4 (אך לא את שניהם), יחד עם PCR1 וPCR2 כפי שניתן לראות לשיבוט 10 (5 "אינטגרציה) ושיבוט 7 (3 'אינטגרציה) (איור 2 ג). דפוסים אלה מצביעים על התופעה נדירה של צלב יחיד על שילוב של מיקוד פלסמיד במוקד המשלב HXGPRT אבל אינטגרציה ממוקדת זו אינה מוחקת את הגן של עניין. דפוס זה (נתיבים 7 & 10 באיור 2 ג)phasizes הצורך לדווח על נתוני ה-PCR כדי לוודא שהאינטגרציה ממוקדת התרחשה במקום יחידה הומולוגי לחצות ואינטגרציה שנייה nonhomologous של מולקולת המיקוד. לעיתים נדירות, אנו רואים תערובת גנטית מיוצגת על ידי 12 שיבוט (איור 2 ג) שמייצג גם דפוס הורי ודפוס מחיקה ממוקד. דפוס זה ככל הנראה נובע בהזדמנות משני גנוטיפים טפילים שנמצאים באותו המקום בשיבוט היטב.

סכמטי כללית להסרת HXGPRT מΔ ku80Δgoi :: HXGPRT למחוק HXGPRT מהזן מוצג (איור 3 א). זוג פריימר משמש לאימות הסרת HXGPRT מΔ Δ ku80 gra2 :: HXGPRT (איור 3) מגביר ~ להקת KBP 1.2 ייחודית בPCR5 כפי שניתן לראות בשיבוטי 4, 7, 9, 11 ו -12 (איור 3 ג). אם HXGPRT לא הוסר מהלוקוס, ~ 3.4 KBP להקה הוא ציין (1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, 10, ובקרת ההורים). מספר מנגנונים לפעול כדי להפוך את הסרת HXGPRT (6TX בחירה) יותר מאתגר ופחות יעילה מאשר שילוב של HXGPRT (MPA + X מבחר). בחירת MPA היא פשוט יעילה יותר מ6TX בחירת 14,16. בנוסף, רמות גבוהות יותר של ביטוי HXGPRT נדרשות לבחירת 6TX מאשר לMPA בחירות 16,24. כתוצאה מכך, מוטציות שעשויות להפחית את פעילות אנזים HXGPRT או מוטציות או שינויים אפיגנטיים המפחיתים את רמת הביטוי של HXGPRT במוקד של גן עלולים לבטל את האפקטיביות של בחירת 6TX. אפילו עם אתגרים של בחירת 6TX אלה, שיעור ההצלחה של בחירת 6TX בזני ku80 Δ הוא יותר מ -90% בניסיון הראשון 1-3.

תכנית כללית לתיוג C-מסוף ישיר של חלבון קידוד גנים מוצג (איור 4). זהתכנית עושה שימוש באינטגרציה ישירה באמצעות צלב כפול מעל הומולוגי רקומבינציה של HXGPRT 3 'של הגן מתויג ומעסיקה גם אסטרטגיות אימות דומות לאלה שתוארו לעיל. כאשר יש חשד לגן להיות גן חיוני זה ניתן לאמת באמצעות transfection שנייה עם ה-DNA מיקוד באופן עצמאי בודד פלסמיד. שיטות חלופיות, כגון תוכניות לביטוי מוסדר גן, זמינות לאימות נוספת, אם גן הוא חיוני 25.

figure-results-5165
איור 1. סקירה כללית של העיצוב של ה-DNA פלסמיד מיקוד. . סכמטי לעיצוב חפיפה פריימרים המשמשים לPCR להגביר אגפי היעד 5 '3 ו' עם 33 נ"ב חופף לוקטור מעבורת pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. פריימרים המתוארים בסכימה היוהשתמש כדי ליצור את 5 'ו 3' צלעות היעד של pΔROP18 10. אסטרטגיה כוללת לעיצוב ב 'מולקולת הדנ"א מיקוד. עמוד השדרה של pΔGOI הוא אורציל pRS416 מעבורת הווקטור המכיל (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ 1 KBP 5 'אגף יעד DNA מוגבר מהדנ"א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F1 וR1, ~ KBP 3 1' אגף יעד DNA מוגבר מהדנ"א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F2 ו R2 ואת קלטת minigene HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר F1 כדי לחתוך את הפלסמיד ב5 "סוף של 5 'אגף יעד ה-DNA, בRE.Y R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב'סוף 3 '3 אגף יעד ה-DNA וRE.Z בפריימרים R1 וF2 כדי בלו דקות HXGPRTרצפי קלטות igene. ג פריימר השתמשו כדי ליצור את מבנה המיקוד למחיקה של rop18. האזורים המודגשים מתאים לט רצף הגנומי gondii, ואזורי nonbold מתאים לאתרי אנזים ההגבלה והרצפים אשר חופפים pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. זוג פריימר HX_F וHX_R מגביר את קלטת minigene 14 HXGPRT. פריימרים לקרוא מ5 'ל 3'. לוח מותאם פנטרס ואח' 10. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-7032
איור 2. סקירה כללית של הפרוטוקול למחיקה של גנים באמצעות HXGPRT. . Disruption של אירוע רקומבינציה הומולוגית באמצעות ~ 1 'אגף יעד ה-DNA ו~ KBP 3 1' KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOI פלסמיד GOI בזן ku80Δhxgprt Δ ידי מוצלב כפול. אסטרטגיה באמצעות PCR PCR1, PCR2, PCR3, וPCR4 (שלא בקנה מידה) מוצגים המאפשרת אימות גנוטיפ כדי לאמת את השיבוטים עם שילוב ממוקד של HXGPRT ומחיקה של לוקוס GOI. זוגות פריימר נציג B. נועדו לאמת את המחיקה של rop18 . ROP18_DF וROP18_DR להגביר PCR1, ROP18_ExF וROP18_CxR להגביר PCR2, ROP18_CxF וDHFR_CxR להגביר PCR3 וDHFR_CxF וROP18_CxR להגביר PCR4 (ראה איור 2 א). פריימרים לקרוא מ5 'ל 3'. לוח מותאם פנטרס אח' 10 תוצאות נציג. ג האימות של מחיקת גן ממוקדת (rop18) באמצעות HXGPRT. Transfection הבאה של pΔROP18 פלסמיד לתוך Δ ku80Δhxgprt ובחירה בMPA +X, X + MPA שיבוטים העמידים היו assayed למחיקה של rop18. בקרת ההורים היא המתח חיובית עבור 1 PCR (~ 400 נ"ב) וה-PCR 2 (~ 650 נ"ב) ושלילית למוצר ה-PCR 3 (~ 1,200 BP) ו-PCR 4 (~ 1,300 BP) מוצר. נוקאאוט GOI ממוקד הוא חיובי עבור מוצרי PCR2, PCR3 וPCR4 ושלילי למוצר ה-PCR 1 (ראה איור 2 א). מוצגים הם פנלים מייצגים של תוצאות PCR1 וPCR2 (פנל עליון), PCR3 (פנל באמצע), וPCR4 (פנל תחתון). 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9 ו -11 מציגים את דפוס הפסים הנכון של 1-PCR, PCR2, PCR3 וPCR4 שמגדיר את אירוע מחיקת גן ממוקד בשיבוט. 1 שיבוטים, 2, 7, 10 ו -12 אינם מחיקות גנים, ומתאימים לתוצאות נציג פוטנציאליות אחרות. (C = זן בקרת ההורים Δ ku80Δhxgprt, מ = סמני גודל). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-9026
איור 3. סקירה כללית של הפרוטוקול למיקוד מחדש את הגן של עניין למחוק HXGPRT. האסטרטגיה א 'להסרת הסמן לבחירת HXGPRT ידי מוצלב כפול אירוע רקומבינציה הומולוגית בזן Δ ku80Δgoi :: HXGPRT באמצעות ~ 1' אגף יעד ה-DNA ו~ 1 KBP 3 'KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOIc פלסמיד. אסטרטגיית ה-PCR לאימות גנוטיפ מתוארת באמצעות זוג פריימר לassay עבור מוצר ה-PCR (PCR5) החובק את המחיקה (שלא בקנה מידה). ב 'זוג פריימר נציג שנועד לאמת את ההסרה של הסמן לבחירת HXGPRT מgra2 לוקוס בזן Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF וGRA2_CxR להגביר PCR5. פריימרים לקרוא מ5 'ל 3' פנל. נציג ג השיבוטים 6TX העמידים שהיה יכולים להתקבל transfection הבאה של pΔGOIc פלסמיד לתוך Δ ku80Δgoi :: HXGPRT והבחירה ב6TX. שיבוטים 4, 7, 9, 11 ו -12 מציגים את הדפוס הנכון של פסי PCR5 המתאימים למחיקה ממוקדת של סמן HXGPRT (~ 1.2 KBP מוצר שמשתרע על פני 'אגף עם חפיפה קלה עם 5' 3 אגף ומחוצה לו 3 ' אגף). 1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, ו -10 (הלהקה הזאת היא אור) מייצגים את דפוס הפסים הצפוי של כ ~ 3.4 KBP שמתאים לגנוטיפ השיבוט ההורי, למרות ששיבוטים אלה הציגו מידה מסוימת של התנגדות ל6TX שמותרית הבחירה שלהם (הפנוטיפ זה לעתים יכול להיווצר באופן ספונטני על ידי כיבוי ביטוי HXGPRT (ראה הערה בפרוטוקול 2.1 (שלב 8) וסעיף נציג תוצאות). (C, M = סמני גודל = זן בקרת ההורים Δ ku80Δgoi :: HXGPRT).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-10793
איור 4. עיצוב של מולקולת הדנ"א מיקוד לתייג סוף C-המסוף של חלבון. האסטרטגיה מבוססת על יכולתו של סמן HXGPRT גם לתפקד כאזור רגולציה במורד הזרם 3 '. עמוד השדרה של pΔGOItag הוא אורציל מכיל pRS416 מעבורת הווקטור (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ 'אגף ה-DNA היעד מוגבר מהדנ"א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות Fgoi וRtag פריימרים, ~ KBP 3 1' 1 KBP 5 אגף יעד DNA מוגבר מהדנ"א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות F2 וR2פריימרים וקלטות minigene HXGPRT. אגף ה-DNA יעד 5 'מחליף את קודון הסיום עם התג (HA, Myc,, וכו') ואחרי קודון סיום החלפה. MPA + X מבחר משלב את תג C-המסוף וHXGPRT במורד הזרם, ומעביר את '3 UTR לעמדה הבא סמן HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר Fgoi לחתוך את הפלסמיד ב5 "סוף של 5 'אגף יעד ה-DNA, וRE.Y ב R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב'סוף 3 '3 אגף יעד ה-DNA, וRE.Z בRtag ופריימרים F2 כדי בלו קלטת minigene HXGPRT לשימוש לבנייה לפלסמיד למקד מחדש את לוקוס הגן מתויג למחוק סמן HXGPRT שישחזר את המיקום של '3 UTR.

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול לגן המיקוד יעיל בזני הטפיל ku80 Δ כדי לאפשר התאוששות היעילה של צאצאי מניפולציות גנטית שיש ממוקדים מחיקות גנים, תחליפי גן, ו / או גנים מתויגים. הביצוע הרציף של שיטות אלה מספק גישה אמינה לבידוד של מוטציות טפילות המכילות מניפולציות גנטיות ממוקדות בודדות או מרובות 1-3. בעוד הדור של מחיקה ממוקדת תלוי בגורמים רבים, השימוש במתח Δ ku80 עם אסטרטגיה ופרוטוקול המובא מגדיל מאוד את היעילות וקלות מה שהופך את הזנים מוטנטים מוגדרים במדויק של ט gondii ללימודים הגנומי תפקודיים.

הגנום של ט ' gondii במהלך שלבי זוויגיים הוא הפלואידים. כך בחשבון בעת תכנון לעשות כדי למחוק גן הוא, כי הגן לא חייב להיות חיוני במבחנה. יחד עם זאת, את היעילות של targeknockouts טינג גנים בזני Δ ku80 הוא גבוה מאוד, וזה מאפשר בידוד של זנים מוטנטים עם שיעורי שכפול לקויים באופן משמעותי. אם גן ממוקד הוא חיוני, טפילים לעתים קרובות יפסיקו לשכפל במהלך בחירה. גורם קריטי נוסף במניפולציה גנטית ממוקדת הוא שההומולוגיה מושלמת עם לפחות 620 נ"ב של אגף המיקוד הגנומי נדרש כדי להשיג אינטגרציות ממוקדות לגילוי 2. אזורים ארוכים יותר הומולוגיה לייצר יעילות גבוהה יותר של מיקוד ומיקוד באמצעות אגפי ה-DNA של כ -1,000 נקודות בסיס הוא גישה אמינה ויעילה 1-4. מסיבה זו חשוב שאגפי מיקוד גנומית נוצרים מאותו הזן של ט gondii (RH, Pru) כזן אשר נמצא במניפולציות גנטית. חוסר ההומולוגיה מספקת יכול לעתים קרובות לגרום לאינטגרציה ממוקדת של אגף מיקוד אחד הגנומי, אבל לא את השני. אינטגרציה הושלמה, או אי קבלת תואר שני בנוקאאוטy להיות גם עקב התמדת episomal. מייד לאחר transfection, כל מולקולות המיקוד הם nonintegrated episomes, ולפעמים מולקולות מיקוד יכולות להימשך כepisomes במשך דורות רבים. באמצעות אגפי DNA היעד של ~ KBP 1 וממשיך להעביר טפילים מתחת לפני בחירה מחדש subcloning לעתים קרובות פותר בעיות הקשורות להתמדת episomal.

ברגע שהוא תוקף נוקאאוט וסמן HXGPRT מוסר, ניתן לחזור על אסטרטגיית המיקוד בגן GOI שני לייצר מחיקות מרובות בגני זן טפיל חד 1-3. הדור של מחיקות, תחליפים, או גנים המכילות את התווית גם ניתן להשיג על ידי שימוש בסמנים שונים (לבחירת bleomycin, חתול, pyrimethamine עמיד DHFR, וכו '). למרות שהסמן לבחירת CAT כרגע נמצא בסוג השני Δ ku80 Pru הגנום 1, ניתן להסירו באמצעות סמן זה HXGPRT פרוטוקול בחירה מתואר כאן. בידיים שלנו, בחירת HXGPRT היא הבטוחה ביותר וסמן יעיל ביותר עם ​​היעילות הגבוהה ביותר שבו מיקוד החדרה ממוקדת עותק יחידה היא מספיק חזקה לבחירה בMPA + X בינוני. HXGPRT גם מספק גישה רק שימושית כיום למחיקה ממוקדת של סמן לבחירה (איור 3) באמצעות 6 thioxanthine (6TX) מבחר 2,3. לכן פרוטוקול זה מספק גישה הנוכחית רק לפיתוח זנים מוטנטים מוגדרים עם כמה מניפולציות גנטיות ממוקדות.

פרוטוקול זה מספק שיטה יקר ויעילה למניפולציה גנטית ממוקדת בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii וישים לניתוח של גן יחיד, משפחה של גנים, או מחקרים גנומיים פונקציונליים הגנום. לפני הזמינות של 1,2 Δ ku80 זנים, גישות אלו לא היו נרחבת ריאלי בשל inefficiency של שיטות אלה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הוא ישים באופן נרחב למניפולציה גנטית ממוקדת של Toxoplasma gondii, והוא נגיש לכל החוקרים המתעניינים בטיפול במגוון רחב של שאלות על טפיל ביולוגיה, תגובה מארחת, וגנומיקה פונקציונלית.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לDJB (AI041930, AI073142, AI075931, וAI091461).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Overlap PrimersIntegrated DNA Technologies4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation PrimersIntegrated DNA Technologies100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845ATCCDesignation FY834
Shuttle Vector pRS416ATCC87521
DH10B E. coliInvitrogen12033-015SOC broth in kit with E. coli
Resuspension BufferQiagenBuffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep KitQiagen27104QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass BeadsScientific IndustriesSI-BG050.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work StationQiagen
Electroporation CuvetteUSA Scientific9104-50502 mm-gap
BTX600 electroporatorBTX
Maxiprep KitQiagen12662QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flaskCorning430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flaskCorning430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cellsATCCSCRC1041
Swin-lok Filter HolderWhatman42020025-mm-diameter
MembraneWhatman110612Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA)Sigma
Xanthine (X)Sigma
96-well Tissue Culture TrayCorning Costar
24-well Tissue Culture TrayCorning Costar
MEM Eagle MediaLonza Biowhittaker12-611F
Fetal Bovine SerumGibco26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)Gibco15240-062
Spin ColumnPrimm LabsPAE-100Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA LigaseNew England Biolabs
6-thioxanthineAcros Organics
Tissue DNA MinikitQiagen51104QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery MediaGibco126-48-010
Phosphate Buffered SalineHycloneSH30028.02minus calcium, minus magensium

References

  1. Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
  2. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
  3. Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
  4. Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
  5. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
  6. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
  7. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
  8. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).
  9. Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
  10. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
  11. Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
  12. Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007(2011).
  13. Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
  14. Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
  15. Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
  16. Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
  17. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
  18. Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
  19. Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
  20. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
  22. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
  23. vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).
  24. Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
  25. Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

77BioengineeringApicomplexaCoccidiaToxoplasmaToxoplasma gondiiDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved