In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.

Zusammenfassung

Die Entzündung ist ein grundlegender Aspekt der vielen menschlichen Krankheiten. In diesem Video-Bericht zeigen wir, nicht-invasive bildgebende Verfahren, die Biolumineszenz akuten und chronischen Entzündungen in Maus-Modellen zu unterscheiden. Mit Gewebeschädigung oder Erreger Invasion, sind Neutrophile die erste Linie der Verteidigung, spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der akuten Entzündungsreaktion. Da die entzündliche Reaktion fortschreitet, zirkulierenden Monocyten allmählich in der Stelle der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen, die chronische Entzündung zu vermitteln und zu fördern Gewebereparatur durch Entfernen Gewebedebris und Herstellung anti-inflammatorische Zytokine. Die intraperitoneale Injektion von Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion, Natriumsalz) ermöglicht den Nachweis einer akuten Entzündung weitgehend von Gewebe infiltrierenden Neutrophilen vermittelte. Luminol reagiert spezifisch mit dem Superoxid innerhalb der phagosomes von Neutrophilen seit Biolumineszenz Ergebnisse aus einer Myeloperoxidase (M erzeugtPO) vermittelte Reaktion. Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) reagiert auch mit Superoxid um Biolumineszenz zu erzeugen. Allerdings ist Lucigenin Biolumineszenz unabhängig von MPO und es verlässt sich einzig auf Phagozyten NADPH-Oxidase (Phox) in Makrophagen während der chronischen Entzündung. Zusammen ermöglichen Luminol und Lucigenin nichtinvasive Visualisierung und Längs Bewertung verschiedener Populationen Phagozyten in akuten und chronischen entzündlichen Phasen. Angesichts der wichtigen Rolle der Entzündung in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, glauben wir diese nicht-invasiven bildgebenden Verfahren können die differentiellen Untersuchung Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen.

Einleitung

Die Entzündung ist eine stark regulierte biologische Reaktion in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich mikrobieller Infektion beteiligt ^{1, 2} Wundheilung, Diabetes ^{3, 4} Krebs, Herz-Kreislauf ^{5, 6} neurodegenerativen und Autoimmunerkrankungen ^7. Entzündung im Gewebe erfordert eine sachgerechte Koordinierung der verschiedenen Immunzellen, um Erreger-Clearance, die Reparatur von Gewebe und Krankheiten Auflösung zu erreichen. Neutrophile und Makrophagen sind wichtige Immunmediatoren der Entzündung im Gewebe. In der akuten Phase der Entzündung, Neutrophile sind die ersten Responder auf verschiedene schädliche Reize und Gewebeschäden ^8. Die Neutrophilen schnell extravasieren von Umlauf zu der Stelle der Verletzung, wo die Zellen eindringende Mikroben durch Loslassen antimikrobielle Granulat und Phagozytose inaktivieren. Während Phagozytose, verschlingen eindringende Mikroben Neutrophilen in phagosomes, in dem die Zellen produzieren hohe Superoxidide (O ₂ · ^-). Phagosomes Superoxid ist die primäre Quelle von vielen nachgelagerten reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Beispielsweise können Superoxid, Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂₎ durch spontane Dismutation oder Superoxid-Dismutase (SOD) ^{9, 10} disproportionierten werden. In Neutrophilen, Myeloperoxidase (MPO) wandelt ferner Wasserstoffperoxid zu antimikrobielle hypochlorige Säure (HOCl) ^11. Da die entzündlichen Reaktionen weiter, zirkulierenden Monozyten allmählich in den Ort der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen ^2, dessen phagocytic Funktion zur Beseitigung von inaktivierten Krankheitserregern und Zelltrümmer. Darüber hinaus als wichtiger Regulator in der späteren Phase der Entzündung, fördert die Makrophagen die Reparatur von Gewebe durch die Herstellung anti-inflammatorischen Zytokinen ¹² und durch die Generierung von extrazellulären ROS auf einem niedrigeren Niveau ^9. Die ROS an diesem späteren Zeitpunkt generiert regulieren Gewebeumbau, Gefäßneubildung und reepitheliasierung ^13.

Phagocyte NADPH-Oxidase (Phox) ist die primäre Quelle der Superoxid-Produktion in beiden Neutrophilen und Makrophagen ^9. Phox ist ein Multi-Untereinheiten-Komplex, dessen Montage dicht ⁹ geregelt. Das Holoenzym enthält mehrere cytosolischen regulatorischen Untereinheiten (p67 ^phox, p47 ^phox, p40 ^phox und RAC) und eine Membran-gebundene Cytochrom b Heterodimer ₅₅₈ (aus der Untereinheit CYBA und CYBB). Cytochrom b ₅₅₈ ist die Reaktion Kern, in dem die CYBB Untereinheit (auch als p91 ^phox und NOX2 bekannt) führt die primäre Redox-Kettenreaktion ^9. Interessanterweise sind die Montage zwischen verschiedenen Standorten Neutrophilen und Makrophagen. In ruhenden neutrophilen Granulozyten Cytochrom b ₅₅₈ hauptsächlich in der Membran des intrazellulären Speichergranula ^14. Während Phagozytose, montieren die Neutrophilen holoenzymes bei phagosomes ^9, wo ein hohes Maß an MPO-Aktivität sind ebenfalls vorhanden. Die Neutrophilen Phox schnell verbraucht Sauerstoff und übt seine Macht durch mikrobizider ROS-Produktion, bezeichnet ein Phänomen, das respiratory burst ^11. Im Gegensatz dazu haben Makrophagen eine niedrigere MPO Expression und Cytochrom b ₅₅₈ hauptsächlich in der Plasmamembran ^{15, 16} vorhanden. So Neutrophilen hohe Mengen von Superoxid für eine antimikrobielle Aktivität, während Makrophagen weniger Superoxid für regulatorische Funktionen ¹⁵ zu erzeugen.

Seit Entzündung ist ein kompliziertes Verfahren in vivo, würde nicht-invasiven bildgebenden Verfahren spezifisch für verschiedene Phasen der Entzündung und damit quantitative Einschätzung der Längs-Krankheit Modellen. Mit mechanistische Studien haben wir zuvor die Verwendung von zwei chemilumineszierende Mittel, Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion) und Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) nachgewiesen, Zur nicht-invasiven Darstellung von akuten und späten (chronischen) Stadien der Entzündung bzw. ^17. Luminol ermöglicht die Visualisierung der neutrophilen MPO-Aktivität in der akuten Phase der Entzündung ^18-20, während Lucigenin Biolumineszenz kann verwendet werden, um Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit der späten Phase oder chronische Entzündung ¹⁷ beurteilen. In diesem Manuskript, verwendeten wir zwei experimentelle Entzündung Modelle (sc sc PMA und LPS), um diese bildgebenden Verfahren zu demonstrieren.

Protokoll

Hinweis: Alle Tierversuche wurden im Rahmen genehmigter institutionelle Protokolle und Tierpflege Leitlinien durchgeführt.

1. Reagenzien und Lösungen

1. PMA Lösung für sc Inokulation: Bereiten Sie eine Stammlösung von Phorbol 12-13-Acetat myristate (PMA) bei 5 mg / ml in DMSO. Bewahren Sie die Stammlösung bei -20 ° C. Vor Impfung, tauen die Stammlösung und mit Wasser auf 1 mg / ml PMA in PBS.
2. LPS-Lösung für sc Impfung: Lösen Lipopolysaccharid (LPS aus Salmonella enterica Serotyp Enteritidis) in sterilem PBS auf 1 mg / ml vor sc Impfung.
3. Luminol-Lösung für die akute Phase Imaging: Man löst Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion, Natriumsalz) in steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) mit 10 mg / ml. Die Lösung kann bei -20 ° C vor der Verwendung gelagert werden.
4. Lucigenin Lösung für chronische Phase Bildgebung: Lösen Lucigenin (Bis-N-methylacridinium Nitrat) in sterile Kochsalzlösungbei 2,5 mg / ml. Die Lösung kann bei -20 ° C vor der Verwendung gelagert werden.

2. Subkutane PMA Entzündung Modell

1. Anesthetize NCr Nacktmäusen in einer Induktion Kammer mit 1-2% Isofluran. Bestätigen Vollnarkose durch Verlust der Bewegung und eine konstante Atemfrequenz. Übertragen Sie ein Tier einem Nasenkegel mit Isofluran-Gasgemisch zugeführt und halten das Tier unter Narkose.
2. Verwenden Sie eine Isopropylalkohol abwischen zu reinigen und desinfizieren Sie die Injektionsstelle auf der linken Flanke.
3. Mit einer sterilen Technik injizieren 50 ul der PMA Impflösung (enthaltend 50 ug PMA) in den subkutanen Raum auf der linken Flanke. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Injektionsstelle unter Verwendung eines Isopropylalkohol Pad. Vermeiden Sie den Gebrauch von Analgetika wie es Entzündungsreaktionen beeinflussen.
4. Bewegen Sie das Tier wieder auf das Gehäuse Käfig und beobachten genau die Erholung von der Narkose. Um in der Genesung zu unterstützen, verwenden Sie ein Heizkissen, um das Tier warm.

3. Subkutane LPS Entzündung Modell

1. Anesthetize C57BL/6J-Mäusen mit 1-2% Isofluran in einer Induktion Kammer. Nach Gründung Vollnarkose, ein Tier zu übertragen, um eine Nase Kegel mit Isofluran-Gas geliefert und halten das Tier unter Narkose.
2. Verwenden Sie eine Isopropylalkohol abwischen, um die Injektionsstelle auf der linken Fußballen reinigen.
3. Mit einer sterilen Technik injizieren 50 ul der LPS Impflösung (enthaltend 50 ug LPS) in der linken Fußsohle. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Injektionsstelle unter Verwendung eines Isopropylalkohol Pad. Vermeiden Sie den Gebrauch von Analgetika wie es Entzündungsreaktionen beeinflussen.
4. Bewegen Sie das Tier wieder auf das Gehäuse Käfig und beobachten genau die Erholung von der Narkose. Verwenden Sie ein Heizkissen, das Tier warm während Erholung zu halten.

4. Biolumineszenz Imaging of Inflammation

1. Anesthetize das Tier in einer Induktion Kammer mit 1-2% Isofluran-Gasgemisch. Confirm Vollnarkose durch Verlust der Bewegung und eine konstante Atemfrequenz.
2. Während sich das Tier noch in der Anästhesie, intraperitoneal (ip) injiziert die Luminol-Lösung (10 mg / ml) oder die Lucigenin-Lösung (2,5 mg / ml) für die akute oder chronische Entzündung Bildgebung sind. Die letzte Dosis beträgt 100 mg / kg für Luminol und 25 mg / kg für Lucigenin. Eine niedrigere Dosis von Lucigenin (10-15 mg / kg) kann verwendet werden, um mögliche Toxizität für einige Maus-Stämme zu vermeiden. Anzeichen von Toxizität sind Kurzatmigkeit und Atemnot. Die C57BL/6J Stamm hat eine geringere Lucigenin Verträglichkeit als die NCr nackte Stamm.
3. Übertragen Sie das Tier in der Bildgebung Kammer eines Biolumineszenz-Bildgebung System.
4. Führen sequentielle Biolumineszenz-Bildgebung bei 1 min Intervallen. Jeder Schritt wird von bildgebenden 1 min Aufnahmezeit besteht, f / stop = 1, Binning = 16 und 0 Sekunden Verzögerung.
5. Innerhalb der Bildaufnahme-Panel, um sequentielle mehrstufigen Bildgebung zu ermöglichen, auf der Sequenz klicken Einstellung buTton. Für ausreichenden Bildgebung Schritte in der Akquisition Profil auf maximale Lumineszenz-Ausgang (in der Regel 15 einminütigen Schritten genügt) zu bestimmen. Der 15-min Abbildungsabschnitt lässt genügend Zeit für Saugfähigkeit des Untergrundes und systemischen Kreislauf.
6. Nehmen Sie das Tier von der Bildgebung Kammer und verschieben Sie sie in das Gehäuse zurückschieben Käfig. Um in der Genesung zu unterstützen, verwenden Sie ein Heizkissen, um das Tier warm.
7. Während nach dem Erwerb Analyse, verwenden Sie den Imaging-Software-Paket, um Peak insgesamt Biolumineszenz-Signal durch standardisierte regions of interest (ROI) zu berechnen. Die Bilder liegen als Ausstrahlung in Photonen / sec / cm ² / sr mit minimalen und maximalen Grenzwert angegeben. Quantitative Daten werden als gesamte Fluß in Photonen pro Sekunde und ROI vorgestellt.

Ergebnisse

Wir führten Längsrichtung Biolumineszenzimaging um akute und chronische Entzündung in experimentellen Modellen Entzündung zu beurteilen. Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) ist ein potenter Proteinkinase C (PKC)-Agonisten, die für Phox Superoxidanionproduktion aktiviert und löst intensive akute Entzündungsreaktionen ^21. SC Injektion von 50 mg PMA in NCr nackten Mäusen verursachte rasche Hautreizungen und akute Entzündung an der Injektionsstelle ^{18, 22, 23.} Wir führten täglich Bildgebung ...

Diskussion

In diesem Bericht zeigen wir, eine Biolumineszenz Verfahren zur nicht-invasive Bildgebung von Entzündungen in lebenden Tieren. Unter Ausnutzung der beiden Leuchtstoffe Substrate, Luminol und Lucigenin, kann das Verfahren unterscheiden verschiedene Phasen der Entzündung. Luminol Biolumineszenz mit neutrophilen Granulozyten in der akuten Phase der Entzündung assoziiert, während Lucigenin Biolumineszenz durch Makrophagen in der chronischen Phase vermittelt wird. Relativ kleine (MG = 177,16 g / mol) und elektrisch ungel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA