בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

Summary

אנו מתארים שיטת הדמיה לא פולשנית להבחנה שלבים דלקתיים. משלוח מערכתי של לומינול מגלה תחומים של דלקת חריפה תלויות על פעילות MPO בנויטרופילים. לעומת זאת, הזרקה של lucigenin מאפשרת הדמיה של דלקת כרונית תלויה בפעילות phox במקרופאגים.

Abstract

דלקת היא היבט בסיסי של מחלות בבני אדם רבים. בדו"ח הסרטון הזה, אנחנו מדגימים טכניקות פליטת אור הדמיה בלתי פולשנית המבדילות דלקת אקוטית וכרונית בעכברי מודל. עם נזק לרקמות או פלישת הפתוגן, נויטרופילים הם קו הגנה הראשון, ששיחק תפקיד מרכזי בתיווך התגובה הדלקתית חריפה. עם התקדמות התגובה הדלקתית, מונוציטים במחזור להעביר בהדרגה לאתר של פציעה ולהתמיין למקרופאגים בוגרים, אשר מתווכים דלקת כרונית ולקדם תיקון רקמות על ידי הסרת פסולת רקמה וייצור ציטוקינים נוגדות דלקת. זריקת intraperitoneal של לומינול (,4-phthalazinedione, מלח נתרן ,3-dihydro-1-5-2 אמינו) מאפשרת זיהוי של דלקת חריפה בתיווך במידה רבה על ידי נויטרופילים רקמות הסתננות. לומינול במיוחד מגיב עם סופראוקסיד נוצר בתוך phagosomes של נויטרופילים מאז תוצאות פליטת אור מmyeloperoxidase (MPO) תגובת תיווך. Lucigenin (חנקה BIS-N-methylacridinium) גם מגיב עם סופראוקסיד על מנת ליצור פליטת אור. עם זאת, פליטת אור lucigenin הוא עצמאית של MPO וזה אך ורק מסתמך על מונואמין NADPH תא בלען (phox) במקרופאגים בדלקת כרונית. יחד, לומינול וlucigenin לאפשר להדמיה לא פולשנית והערכת אורך של תא בלען אוכלוסיות שונות ברחבי שלבים דלקתיים הן כרוניים וחמורים. בהתחשב בתפקיד החשוב של דלקת במגוון רחב של מחלות בבני אדם, אנחנו מאמינים ששיטת ההדמיה לא פולשנית זו יכולה לעזור לחקור את התפקידים דיפרנציאליים של נויטרופילים ומקרופאגים במגוון רחב של מצבים פתולוגיים.

Introduction

דלקת היא תגובה ביולוגית מוסדרת מאוד מעורבת במגוון רחב של מחלות בבני אדם, ובכלל זה זיהום מיקרוביאלי ^1, ריפוי פצעים ^{2, 3} סוכרת, סרטן ^{4, 5} לב וכלי דם, ניוון עצב ^6, ומחלות אוטואימוניות ^7. דלקת רקמות דורשת תיאום נכון של תאי מערכת חיסון שונים על מנת להשיג אישור הפתוגן, תיקון רקמות, ורזולוציה מחלה. נויטרופילים ומקרופאגים הם מתווכים חיסוניים מרכזיים של דלקת ברקמה. בשלב החריף של דלקת, הנויטרופילים הם מגישי העזרה הראשונות לגירויים מזיקים שונים ונזק לרקמות ^8. את הנויטרופילים extravasate במהירות ממחזור לאתר של פציעה, שבו התאים להשבית פולשים חיידקים על ידי שחרור גרגרים ופאגוציטוזיס אנטי מיקרוביאליים. במהלך phagocytosis, נויטרופילים לבלוע את חיידקים פולשים לphagosomes, שבמהלכה התאים לייצר רמות גבוהות של superoxIDE (O ₂ · ^-). סופראוקסיד Phagosomal הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי רבים במורד הזרם (ROS). לדוגמה, ניתן סופראוקסיד dismutated למי חמצן (H ₂ O ₂₎ על ידי dismutation הספונטני או על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) ^{9, 10.} בנויטרופילים, myeloperoxidase (MPO) עוד יותר ממיר מי חמצן לחומצת hypochlorous אנטי מיקרוביאליים (HOCl) ^11. ככל שתגובות דלקתיות להמשיך, מונוציטים במחזור להעביר בהדרגה לאתר של פציעה ולהתמיין למקרופאגים בוגרים ^2, שphagocytic פונקציה לסייע להסיר פתוגנים מומתים ותא פסולת. בנוסף לכך, כרגולטור מרכזי בשלב מאוחר יותר של דלקת, מקרופאג מקדם תיקון רקמות על ידי ייצור ציטוקינים נוגד דלקת ¹² ועל ידי יצירת ROS תאי ברמה נמוכה ^9. ROS שנוצר בשלב מאוחר יותר לווסת את שיפוץ רקמות, היווצרות כלי חדשה, וreepithelialization ^13.

מונואמין NADPH תא בלען (phox) הוא המקור העיקרי לייצור סופראוקסיד בשני נויטרופילים ומקרופאגים ^9. Phox הנו קומפלקס רב למקטע הייצור שמוסדר בחוזקה ^9. Holoenzyme מכיל כמה יחידות משנה רגולטוריים cytosolic (P67 ^phox, p47 ^phox, P40 ^phox, וRAC) וheterodimer קרום הנכנס ציטוכרום b ₅₅₈ (מורכב מהמקטע CYBA וCYBB). ציטוכרום ב ₅₅₈ היא תגובת הליבה שבתוכו מקטע CYBB (הידוע גם בP91 ^phox וNOX2) מבצע תגובת שרשרת חיזור העיקרית ^9. מעניין לציין, כי אתרי הייצור שלה הם שונים בין נויטרופילים ומקרופאגים. בנויטרופילים מנוחה, ציטוכרום ב ₅₅₈ הוא בעיקר בהווה בקרום של גרגרי אחסון תאיים ^14. במהלך phagocytosis, נויטרופילים להרכיב את שעותoloenzymes ^ב9 phagosomes, שבו רמות גבוהות של פעילות MPO גם בהווה. נויטרופילים phox מהירות צורך חמצן ומפעיל כוח microbicidal על ידי ייצור ROS, תופעה שמכונה הנשימה פרץ ^11. בניגוד לכך, יש לי מקרופאגים רמה נמוכה יותר של ביטוי MPO וציטוכרום ב ₅₅₈ נמצא בעיקר בקרום הפלזמה ^{15, 16.} לפיכך נויטרופילים לייצר רמות גבוהות של סופראוקסיד לפעילות אנטי מיקרוביאלית, בעוד מקרופאגים לייצר פחות סופראוקסיד עבור פונקציות רגולטוריות ^15.

מאז דלקת היא תהליך מורכב בvivo, שיטות הדמיה בלתי פולשניות ספציפיות לשלבים שונים של דלקת תאפשר הערכה כמותית ואורך של מודלים מחלה. באמצעות מחקרים מכניסטית, יש לנו הוכיחו את השימוש של שני סוכני chemiluminescent, לומינול (5-אמינו-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione) וlucigenin (חנקת BIS-N-methylacridinium) בעבר, עבור הדמיה בלתי פולשנית של (כרוני) שלבים חריפים והמאוחרים של דלקת, בהתאמה ^17. לומינול מאפשר הדמיה של פעילות MPO נויטרופילים בשלב האקוטי של דלקת ^18-20, בעוד שניתן להשתמש בו כדי להעריך את פליטת אור lucigenin פעילות מקרופאג בשיתוף עם השלב המאוחר או דלקת כרונית ^17. בכתב היד הזה, השתמשנו בשני מודלים דלקת ניסיוניים (SC PMA וSC LPS) כדי להדגים שיטות הדמיה אלה.

Protocol

הערה: כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו מוסדיים והנחיות טיפול בבעלי חיים.

1. ריאגנטים ופתרונות

1. פתרון לPMA SC חיסון: הכן פתרון מניות של phorbol 12-13-Myristate אצטט (PMA) בשעה 5 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO. אחסן את פתרון המניות ב -20 ° C. לפני החיסון, להפשיר את פתרון המניות ולדלל את 1 מ"ג / מיליליטר PMA ב-PBS.
2. פתרון לLPS SC חיסון: lipopolysaccharide ממיסים (LPS מסלמונלה enterica סרוטיפ enteritidis) בPBS סטרילי במ"ג / מ"ל 1 לפני SC החיסון.
3. פתרון לומינול הדמיה שלב אקוטי: להמס לומינול (,4-phthalazinedione, מלח נתרן של 5 אמינו-2 ,3-dihydro-1) במלח רגיל סטרילית (0.9% NaCl) בשעה 10 מ"ג / מ"ל. ניתן לאחסן ב -20 ° C הפתרון לפני השימוש.
4. פתרון Lucigenin הדמיה שלב כרוני: ממיסים lucigenin (חנקת BIS-N-methylacridinium) במלח רגיל סטריליב2.5 מ"ג / מ"ל. ניתן לאחסן ב -20 ° C הפתרון לפני השימוש.

2. דגם PMA דלקת תת עורית

1. הרדימי עכברים בעירום NCR בחדר אינדוקציה עם 1-2% isoflurane. לאשר הרדמה כללית על ידי אובדן של תנועה וקצב נשימה קבועה. העבר את בעל חיים לחרטום מסופק עם גז isoflurane-מעורב ולשמור על בעלי החיים תחת הרדמה.
2. השתמש באלכוהול רפואי לנגב לנקות ולחטא את אזור ההזרקה בכנף השמאל.
3. באמצעות טכניקה סטרילית, להזריק 50 μl של פתרון חיסון PMA (המכיל 50 מיקרוגרם של PMA) לתוך החלל תת עורי בכנף השמאל. הסר את הנוזלים עודפים מאתר ההזרקה באמצעות כרית אלכוהול איזופרופיל. הימנע מהשימוש בשיכוך כאבים כפי שהוא עשוי להשפיע על תגובות דלקתיות.
4. הזז את בעלי החיים בחזרה לכלוב הדיור ולעקוב אחר התאוששותה מהרדמה בשיתוף פעולה הדוק. על מנת לסייע בהתאוששות, השתמש בכרית חימום כדי לשמור על בעלי החיים חמים.

3. דגם דלקת תת עורית LPS

1. הרדימי עכברי C57BL/6J עם 1-2% isoflurane בתא אינדוקציה. לאחר הקמת הרדמה כללית, להעביר את בעל חיים לחרטום מסופק עם גז isoflurane ולשמור על בעלי החיים תחת הרדמה.
2. השתמש באלכוהול רפואי לנגב כדי לנקות את אזור ההזרקה בשודד שמאל.
3. באמצעות טכניקה סטרילית, להזריק 50 μl של פתרון LPS החיסון (המכיל 50 מיקרוגרם של LPS) לשודד שמאל. הסר את הנוזלים עודפים מאתר ההזרקה באמצעות כרית אלכוהול איזופרופיל. הימנע מהשימוש בשיכוך כאבים כפי שהוא עשוי להשפיע על תגובות דלקתיות.
4. הזז את בעלי החיים בחזרה לכלוב הדיור ולעקוב אחר התאוששותה מהרדמה בשיתוף פעולה הדוק. השתמש בכרית חימום כדי לשמור על חם בעלי החיים במהלך התאוששות.

4. הדמיה פליטת אור של דלקת

1. להרדים את החיה בחדר אינדוקציה עם 1-2% גז isoflurane-מעורב. שיתוףnfirm הרדמה כללית על ידי אובדן של תנועה וקצב נשימה קבועה.
2. בעוד בעלי החיים עדיין בהרדמה, intraperitoneally (IP) להזריק את פתרון lucigenin (2.5 מ"ג / מ"ל) פתרון לומינול (10 מ"ג / מ"ל), או הדמיה דלקת אקוטית או כרונית, בהתאמה. המינון הסופי הוא 100 מ"ג / ק"ג ללומינול ו25 מ"ג / ק"ג לlucigenin. מינון נמוך יותר של lucigenin (10-15 מ"ג / ק"ג) יכול לשמש כדי למנוע רעילות אפשרית עבור כמה זני עכבר. סימני הרעילות כוללים קוצר נשימה ומצוקה נשימתית. יש המתח נמוכה C57BL/6J lucigenin סבילות מזן עירום NCR.
3. מעבירים את החיה לחדר ההדמיה של מערכת הדמיה פליטת אור.
4. לבצע הדמיה פליטת אור רציפה במרווחים של 1 דקות. כל צעד הדמיה מורכב של זמן רכישת דקות 1, f / להפסיק = 1, binning = 16 ועיכוב שניות 0.
5. בתוך פנל רכישת התמונה, כדי לאפשר הדמיה רבת שלבים רציפים, לחץ על רצף הגדרת button. לספק צעדי הדמיה מספיקים בפרופיל הרכישה כדי לקבוע פלט הארה מקסימאלי (בדרך כלל 15 צעדים של דקה אחת יספיקו). סעיף 15 דקות ההדמיה מאפשר מספיק זמן לספיגת מצע ומחזור דם מערכתי.
6. הסר את החיה מחדר ההדמיה ולהעביר אותו בחזרה לכלוב הדיור. על מנת לסייע בהתאוששות, השתמש בכרית חימום כדי לשמור על בעלי החיים חמים.
7. במהלך ניתוח שלאחר הרכישה, להשתמש בחבילת תוכנת ההדמיה כדי לחשב אות bioluminescent כוללת שיא דרך אזורים סטנדרטיים של עניין (ROI). התמונות הן הווה כמו זוהר בפוטונים / שנייה / ² ס"מ / SR עם סף מינימאלי ומקסימאלי שצוין. נתונים כמותיים מוצגים כשטף הכולל בפוטונים לשניים לכל החזר על השקעה.

תוצאות

בצענו הדמיה פליטת אור אורך להעריך דלקת אקוטית וכרונית במודלים של דלקת ניסיונית. Phorbol 13-12-Myristate אצטט (PMA) הוא חלבון קינאז אגוניסט חזק C (PKC) שמפעיל phox לייצור אניון סופראוקסיד ומעורר תגובות דלקתיות חריפות עזות ^21. הזרקת SC של 50 מ"ג של PMA בעכברים בעירום NCR גרמה לגירוי עו...

Discussion

בדו"ח זה, אנו מדגימים שיטת פליטת אור הדמיה לא פולשנית של דלקת ביצורי חיים. ניצול של שני מצעים זורח, לומינול וlucigenin, השיטה יכולה להבדיל בין שלבים שונים של דלקת. פליטת אור לומינול קשורה נויטרופילים בשלב החריף של דלקת, ואילו פליטת אור lucigenin מתווכת על ידי מקרופאגים בשלב ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA