Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Özet

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem rapor Δku80 suşları Toxoplasma gondii Verimli bir şekilde işlev genom analizleri için hedeflenen gen silme ve gen yedek elde etmek için.

Özet

Homolog rekombinasyon kullanılarak hedef genetik manipülasyon gen fonksiyonu ve fenotip (ler) daha ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için işlevsel genom analizleri için tercih edilen bir yöntemdir. Hedeflenen gen silme, hedef mutasyonlar, tamamlanmaktadır gen fonksiyonu ve / veya etiketli genleri ile mutant suşlar gelişimi bu genetik manipülasyonlar verimli çift tarafından entegrasyon aracılı ile ilgi gen odağı hedeflenebilir özellikle, gen fonksiyonu yönelik güçlü stratejiler sağlar homolog rekombinasyon üzerinde çapraz.

Toxoplasma gondii nonhomologous rekombinasyon, fonksiyonel genomik analiz çok yüksek oranları nedeniyle daha önce belirli genetik lokus için gen silme ve gen değiştirmeleri hedef için etkin yöntemler yokluğu ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, tip I ve tip II T. suşları nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu kaldırıldı Gen encodin silerek gondiig Ku80 proteini ^1,2. Δku80 suşları taşizoit (akut) ve in vitro ve in vivo olarak bradizoit (kronik) aşamaları esnasında normal olarak davranır ve homolog rekombinasyon esasen% 100 frekanstan sergiler. Δ Ku80 suşları tek gen yanı sıra genom ölçekli ^1-4 fonksiyonel genomik çalışmalar mümkün olun.

Burada, I ve tip II Δku80Δhxgprt suşları T. gen hedef yaklaşımlar geliştirmek için türünü kullanarak yöntemleri rapor gondii. Biz hipoksantin-ksantin-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seçilebilir marker hedef ekleme veya silme ile gen silme, gen yerine, ve etiketli genleri oluşturmak için etkin yöntemler özetlemektedir. Protokol hedef geni tarif parazit genomunun fonksiyonel analiz ilerlemek için ve taşıma tek suşları geliştirmek Δku80 suşları çeşitli şekillerde kullanılabilirçoklu genetik manipülasyonlar hedef. Bu genetik yöntem ve sonraki fenotipik testlerin uygulanması T. biyolojisi temel ve eşsiz yönlerini ortaya çıkaracaktır gondii ve sıtma (Plasmodium sp.) ve kriptosproidiyozis (Cryptosporidium) neden ilgili önemli insan patojenleri.

Giriş

Toxoplasma sık sık ortak bir obligat hücre içi protozoandır kronik ve hayvanlarda ve insanlarda ⁵ geniş bozar. Bu patojen tarafından 1 milyardan fazla insan şu anda olduğu tahmin ve kronik bulaşmıştır. T. neden olduğu hastalığın öneminin yanı sıra in vitro büyüme ve mükemmel fare modellerinde T. yaptık gondii enfeksiyonu, deneysel araçları, güçlü genomik kaynak ⁶ artan durumu, kolaylığı gondii hücre içi ökaryot patojenler ve sıtma (Plasmodium sp.) ve Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) ^5,7 gibi yıkıcı hastalıklara neden diğer önemli Apicomplexan parazitlerin daha geniş çalışma için önde gelen bir model sistem. Bir model organizma olarak Toxoplasma gondii önemli bir sınırlama genetik manipülasyonlar hedef taşımak döl verimsiz kurtarma olmuştur. Bu problemin çözümündeGen hedefleme m, T. yabani tip suşları nonhomologous rekombinasyon çok yüksek frekanslı göre homolog rekombinasyon bir düşük frekans nedeniyle yaygın DNA homoloji genetik çalışmalar ^2'de kullanılan DNA hedef moleküller sağlanmaktadır gondii bile.

Biz son zamanlarda genetik tip nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu bloke Ku80 proteini ^1,2 kodlayan gen silerek I ve tip II Toxoplasma gondii suşları. I ve tip II Δ Ku80 suşları normal büyüme oranları, boyut ve in vitro ve in vivo, in vitro olarak taşizoit ve bradizoit aşamaları sırasında ve hem de in vivo davranış sergileyen Elde edilen tipi, ancak, bu suşlar esasen% 100 homolog rekombinasyon frekansını ve bu belgedeki fenotip birkaç Tho için birkaç yüz ile hedeflenen genetik manipülasyon hızla izole istenen döl olasılığını artırırusand kat ^1,2,4. Son topluluk çapında I ve tip II Δ Ku80 suşları hızını önemli ölçüde hızlandırıldığını sahip tipi kullanımı çeşitliliği, hem de T. hedeflenen genetik yaklaşımların başarı oranı gondii ^1-4,8-13. Burada T. Δ Ku80 suşları hedef gen silme, gen değiştirme, ve gen etiketleme için kapsamlı bir protokol açıklar gondii. Biz tasarım ve güvenilir Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları belirli genleri veya genetik lokus için genetik manipülasyonlar hedef göstermek.

Protokol

1. İlgi Çekici Bir Gen silme hedefleyen gen

Bu protokol, tanımlanmış genetik lokusta bir hedef gen silinmesi olan bir mutant suşunun verimli üretimi için tasarlanmıştır. Daha önce tarif edilen T. gondii hipoksantin-ksantin-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seçilebilir marker mikofenolik asit ve ksantin (MPA + X) seçimi ^14-16 takip güvenli ve güvenilir bir belirteci yerleştirilmesi için bu protokol kullanılır. Bu protokol maya recombinational klonlama ^17,18 dayalı DNA hedef molekülleri oluşturmak için bir geçerli ve maliyet-etkin bir yöntem kullanır. Çeşitli alternatif protokoller recombinational in vitro klonlama yöntemleri, ya da füzyon PCR, bakteriyel recombinational klonlama yöntemleri kullanılarak yeniden birleştirici hedef moleküller oluşturmak için ticari olarak mevcuttur. Aşağıda açıklanan protokol klonlanmış kurtarma paragraf en yüksek verimlilik ve güvenilirlik sağlarT. Δ Ku80 suşları bir hedef gen silme sahip ites gondii.

DNA hedef 1.1 hazırlanması

1. ToxoDB ⁶ (giriş http://www.toxodb.org İlgi konusu genin (GOI) genomik sekansları elde etmek için).

Not: genomik sekansları manipüle gerginlik en yakın olan ToxoDB veri tabanında bulunan Tip I, II veya III genom sekansı elde edilmelidir. Örneğin: Pru için RH ve ME49 için GT1.

2. 5 've 3' maya mekik ile 33 bp üst üste içeren, ilgi konusu gen (GOI) genomik hedef alan yanları amplifiye Tasarım spesifik primerler vektör örtüşme pRS416 (pRS426 ya da alternatif olarak) ve seçilebilir bir marker ile 33 bp üst üste dahil ( HXGPRT) (Şekil 1A-B). 5 'bölgesinin her iki ucunda, her bir primer, benzersiz kısıtlama enzimi sitesi ekleme33 bp örtüşme ve T arasında yer nd 3 'genomik hedef fıçılar, gondii özgü primer dizisi (ler) (Şekil 1A-B).

Not: 30 bp üst üste daha fazla etkili mantar rekombinasyon klonlanması için gereklidir. 5 've 3' genomik hedef alan dış yan yüzleri 800 ve bir hedef silme tanımlamak 1400 bp arasında belirli bir DNA fragmanları yükseltmek için tasarlanmıştır. Kısa yanları önemli ölçüde Δ Ku80 Δ hxgprt arka ² verimlilik hedef azaltacağını unutmayın.

3. PCR 5 'astar F1 ve R1 kullanarak hedef kanadını ve PCR 3 yükseltmek' yükseltmek genomik DNA ³ astar F2 ve R2 (Şekil 1A-C) ile hedef yan. Ayrı olarak, PCR, ilgili 5 've 3' primerleri dhfr HXF ve HXR kullanarak HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kaset ¹⁴ komşu bölgeleri de dahil olmak üzere yaklaşık 2 Kbp HXPGRT genini çoğaltmak(Şekil 1B-C).

Not: transfekte edilecek ebeveyn gerginlik genomik DNA kullanılarak hedef yanları yükseltin.

Not: 5 've 3' DNA, kesintiye lokusundan HXGPRT olarak hedeflenen kaldırılması ve takip eden verimli genetik manipülasyonlar, kolaylaştırmak için yanları hedefleme göre ileri yönde yer HXGPRT işaretleyici.

4. Agaroz jel elektroforezi ile doğru boyutlarda PCR ürünü, doğrulama ve agaroz jel kullanılarak standart DNA fragmanı konsantrasyonu ya da DNA konsantrasyonunun belirlenmesi için bir tahmin yöntemi.
5. Olarak Gietz ve Schiestly ¹⁷ açıklanan yetkili maya hacimde oluşturun.
6. 5 50 ng 'genomik hedef alan yan, 3 50 ng' genomik hedef alan kanat HXGPRT seçim işaretleyici 100 ng ve 10 bir son hacim elde etmek için steril _H2O ile doğrusallaştırılmış mekik vektörü, 50 ng Kombine -20 ul. Üç PCR ürünleri ve maya-E ile yetkili maya Dönüşümü Gietz ve Schiestly ¹⁷ tarafından açıklanan protokolünü kullanarak recombinational klonlama için coli mekik vektör. Plaka urasil-eksi az orta agar plaklarına maya değiştirdi ve 2 için 30 ° C'de inkübe - 3 gün.

Not: plazmid, 5 'yan hedefi, HXGPRT bir işaretleyici ve 3' yan hedef bölgesinin sipariş düzeneği DNA fragmanları (Şekil 1A-B) arasında ve işlenmiş 33 bp üst üste tarafından kolaylaştırılır ve homolog rekombinasyon ile aracılık maya.

7. Urasil-eksi plakalara 2x YPAD 2 ml ekleyerek ve yavaşça agar aksatmadan koloniler çıkarmak için kazıma ile hasat maya. 5000 x g'de 5 dakika boyunca maya çözeltisi santrifüj ve supernatant atın.
8. RNaseA içeren bir yeniden süspansiyon tamponu 250 ul maya pelet yeniden süspanse edin ve 50 ekleyin - bir 100 ulçözümüne cid-yıkanmış cam boncuklar. Maya hücreleri şut en yüksek hızda 5 dakika boyunca girdap.
9. Cam boncuk tüp dibe ve 2 ml lik Eppendorf tüp süpernatant transfer edilir.
10. ~ 100 ul nihai hacimde yeniden süspansiyon haline getirilmesi, bir miniprep DNA izolasyon kiti kullanılarak maya DNA izole edin.
11. DH10B elektroporasyon yetkili E. 40 ul 2 ul maya DNA (~ 50 ng) Mix coli buz üzerinde tutulmalıdır.
12. Soğutulmuş 2 mm boşluk elektroporasyon küvet çözüm transferi ve 2.4 kV ve 129 Ω de bakteri hücrelerinin electroporate.
13. Her küvet ve 14 ml ek kapaklı Falcon tüp transfer çözüm için 0.8 ml SOC suyu ekleyerek Kurtarma hücreleri. 60 dakika - 40 için bir rulo davul 37 ° C'de hücreleri inkübe edin.
14. Plaka E. 2XYT + ampisilin (AMP) plakalar üzerinde coli ve 37 ° C gecede plakaları inkübe.
15. ~ 6 seçin - 8 tek koloniler ve 37 ° C'de ~ 16 saat için 3 ml 2XYT + AMP büyümeye
16. Her E.% 30 gliserol dondurucu stok hazırlayın coli klonu.
17. E. plazmid pΔGOI izole coli klonlarının ~ 100 ul nihai hacimde yeniden süspansiyon haline getirilmesi, bir miniprep kiti kullanılarak.
18. Kısıtlama enzimi kullanılarak pΔGOI DNA plazmid boyutunu ölçmek ve beklenen pΔGOI DNA bantlama desenleri doğrulamak için digests doğrular.
19. DNA'nın 5 've 3' genom dizisi veri göre% 100 DNA sekansı teyit etmek için genomik hedef alan yanları sıralanmasıyla pΔGOI doğrulama tamamlayın http://www.ToxoDB.org .

Not: Yakın mükemmel dizi benzerliği her baz çifti fark mükemmel homoloji uzunluğu karşılık gelen bir kesim mahiyetinde olan bu etkinliği ³ hedef gen maksimize etmek için gereklidir.

Not: Pru ebeveyn st göre tip II Δku80 suşu genom dizisiYağmur şu anda mevcut değildir. Bu çalışma tip II Δ Ku80 gerginlik için vekil genom olarak tip II ME49 genom dizisi kullanır. Genetik lokus bir sayıda dizi verilerine dayanarak, ME49 genomu ve Pru genom ~ 1 10,000 nükleotid veya daha düşük bir frekansta tek nükleotid polimorfizm sergiler olduğu tahmin edilmektedir.

20. Bir valide E. gliserol stokları ile bir ~ 250 ml 2XYT + AMP gecede kültür aşılayarak pΔGOI stokunun> 200 mg oluşturmak coli miniprep klonu.
21. ~ 1000 ul bir son hacim içinde yeniden asılı bir Maxiprep DNA izolasyon kiti kullanılarak geniş kültürden plazmid DNA izole pΔGOI.
22. Transfeksiyon öncesi doğru hedef DNA molekülü doğrulamak için pΔGOI Maxiprep DNA sıralama kısıtlama enzimi sindirerek, ya da DNA tekrarlayın.
23. Benzersiz sınırlama enzimi X (RE.X) kullanılarak 5 'ucunda ~ 15 ug pΔGOI Linearizeözet sitesi 5 'hedef kanadını (Şekil 1B) yerleşik.

Not: T. hedefleme Gen gondii ilgi ² gen lokustaki olayların hedef etkili bir frekans elde etmek için DNA hedefleyen ~ 10 mg en az gerektirir.

24. PΔGOI doğrusallaştırılması doğrulamak ve agaroz jel elektroforezi ya da alternatif bir yöntemle DNA konsantrasyonunun belirlenmesi.

Not: 5. restriksiyon enzim 'kanadını tam doğrusallaştırma ortaya koymamıştır, tasarlanmış 3' Eğer benzersiz RE.Y özet sitesi pΔGOI bir lineerizasyon için bir alternatif site olarak kullanılabilir.

Not: Tamamen doğrusallaştırılmış hedef DNA molekülü Δ Ku80 suşları homolog rekombinasyon ile başarılı bir gen hedefleme için gereklidir.

25. Incubat ile sınırlama enzimi etkisiz hale15 68 ° C'de ing - 20 dk.
26. Steril H ₂ O. 100 ul doğrusallaştırılmış plasmid en az 15 ug hazırlanması Transfeksiyon saatine kadar -20 ° C'de saklayın Lineerleştirilmiş pΔGOI.

T. 1.2 hazırlanması gondii parazit, transfeksiyon, seçimi, alt klonlama, doğrulama, arşiv ve genetik olarak manipüle suşları bakımı

T. kültürü ve manipülasyon için genel yöntemler insan sünnet derisi fibroblast (HFF) hücreleri gondii ^19-21 açıklanmıştır. Δ Ku80 Δ hxgprt suşları parazit enfeksiyonu ortamı (Eagles Minimum Zorunlu Ortamı (EMEM)% 1 fetal bovin serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik antimikotik-100X stok solüsyonlarından seyreltilmiş ile desteklenmiş büyüme ortamı) ^1,2 normal olarak taklit eder. Toxoplasma gondii ile tüm iş biyogüvenlik düzeyi 2 prosedürleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. T. gondii RHΔ Ku80 ² parental suşu Roos Lab ¹⁴ RHΔ hxgprt suşu elde edildi. PruΔku80 ¹ ebeveyn suş, stabil bir şekilde entegre CAT seçilebilir marker ve bir bradizoit aşaması spesifik promotör LDH2 bölgesinin kontrolü altında bir yeşil flüoresan proteini (GFP) raportör içeren PruΔhxgprt (Pru gniaud suşu BSG ^4-22) elde edilmiştir.

1. 1 x 10 ⁶ uygun tür RH Δ Ku80 Δ hxgprt parazit ile konfluent HFF hücreleri içeren 25 cm ² şişesi aşılamak veya 2 x 10 ⁶ uygun tip II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parazitler iki 25 cm ² şişeler aşılamak.

Not: varlığını sürdürebilen parazitlerin taze üzerinden lize edilmiş olan hücre dışı parazit olarak tanımlanır.

Not: Bu ölçek, transfeksiyon deneyleri için varlığını sürdürebilen parazitlerin yeterli sayıda içerir.

2. Δ Ku80 Δ hxgprt enfekte kültürler kontrol ~ 68-72 saat sonrası enfeksiyon. Transfeksiyon kesin zamanlama planı HFF hücrelerinin% 95 lizis - varlığını sürdürebilen parazitlerin ve ~ 90 varlığını doğrulamak.

Not: Düşük parazit canlılığı gen hedefleme verimliliği kaldıracağını çünkü taze dışarı giden parazitlerin izolasyonu Bu protokolün başarısı için önemlidir.

3. 25 cm ² şişesi üzerinde plug-conta kapağını kapatarak çözüm içine canlı parazit ajitasyon ve şiddetle kapağın içinde veya balonun boyun üzerine sıvı sıçraması olmadan büyüme yüzeyin parazitleri kapalı ajitasyon ileri geri şişeyi sallayın .

Not: Parazit hasat tip I veya bir şırınga-iğne serbest protokolü gerektirmezII Δ Ku80 suşları yazın.

4. 3 mikron membran ihtiva eden bir filtre tutucusu ekli 10 ml'lik bir şırınga parazit çözüm aktarın ve açık bir 15 ml vidalı kapaklı tüp üstünde filtre koyun. Şırınga 15 mL vida kapaklı tüp içine parazitleri filtre.

Not: zarından parazitler Filtreleme enfekte olmuş hücrelerde ve hücre kalıntılarının ortadan kaldırır.

5. Hemasitometre kullanarak parazit konsantrasyonu (ml taşizoit formları) belirleyin.

Not: İsteğe bağlı: parazit çözümü kullanarak, bir plak oluşturan birim (PFU) 7 okunacak test ²¹ kurmak - 8 gün sonra transfekte parazitlerin yeterli canlılığı (PFU ≥ 0,2 oranı taşizoit için) belirlemek için.

6. 7 1.400 xg dakika ve parazit pelet bozmadan ~ 0.4 ml süpernatant aspire için pellet parazitler. 1,40 2 dakika süreyle Spin0 xg ve aspirat parazit pelet bozmadan ~ 0.01 ml süpernatant kalan.
7. Tüpün alt getirerek parazit pelletini ve hemen bir 4 parazit konsantrasyonunu elde etmek için parazit pelet cytomix ²³ tampon maddesi (1.33x konsantrasyon) eklendi - 5 x 10 ⁷ parazit / ml cytomix.

Not: bu eklemeler gen hedefleme verimliliğini artırmak olmadığı cytomix için ATP ve glutatyon ilavesi yok sayın.

8. Protokolü 1.1 (adım 26) lineerize pΔGOI en 100 ul kısım çözülme.
9. Parazit cytomix çözüm (~ 1,3-1,6 x 10 ⁷ parazit) 0.3 ml transfer protokolü 1.1 (adım 26), gelen lineerize pΔGOI en 100 ul ve hemen bir soğutulmuş 2 mm boşluk için tüm 0,4 ml parazit + pΔGOI karışımı aktarın elektroporasyon küvetine.
10. 1.4 kV ve 24 Ω de parazit electroporate.
11. ResT ~ 5 dakika sonra 30 ml enfeksiyon ortamı ile konfluent HFF hücreleri ihtiva eden bir 150 ^cm2 şişeye transfeksiyon küvetin tüm içeriği aktarmak ve gece boyunca inkübe Enfekte edilen kültür, oda sıcaklığında transfeksiyon küvet.
12. Mikofenolik asit seçeneklerini başlamak + ksantin (MPA + X) yaklaşık 20 saat ile enfeksiyon ortamının değiştirilmesiyle sonrası transfeksiyon (Şekil 2A) MPA + X seçim ortamı (MPA (25 ug / ml) ve ksantin (50 mg / ml) enfeksiyon ortamı).

Not: + X seçimi şişesi kuluçka MPA rahatsız etmeyin.

13. Görsel olarak tek tabaka inceleyerek MPA + X seçimi şişesi ~ 8 gün sonrası transfeksiyon içinde PFUs toplam sayısını tahmin. Işık mikroskopisi tarafından enfeksiyonun PFUs ve sağlıklı bölgeleri oluşturarak varlığını doğrulamak.

Not: plaklar gün 8 ile görünmüyorsa, enfekte belirtileri için seçimi ve monitör korumakmutant suşlar bu yana iyon düşük bir çoğaltma oranı olabilir.

Not: Δ Ku80 Δ hxgprt parazit suşları oldukça ağır olan mutant suşlar başarılı izolasyonu sağlar istenmeyen nontargeted olaylar, son derece düşük bir arka plan var, ama ölümcül değil büyüme kusurları. Bir gen önemlidir ve silinemez, birincil transfeksiyon, veya sonradan parazit nüfus geçti, nüfusun hedef tırnakları giderir gibi parazitler seçimi sırasında çoğaltmak olmaktan bir fenotip ortaya çıkarabilir.

14. Tek tabakalı hücre dışı parazitler çıkarmak için adım 3'te olduğu gibi çalkalanır [görebilir plaklar geliştirdik sonra], bir parazit çözüm elde edilmektedir. Transferi ~ gelen parazit çözüm 0.5 ml MPA + 25 cm ² X seçimi şişesi MPA + konfluent HFF hücreleri (bu kültürün geçiş 1A tayin) içeren X seçimi şişesi.
15. Parazit çıkarmaks Orijinal 150 cm ² MPA + X seçimi ~ 3 gün sonra şişesi ve transfer ~ ikinci bir 25 cm ² 0.5 ml parazit çözüm MPA + konfluent HFF hücreleri (bu kültürün geçiş 1B tayin) içeren X seçimi şişesi.
16. Enfeksiyon bölgeleri geçiş 1A ve / geliştirmek veya ~ 5 gün 1B şişeler geçmesine izin. Görme geçiş 1A ve 1B şişeler enfeksiyon sağlıklı bölgeleri ile 25 canlı PFUs en az içeren ışık mikroskobu ile doğrulayın.
17. 25 cm ² şişeler MPA + X seçimi ortamda devam geçişi için geçiş 1A veya 1B geçiş şişesi birini seçin. MPA + X seçimi altında geçit koruyun.

Not: Parazitler önce alt klonlama için nüfus nonintegrated kalıcı epizomlar silmek için nesiller yeterli sayıda kültürlerinin yapılması. Tip I RH Δ Ku80 Δ hxgprt, ya da önceki 25 gün sonrası transfeksiyon için için önce 20 gün sonrası transfeksiyon için alt klonlama yapmayıntip II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parazit nonintegrated epizomlar ^1,2 sulandırmak için yeterli zaman tanımak için.

18. MPA + X seçim ortamı ile konfluent HFF hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu bir tepsiye alt klon parazitleri. 1 parazit / çukur ve 2 parazit / çukur konsantrasyonunda ikinci bir tepsi bir konsantrasyonda bir tepsi hazırlayın.

Not: Son zamanlarda (~ 90 - 25 ^cm2 şişeye HFF hücrelerinin% 95) lize adres alt klon parazitler parazit yüksek yaşama kabiliyetiyle sahip olmasını sağlamak için.

Not: alt klonlama için en uygun zaman dilimi sonrası transfeksiyon başarıyla hedef parazitleri seçilen nüfus ¹ yüksek frekansta ortaya ne kadar hızlı ölçmek tarafından kurulmuştur.

19. Geçit devam bulaştırma haftalık bir geçiş programı kullanılarak MPA + X seçim ortamı içinde transfekte parazitlerin başlıca nüfusParazit 10 ul eriyik ile bir 25 cm ² HFF şişesi.

Not: hedeflenen gen silme (tırnakları) taşıyan klonlar adım 18, resubclone sürekli olarak korunur nüfustan parazitler ilk alt klonlama elde değilseniz ~ 10 - 12 hafta sonrası transfeksiyon.

Not: bir gen silme elde değil nedenlerinden biri, bazı pΔGOI plazmid epizomal sebat doğar. Epizomal sebat 5 içerdiği dizileri 've 3' genomik hedef yanları belirlenir ve HXGPRT genetik elemandan ortaya görünmüyor. Yaklaşık 5 - hedefleme plazmid% 10 parazit nüfusun üretim süreleri yeterli sayıda kalıcı epizomlar sulandırarak öncelikle kararlı integrants için nüfusun çözmek için izin vermek için alt-klonlama daha sonraki bir zaman gerektiren önemli epizomal kalıcılık arzetmektedir.

20. Sonucu 96 oyuklu tepsisi 6 - ışık mikroskopisi ile enfeksiyon tek bir bölge olarak tanımlanan bir tek PFU içerdikleri kuyu boyunca 8 gün sonrası alt klonlama (tip II parazitler) - 7 gün sonrası alt klonlama (tip I parazit) ya da 7 40X veya 60X güç ya. Kuyudaki PFU yerini belirlemek için, 96-çukurlu tepsi kapağının üzerinde küçük bir noktaya işaret eder.
21. De iyi parazitler dağıtmak için PFU fazla sıvı akışının yönlendirilmesi, 50 ul (200 ul ucu) olarak belirlenen bir pipet kullanarak tek bir PFU içeren her içeriğini karıştırın.

Not: iyi Karıştırma HFF tek tabaka parazit parçalanması hızlandırır. Ben RH suşları iyi lyse olacak ~ 4 gün karıştırma sonra, tip II Pru parazitler de lyse olacak ~ 5 gün karıştırma sonra yazın.

22. 10 ul pipet parazit çözüm aynı anda çizim-up 6 ul ise - 0.5 kullanarak bu parçalanmış kuyuların her birinin alt kısmında bir kuyu (klonlar) parçalanmış düzine ve sıfırdan seçin. Trans1 mi MPA + X seçim ortamı içinde konfluent HFF hücreleri ihtiva eden bir 24-çukurlu tepside bir oyuğa parazit çözeltinin 6 ul ferin.

Not: Bu açılış kuyunun dibinde ikamet eden parazit ile sürekli temas halinde pipet ucu delik tutmak için kuyunun dibinde sıfırdan gereklidir.

23. HFF hücrelerin parçalanma için 24-iyi tepsi izleyin.

Not: Ben RH parazitler genellikle ~ 4 gün içinde 24-iyi biçimde iyi lyse olacaktır yazın. Tip II Pru parazitler genellikle ~ 5 gün içinde iyi lyse olacaktır.

24. + X seçim ortamı kuyu başına konfluent HFF hücreleri ve 1 mi MPA içeren yeni bir 24 oyuklu tepsinin karşılık gelen oyuğa 24-iyi biçimde her bir kuyunun dibinden çizik uygun bir parazit solüsyonu 2 ul aktarın.

Not: tüm parazit klonlar ve ana hatları sürekli olabilir,Bu 24-iyi tepsi biçiminde her 7 günde bir canlı parazit solüsyonu 2 ul geçirerek tained.

25. Doğrulayın parazit başarılı görsel ışık mikroskobu ~ 18 saat sonrası geçişi ile kontrol ederek yeni bir 24-iyi tepsi devredilmiştir.
26. Ya da 1 ml veya 10 ml pipet ve bir Eppendorf tüpüne parazit çözeltisi transferi kullanılarak 24 - Adım 23 24-iyi tepsinin parçalanmış kuyulardan Hasat parazitleri.
27. Pelet 7 dakika boyunca bir kez 1 ml fosfat durulama 1,400 x g de parazit 3 dakika boyunca 1400 x g'de tekrar tuzlu su (PBS) ve pelet tamponlu.
28. Pelet aspire PBS daha sonra parazitler tekrar süspansiyon pelet 200 ul PBS ilave edin. DNA izolasyonu kadar -80 parazit çözüm ° C dondurun.
29. Bir doku DNA izolasyonu mini kit kullanarak her klon parazit DNA izole edin.
30. Doğrulama astar (Şekil 2A-C) kullanılarak PCR ile hedeflenen gen silme (nakavt) doğrulayın. Için testİlgi konusu genin işlevsel kodlama bölgesinin olmaması ve yukan ve aşağı doğru cxf cxr genomik DNA primerleri göstermek için genomik hedef alan yanları ve HXGPRT yayılma PCR ürünlerinin varlığı için (Şekil 2A-B) Test doğru 5 've 3 kullanılarak 'silinen gen lokusu içine HXGPRT genin entegrasyonu hedef.

Not: Doğrulama için astar elde edilebilir faiz veya bir yanlış pozitif sonuç gen özgü olmalıdır. Primer tasarımı doğrulanabilir http://www.toxodb.org astar benzersiz doğrulamak için genom (lar) için primer dizileri patlatma ile.

31. Bir haftalık çalışma programı üzerinde Passage parazit klonlar olarak adım 24'de belirtilen. Delesyonu doğrulandıktan sonra, MPA + X devam seçimi isteğe bağlıdır.
32. Dondurucu stokları hazırlayarak Arşiv parazit klonlar. Pelet dışı parazit25 cm ² kültür şişelerinde parçalanmış HFF hücrelerden, bir parazit konsantrasyonda hücre kültürü dondurma ortamında ortamı çıkarın ve yavaşça tekrar süspansiyon parazit pelet> 4 x 10 ml ⁷ parazit. Sıvı azot içinde süresiz cryovials ve mağaza parazitlere hacimde transfer, ya da -80 ° C

2. HXGPRT silinmesi

Bu protokol, genetik olarak manipüle Δ Ku80 suşunun genomu içindeki entegrasyon sitesinden HXGPRT işaretleyici kaldırmak için tasarlanmıştır. HXGPRT çıkarılması işaretleyici kurtarma ve HXGPRT ^1-3 dayalı sadece seçimleri kullanarak birden fazla genetik manipülasyonlar ile suşların üretimi için izin verir. Aşağıda ayrıntılı protokol yeniden hedef bir odağı HXGPRT silmek için yöntem tarif ederken, ilgi konusu gen bölgesinde HXGPRT çıkarılması da yabani tür gen (c yeniden bütünleşme aynı anda izin verdiğini not edilmelidiromplementation), genetik manipülasyonlar, bir dizi izin veren bir mutant genin yeniden entegrasyonunda, hem de bir etiketli gen (N-ya da C-terminal GFP HA, etiket, vb) arasında yeniden entegrasyonunda,. Aksiyon mekanizmaları ²⁴ ve 6-thioxanthine seçimlerini kullanarak protokol daha önce hedef ^1-3,15 tarif edilmiştir.

2.1 Sil HXGPRT

1. HXGPRT (Şekil 1B) yan benzersiz kısıtlama enzim sitelerde kesmek için RE.Z ile sindirerek pΔGOI gelen tüketim HXGPRT seçilebilir işaretleyici.
2. Agaroz jel elektroforezi ile DNA'nın tam sindirim edin. Agaroz jel gelen iki grup daha büyük izole edin.

Not: her iki bant arasında daha büyük bir 5 've 3' DNA hedef fıçılar, ancak HXGPRT gen ile birlikte plazmid içerir.

3. Bir spin kolon layin olarak daha büyük DNA bandı içeren agaroz bölümü yerleştiring membran üzerinde jel düz. , Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 13.000 x g'de sütun dönerler. 100 ul için ses getirmek için akış yoluyla steril H ₂ O ekleyin.

Not: Diğer ticari yöntemler agaroz DNA izole etmek için kullanılabilir.

4. 18 ul steril H ₂ O. bir nihai hacimde yeniden süspansiyon haline getirilmesini DNA, EtOH çökeltme DNA Konsantre
5. 7 ml _H2O, 1 ul 10x ligasyon tamponu, 1 ul T4 DNA ligaz (5 adet), konsantre edilmiş DNA 1 ul karıştırın ve 4 reaksiyonumuz ° C pΔGOIc (pΔGOIclean) (Şekil 3A) oluşturmak için gece boyunca karıştırıldı.

Not: RE.Z içeren DNA uçları DNA fragmanları gibi, hedeflenen bir mutant genin yeniden bütünleşme hedeflenen yabani tür gen (tamamlama), yeniden bütünleşme hedefli için uygun plazmid oluşturmak için bu adımda tasarlanmış ve dahil edilebilir Etiketli bir genin yeniden bütünleşme(N-ya da C-terminal GFP HA, etiket, vb.)

6. Önce elektroporasyon için steril _H2O ile reaksiyon 2x seyreltiniz.
7. E. içine pΔGOIc Dönüşümü protokol 1.1 gibi coli, subclone izole ve hedef plazmid doğrulamak için. Daha sonra (1.1.26 için adımlar 1.1.11 bakınız) transfeksiyon için hazırlık pΔGOIc linearize.
8. Protokolü olarak, 1.2 (adım 1-11) 'de belirtilen protokol parazit transfeksiyon tekrarlayın.

Not: önce 8 adım 1 yürütmek için, HXGPRT bu hedef kaldırılması doğrulamak mutant zorlanma mümkündür. 6-thioxanthine (6TX) seçim ortamı (200 mg / ml enfeksiyon ortamı içinde 6TX) ve PFU tahlilinde şişenin yer kullanarak mutant suşunun 1 x 10 ⁶ takizoit birleştirilebilmeli HFF hücreleri bir 150 ^cm2 şişeye Infect. Hayır (ya da çok az; <10) doğrulamak için 8 gün sonra şişeyi incelemek kurmak için gereklidir PFU görünür, bu potansiyeliFark sıcaklık gen verimliliği hedefleyen düşük HXGPRT ifade (bir 6TX direnç fenotip) ile bir fenotip mutant suşunun herhangi bir potansiyel kendiliğinden dönme aşacaktır.

Not: Yaklaşık 5 - HXGPRT entegrasyon sitelerin 10% HXGPRT işareti hala hedeflenen site (açıklama için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakınız) entegre olsa bile 6TX direnci önemli ve spontan frekans gösterirler.

9. 6TX seçim ortamı ile 150 ^cm2 şişeye orta değiştirerek 6TX seçeneklerini ~ 20 saat post-transfeksiyon başlayın.

Not: ~ 10 gün post-transfeksiyon için şişeye rahatsız etme.

10. 12 sonrası transfeksiyon (tip I parazit) ya da günlük 10 - - 16 sonrası transfeksiyon (tip II parazitler) 10. günde PFU oluşumu için şişeyi kontrol edin.

Not: ParasiHXGPRT ve silinmesi için hedef alınmaktadır tes HXGPRT gen ve mRNA silininceye kadar 6TX seçimi altında büyümeye başlar olmaz ve artık HXGPRT proteini inaktive olur.

11. Konfluent HFF hücreleri ve 5 ml 6TX seçim ortamı içeren yeni bir 25 ^cm2 şişeye parazit bir çözeltinin 1.0 mL'si - bir parazit çözeltisi ve transfer 0.5 oluşturmak için seçim çalkalanır. Iki veya daha fazla gün boyunca günde bir kez yeni bir 25 cm ² şişeler için birincil 150 ^cm2 bir aktarım tekrarlayın.

Not: Birden fazla örnekleme HXGPRT gen kaybetmiş canlı hedef parazitlerin yakalama şansını artırır.

12. Sağlıklı kopyalayan parazit bölgeleriyle PFUs geliştirme varlığını doğrulamak için ² şişeler ~ enfeksiyondan 5 gün sonra, 25 cm kontrol edin. Enfeksiyon bölgeleri içeren bir ya da iki şişeler al.

Not: Parazitler 6TX seçiminde normal büyüme oranında HXGPRT gen çoğaltmak silinmiş.

13. 6TX seçim ortamı içinde geçişi parazit devam edin.
14. Seçimi 30 gün - 25 sonra parazit nüfus subclone. ~ 1 parazit / iyi ve / iyi ~ 2 parazit ile başka bir 96-tepsi ayarlayın.
15. Izole edilmiş klonlardan parazit DNA'nın hazırlanması ve (adım 19-29) protokolü 1.2 'ye göre, bir 24-gözlü formata klonlar kültürde muhafaza.
16. Şekil 3A-B belirtilen strateji kullanarak PCR ile HXGPRT silinmesi doğrulayın.

3. Proteinlerin C-terminal Etiketleme

Bu protokol, MPA kullanılarak genin genomik lokus homolog rekombinasyon üzerinden çift çapraz ile entegrasyon için etiket hedefleyerek proteinlerin C-terminali etiketleme için tasarlanmıştır + X seçeneklerini ^2,4. Bu protokol verimli çalıştığı için 5 'dhfr dizisi HXGPRT işaretleyici diğer genlerin ^2,4 için tamamen doğrulanmış işlevsel 3 'çevrilmemiş bölge.

Endojen gen bölgesi de proteinlerin 3.1 Doğrudan C-terminal etiketleme

1. Ol pΔGOItag hedefleme maya plazmid recombinational klonlama (Şekil 4) ve protokol 1.1 'de tarif edilen yöntemler kullanılarak inşa. Tercih edilen etiket (HA etiketi, Myc etiketi, O'nun etikete 5 'sonlandırma kodonu bir konumda 3 taşınır dışında genomik hedef kanadını, GOI kodlama bölgenin son 800 1.200 bp (veya genomik DNA) içerir' , vb)
2. (Şekil 4) ana hatlarıyla strateji kullanarak protokol 1.1 ve 1.2 'de adımları izleyerek protein kodlama geninin endojen lokustaki C-terminal etiketinin hedeflenen ekleme oluşturun.
3. Bir PCR stratejisi kullanılarak, endojen gen bölgesinde C-terminal etiketinin ekleme edin.
4. D 1 protokolü ve protokol 2'de tarif edilen yöntemler kullanılarak retarget gen lokusuEtiketlenmiş bir proteini ifade eden bir tam olarak düzenlenir endojen gen lokusu oluşturmak için HXGPRT seçilebilir marker elete. Bu protokol, aynı zamanda, etiketli suşu (protokol 1) başka bir lokus hedeflemek için yeniden kullanılabilir HXGPRT seçilebilir marker kurtarır.

Sonuçlar

Ayrıntılı bir şablon restriksiyon enzim bölgesi yerleştirilmesi ve bir de HXGPRT arasında sürekli silme için genetik hedefleme ve gen doğrulama hedef, hem de plazmit yapımını kolaylaştırmak primerlerin üretimi de dahil olmak üzere bir gen silmek için bir hedefleme plazmid oluşturmak için sağlanan Tek aşamalı bir süreç (Şekil 1A-C, Şekil 2A, Şekil 3A). Genel şematik olarak, örneğin, bir hedef gen silinmesi (Şekil 2A), bir nakavt silme doğrulamak için kullanılan bir primer çifti yapmak için sunulmuştur, tip I rop18 (Şekil 2B), ve bir PCR doğrulama için temsili sonuçlar gösterilmektedir (Şekil 2C). Bu temsili bir sonuç hedef nispeten zor olan genetik lokus elde edilebilir sonuçlar aralığını göstermek için gösterilir. Başarılı bir şekilde hedeflenen gen silme geninin olmaması ile sonuçlanacaktırzasyonu PCR ürünü (PCR 1), 3 varlığı 'genomik hedef kanadını (PCR2) ve düzgün 5 arasında entegre HXGPRT seçilebilir marker varlığı' ve (PCR3 ve PCR4) silme tanımlamak 3 'genomik hedef yanları . Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 HXGPRT Goa (Şekil 2C) yerini alan hedefli gen delesyonlu (tırnaklar) doğrulanır.

Bir gen silinmesi içermeyen bir klon bantlama desenleri çeşitli ile temsil edilebilir. Tipik olarak, bir gen silinmesi olmayan bir klon PCR1 ve PCR2 için gözlenen bantlar ile ebeveyn suş (ebeveyn deseni) ayna değil, klon 1 ve 2 (Şekil 2C) için görüldüğü gibi PCR3 veya PCR4 süreliğine. Bu "ebeveyn model" birkaç potansiyel mekanizmaları doğar. Bazen, MPA dayanıklı seçilen parazit plazmid hedef pΔGOI bir nonintegrated kalıcı epizomlar taşımak, ve biz devam seçimi genellikle bu epizomlar zorlar unutmayınentegre. Biz de Δ pΔGOI istenmeyen entegrasyonu nedeniyle Ku80 gerilme DHFR 5 've 3' promotör elemanları, DHFR lokus ya da içine ya da kısmen silinmiş HXGPRT içine ile ifade edilen bir HXGPRT cDNA ihtiva eden plazmid hedef türü bazı nadir arka gözlemlemek odağı ^14. Bu nadir bir olay bir hedef entegrasyon iken, amaçlanan entegrasyon değildi ve herhangi bir gen değiştirme stratejisi tasarımında hatırlamak önemli bir nokta olarak hizmet vermektedir. Hedefleme pΔGOI devam 120 bp daha büyük DNA homoloji plazmid istenmeyen bir arka plan geri verebilir Δ Ku80 suşları ² rekombinasyon için bir alternatif site sağlayabilir. HXGPRT seçilebilir işaret türü tip II DNA ile karşılaştırıldığında nükleotid polimorfizmleri var ben dizileri dayalı olduğu için tip II Pru Δ Ku80 gerginlik bu arka plan azaltılabilir veya varolmayan tip I ile karşılaştırıldığında hangibüyük ölçüde, tip II Pru Δ Ku80 suşu ¹ kullanılarak yapılan deneyler, bu nadir arka azaltır. Bir gen lokusu (silinemez) esastır, ya da lokustaki frekans hedef, ya da son derece düşük bir gen varsa eğer epizomlar kolayca büyüme ve seçim yoluyla ortadan değildir [nonintegrated], bu ebeveyn desen MPA gözlenen desen hakim olacak ısrar dirençli klonlar. Alternatif olarak, hedef DNA molekülü bazen sadece 5 'ya da 3' genomik hedef alan yan ve bir grup (ama ikisini değil) Klon 10 görüldüğü gibi PCR1 ve PCR2 ile birlikte (5 PCR3 veya PCR4 ya da görülmektedir bütünleşmeyen görülmektedir 'entegrasyon) ve klon 7 (3' entegrasyon) (Şekil 2C). Bu modeller HXGPRT entegre ama bu hedef entegrasyon ilgi gen silmez lokustaki hedef plazmid entegrasyonu üzerinden tek bir haç pek rastlanmayan öneririz. Bu model (şerit 7 ve Şekil 2C 10) emBu hedeflenen entegrasyon yerine meydana doğrulamak için PCR verileri rapor ihtiyacı phasizes tek homolog üzerinde çapraz ve hedef molekülün bir nonhomologous ikinci entegrasyon. Nadiren, bir ebeveyn desen ve bir hedef silme desen de temsil klon 12 (Şekil 2C) tarafından temsil edilen bir genetik karışım görüyoruz. Bu model büyük olasılıkla iyi bir klonlama aynı yerde mevcut iki parazit genotip gelen vesilesiyle ortaya çıkar.

Δ ku80Δgoi ikinci HXGPRT ortadan kaldırılması için genel bir şematik :: HXGPRT suşundan HXGPRT silmek için (Şekil 3A) gösterilmiştir. Klon 4, 7, 9, 11 ve 12 (Şekil 3C) 'de görüldüğü gibi Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (Şekil 3B) HXGPRT çıkarılması doğrulamak için kullanılan bir primer çifti PCR5 benzersiz ~ 1.2 Kbp bant güçlendirir. HXGPRT odağı, bir ~ 3 kaldırılır değilse.4 Kbp bant (klon 1, 2, 3, 6, 8, 10, ve ebeveyn kontrolü) görülmektedir. Çeşitli mekanizmalar HXGPRT ortadan kaldırılması (6TX seçimi) daha zorlu ve HXGPRT bütünleştirilmesi (MPA + X seçimi) daha az verimli hale getirmek için hareket ederler. MPA seçimi 6TX seçimi ^14,16 daha sadece daha fazla etkilidir. Buna ek olarak, HXGPRT ifade yüksek düzeyde MPA seçim ^16,24 için daha 6TX seçimi için ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, HXGPRT enzim aktivitesi veya mutasyon ya da bir genin lokus HXGPRT ifade seviyesini azaltmak epigenetik değişiklikler azaltabilir mutasyonlar potansiyel 6TX seçimi etkinliğini ortadan kaldırabilmektedir. Hatta 6TX seçimi bu zorluklarla, Δ Ku80 suşları 6TX seçimi başarı oranı ^1-3 ilk denemede% 90 daha büyüktür.

Protein kodlayan genlerin doğrudan C-terminal etiketleme için genel bir şeması (Şekil 4) gösterilmiştir. Budüzeni etiketli HXGPRT geninin 3 'arasında homolog rekombinasyon üzerinden çift çapraz yoluyla doğrudan entegrasyon kullanır ve aynı zamanda yukarıda tarif edilenlere benzer bir doğrulama stratejiler kullanılmaktadır. Bir gen Bu plazmid bir bağımsız izole hedef DNA ile ikinci bir transfeksiyon kullanılarak doğrulanabilir önemli bir gen olduğundan şüphelenilen zaman. Bu tür düzenleyicili gen ifadesi için düzenleri gibi alternatif yöntemleri, bir gen ²⁵ gerekli ise daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.

Şekil 1. Plazmid DNA, bir hedefleme tasarımı nedeniyle genel bakış. Tasarımı için bir. Şematik PCR pRS416 servis vektör ve HXGPRT minigen kaset için 33 bp çakışıyor ile 5 've 3' hedef yanları yükseltmek için kullanılan astar üst üste. Şematik tasvir Astarlar vardı5 've 3' pΔROP18 ¹⁰ hedef yanları. bir hedef DNA molekülü tasarımı B. Genel strateji oluşturmak için kullanılır. PΔGOI omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. Bir ~ 1 Kbp 5'tir pRS416 takılan 'F1 ve R1 primerler kullanılarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadında, bir ~ 1 Kbp 3' DNA hedef kanadı için çakışıyor ile genomik DNA yükseltilir HXGPRT minigen kaset ve F2 ve R2 astar ve HXGPRT minigen kaset kullanarak pRS416. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: F1 astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) R2 RE.Y, DNA hedef kanadını 5 '5 sonunda' plazmid kesmek için tüketim HXGPRT min R1 ve F2 astar DNA hedef yan ve RE.Z 3 '3 sonunda' plazmid kesmek için astarrop18 bölgesinin silinmesi için hedef yapı oluşturmak için kullanılan igene kaseti. ° C. Primer dizileri. kalın bölgeler T. uygun gondii'den genomik dizisi ve nonbold bölgeler pRS416 ve HXGPRT minigen kaseti ile üst üste restriksiyon enzim bölgesi ve sekanslarına karşılık gelir. HX_F ve HX_R primer çifti HXGPRT minigen kaset ¹⁴ güçlendirir. Primerler 5'ten-3 'okuyun. Fentress ve arkadaşları ¹⁰ uyarlanan Tablo. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. HXGPRT kullanarak bir geninin iptali için protokol genel bir bakış. Bir. Disruption çift çapraz tarafından Δ ku80Δhxgprt gerginlik bir Goa bir ~ 1 Kbp 5 'DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3' plazmid pΔGOI DNA hedef yan kullanarak homolog rekombinasyon olay. Bir PCR PCR1 kullanarak strateji, PCR2, PCR3 ve PCR4 (ölçekli değildir) GOI odağı hedef HXGPRT entegrasyonu ve silme ile klonlar doğrulamak için genotip doğrulama sağlayan gösterilmiştir. B. Örnek primer çiftleri rop18 en silme doğrulamak için tasarlanmıştır . ROP18_DF ve ROP18_DR PCR1, ROP18_ExF ve ROP18_CxR PCR2, ROP18_CxF ve DHFR_CxR PCR4 (Şekil 2A bakınız) yükseltmek PCR3 ve DHFR_CxF ve ROP18_CxR yükseltmek yükseltmek yükseltmek. Primerler 5'ten-3 'okuyun. Tablo Fentress ve ark HXGPRT kullanarak bir hedef gen silme (rop18) doğrulama ^10. C. Temsilcisi sonuçları adapte. MPA içinde Δ ku80Δhxgprt ve seçim haline plazmid pΔROP18 takiben transfeksiyon +X, MPA + X dirençli klonlar rop18 en silinmesi için test edildi. Ebeveyn gerginlik kontrolü PCR 3 (~ 1.200 bp) ve PCR için PCR 1 (~ 400 bp) ve PCR 2 (~ 650 bp) ürün için pozitif ve negatif 4 (~ 1.300 bp) ürün. Bir hedef Goa nakavt PCR2, PCR3 ve PCR4 ürünleri için pozitif ve (Şekil 2A bakınız) PCR 1 ürün için negatiftir. Gösterildiği PCR1 ve PCR2 (üst panel) sonuçlarını temsili paneller PCR3 (orta panel) ve PCR4 (alt panel) vardır. Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 klon hedeflenen bir gen silinmesi olayları tanımlar PCR 1, PCR2, PCR3 ve PCR4 arasında doğru bir bant deseni gösterir. Klonlar, 1, 2, 7, 10 ve 12 gen silme değildir ve diğer potansiyel temsili sonuçlar karşılık gelmektedir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δhxgprt, M = boyutu işaretleri). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. İlgi konusu genin HXGPRT silmek için yeniden hedefleme için protokol bakış. Çift çapraz tarafından HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması gerginlik Δ ku80Δgoi homolog rekombinasyon olay :: HXGPRT bir ~ 1 Kbp 5 'DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3' plazmid pΔGOIc DNA hedef yan kullanarak A. Stratejisi. Genotip doğrulama için PCR stratejisi (ölçekli değildir) silme yayılan bir PCR ürünü (PCR5) için test için bir primer çifti kullanılarak tasvir edilmiştir. B. gra2 gelen HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması doğrulamak için tasarlanmış bir temsilci primer çifti gerginlik Δ ku80Δgra2 içinde odağı :: HXGPRT. Astarlar GRA2 _CLF ve GRA2_CxR PCR5 yükseltmek. Astarlar 5 ila 6TX içinde Δ ku80Δgoi :: HXGPRT ve seçim plazmid pΔGOIc arasında aşağıdaki transfeksiyon elde edilebilir 6TX dirençli klonların. ° C. Örnek paneli-3 'okuyun. Klonlar 4, 7, 9, 11 ve 12 HXGPRT marker hedef silme (~ 1.2 Kbp ürün olduğunu kanadını '5 ile hafif üst üste yan' ve 3 'dışında 3 açıklıklı karşılık PCR5 en doğru bantlama desen sergilemek yan). Klonlar 1, 2, 3, 6, 8, ve 10 (bu grup hafif) Bu klonlar izin 6TX direnç bir ölçüde sergiledi rağmen, ebeveyn klon genotip karşılık 3.4 Kbp ~ yaklaşık beklenen bant deseni temsil kendi seçimi (bu fenotip zaman (protokol 2.1 (adım 8) olarak not ve Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakın) kapatma HXGPRT ifade ile kendiliğinden ortaya çıkabilir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = boyutu işaretleri).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. Bir proteinin C-terminal ucuna etiketlemek için bir hedef DNA molekülünün tasarımı. Stratejisi aynı zamanda bir 3 'alt düzenleyici bölge olarak işlev HXGPRT marker yeteneğine dayanır. PΔGOItag omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. DNA hedef kanadını için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye bir ~ 1 Kbp 5 'Fgoi ve rtag astar, bir ~ 1 Kbp 3 kullanarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadını' olduğunu pRS416 takılı F2 ve R2 ile HXGPRT minigen kaseti ve pRS416astar ve HXGPRT minigen kaset. 5 'DNA hedef yan yerine bitirme kodonunun izlediği etiketi (HA, myc, His, vs) bir sonlandırma kodonu ile değiştirir. MPA + X seçimi ve C-terminal etiketi ve bir alt-HXGPRT entegre ve HXGPRT işaretleyici aşağıdaki bir konuma 3 'UTR hareket eder. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: Fgoi astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) DNA hedef yan 5 '5 sonunda' plazmid kesilmiş ve RE.Y 'de plazmid yapımı için kullanımına yeniden hedef etiketli gen lokusu silmek için HXGPRT minigen kaset tüketim için rtag ve F2 astar olarak DNA hedef kanadını 3 '3 sonunda' plazmid ve RE.Z kesmek için R2 astar 3 'UTR yerleştirilmesi geri yüklenir HXGPRT işareti.

Tartışmalar

Burada hedeflenen gen silme, gen yerine, ve / veya etiketli genlerin sahip genetik olarak manipüle döl etkin kurtarma sağlamak için Δ Ku80 parazit suşları hedef verimli gen için bir protokol sağlar. Bu yöntemlerin ardışık yürütüm ^1-3 tek veya birden fazla hedef içeren genetik manipülasyonlar parazit mutantların izolasyonu için güvenilir bir yöntem sağlar. Bir delesyonu üretimi birçok faktöre bağlıdır da, sunulan strateji ve protokole Δ Ku80 suşunun kullanımı büyük ölçüde T. kesin olarak tanımlanmış mutant yapma verimliliği ve kolaylığını arttırmaktadır Fonksiyonel çalışmalar için genomik gondii.

T. genomu eşeysiz aşamalarında gondii grubu yarı yarıya edilir. Bu nedenle, bir gen silmek için planlama yapmak için bir göz genin in vitro gerekli olmayabilir olmasıdır. Bununla birlikte, küçük kalkan veriminiΔ Ku80 suşları ting gen tırnakları son derece yüksek olduğunu ve bu önemli ölçüde bozulmuş çoğaltma oranları ile mutant suşların izolasyonu sağlar. Bir hedef gen gerekli ise, parazit genellikle seçimi sırasında çoğaltmak için ateşkes. Hedeflenen genetik manipülasyon bir diğer kritik faktör genomik hedef kanadını en az 620 bp tespit hedeflenen entegrasyon ² elde etmek için gerekli olan mükemmel bir homoloji olduğunu. Homoloji uzun bölgeleri hedefleyen ve yaklaşık 1000 bp DNA yanları hedef ^1-4 güvenilir ve verimli bir yaklaşımdır kullanarak yüksek verim üretmek. Bu nedenle, genomik hedef alan yanları T. Aynı soydan üretilen önemlidir genetik olarak manipüle ediliyor gerginlik olarak gondii (RH, Pru). Yeterli homolojiye eksikliği sıklıkla bir genomik hedef alan yan olarak hedeflenen entegrasyonu ile sonuçlanabilir, ancak diğer olamaz. Eksik entegrasyon veya bir nakavt ma elde etmek için başarısızlıky da epizomal sebat nedeniyle. Hemen transfeksiyon sonra, hedef moleküllerin tüm epizomlar nonintegrated ve bazen hedef moleküller nesiller için epizomlar olarak devam edebilir. ~ 1 Kbp hedef DNA yanları kullanarak ve önceki yeniden alt klonlama için seçimi altında parazitler geçmek için devam sık epizomal sebat ile ilgili sorunları giderir.

Bir nakavt doğrulanır ve HXGPRT işareti kaldırıldıktan sonra, gen hedeflemesi stratejisi ^1-3 tek bir parazit gerginlik birden fazla gen silme oluşturmak için ikinci bir Goa üzerinde tekrarlanabilir. Silme, değiştirme ya da etiketli genlerin üretimi de farklı seçilebilir belirteçler (bleomisin, CAT, primetamin, dayanıklı DHFR, vs) ile yapılabilir. CAT seçilebilir marker şu tip II Δ Ku80 Pru genom ¹ mevcut olsa da, bu işaretçi HXGPRT kullanılarak temizlenebilir seçimi Burada açıklanan protokol. Bizim ellerde, HXGPRT seçimi tek kopyasını hedef ekleme MPA + X orta. HXGPRT sağlam seçimi için yeterli olduğu en yüksek hedef verimlilik ile en güvenli ve en verimli işareti aynı zamanda bir hedeflenen silinmesi için sadece şu anda yararlı bir yaklaşım sağlar 6-thioxanthine (6TX) seçimi ^2,3 kullanarak seçilebilir işaretleyici (Şekil 3). Böylece bu protokolü birkaç hedeflenen genetik manipülasyonlar ile tanımlanan mutant suşlar geliştirmek için tek geçerli yaklaşım sağlar.

Bu protokol, Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları hedeflenen genetik manipülasyon için bir değerli ve etkili bir yöntem sağlar ve tek bir gen, bir gen ailesi veya genom fonksiyonel genomik çalışmaları analizi için de geçerlidir. Önce Δ Ku80 suşları ^1,2 durumu için, bu yaklaşımların ine nedeniyle yaygın olarak mümkün değildiBu yöntemlerin Verim. Sonuç olarak, bu protokol Toxoplasma gondii hedeflenen genetik manipülasyon için yaygın olarak uygulanabilir ve parazit biyoloji, konak cevabı, ve işlevsel genomik üzerinde sorular bir dizi ele ilgilenen tüm araştırmacılar için erişilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Overlap Primers	Integrated DNA Technologies		4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers	Integrated DNA Technologies		100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845	ATCC		Designation FY834
Shuttle Vector pRS416	ATCC	87521
DH10B E. coli	Invitrogen	12033-015	SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer	Qiagen		Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit	Qiagen	27104	QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads	Scientific Industries	SI-BG05	0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station	Qiagen
Electroporation Cuvette	USA Scientific	9104-5050	2 mm-gap
BTX600 electroporator	BTX
Maxiprep Kit	Qiagen	12662	QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask	Corning	430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask	Corning	430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells	ATCC	SCRC1041
Swin-lok Filter Holder	Whatman	420200	25-mm-diameter
Membrane	Whatman	110612	Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA)	Sigma
Xanthine (X)	Sigma
96-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
MEM Eagle Media	Lonza Biowhittaker	12-611F
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)	Gibco	15240-062
Spin Column	Primm Labs	PAE-100	Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
6-thioxanthine	Acros Organics
Tissue DNA Minikit	Qiagen	51104	QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media	Gibco	126-48-010
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30028.02	minus calcium, minus magensium