מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Summary

שחפת ומלריה הן שניים מהזיהומים הנפוצים ביותר בבני אדם וגורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. הקמנו מערכת מודל ניסיונית ללמוד תוצאה של coinfection מלריה שחפת בעכברים לאחר אתגר עם שני פתוגנים דרך התוואי הטבעי שלהם לזיהום.

Abstract

Coinfections מתרחש באופן טבעי עקב החפיפה הגיאוגרפית של סוגים שונים של אורגניזמים פתוגניים. זיהומים במקביל סביר ביותר לווסת את התגובה החיסונית המתאימה לכל פתוגן היחיד ועשויים ובכך משפיעים על הפתוגנזה ותוצאות מחלה. חולי נישאים עשויים גם להגיב באופן דיפרנציאלי להתערבויות אנטי זיהומיות. Coinfection בין שחפת שנגרם על ידי mycobacteria וטפיל המלריה Plasmodium, אשר שניהם coendemic בחלקים רבים של אפריקה שמדרום לסהרה, לא נחקר בפירוט. כדי להתקרב המאתגר אבל מבחינה מדעית וקליני שאלה רלוונטית מאוד איך חסינות מארח לווסת coinfection מלריה שחפת וכמובן של כל מחלה, הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לנתח את התגובה החיסונית שהושרו לשני פתוגנים במארח הנישאים . ראוי לציין, על מנת שרוב הזיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי בדיוק לחקות, אנו מבצעים ניסויזיהומים של עכברים עם שני פתוגנים על ידי מסלוליהם הטבעיים של זיהום, כלומר בתרסיס ועקיצת יתוש, בהתאמה.

Introduction

אוכלוסיות אנושיות לעתים רחוקות נחשפות לפתוגן אחד בלבד. במיוחד באזורים עם שכיחות גבוהה של זיהומים כגון אפריקה שמדרום לסהרה, coinfections מייצג בעיה של בריאות ציבור ראש אבל מעריכים מאוד. שחפת ומלריה הן הזיהומים חיידקיים וטפילים הנפוצים ביותר בבני אדם, בהתאמה, ותמשיך להיות גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. למרות החפיפה הגיאוגרפית הרחב בין שחפת והמלריה והמספר הגדול של אנשים בסיכון של coinfection, מעט מאוד ידוע על האינטראקציות בין הרגולטורים השונים, ולעתים קרובות מנטרלים חיסוניים וeffectors שהושרו בו זמנית נגד טפילי מלריה וחיידקים גבשושית בנישאים.

מודלים של מכרסמים של מעורבים זיהומים לאפשר אפיון תגובות חיסוניים ההפרש נגד פתוגנים שונים במארח אחד, ובכך לשפוך אור על influ ההדדיences הפתולוגיה ויסות ותוצאות קליניות של המחלה בודדת, אשר תסייע גם לזהות המלצות חדשות לטיפול ומניעה. הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לחקור את ההשלכות נגרמות על ידי זיהום במקביל עם שחפת Mycobacterium (MTB) ומיני Plasmodium המכרסם בתוך אותו המארח ^1. חשוב לציין, לחקות זיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי ככל האפשר, המודל שלנו מיישם את המסלולים הטבעיים של זיהום בשימוש על ידי שני גורמי המחלה. שחפת היא מחלה עוברת באוויר, שכן בראש ובראשונה באה לידי ביטוי בתוך הריאות. הסוכן סיבתי, MTB מועבר על ידי אנשים עם מחלה פעילה דרך מסלול התרסיס כאשר הם לגרש טיפות תרסיס זיהומיות במהלך שיעול או התעטשות. לכן, זיהום אירוסול הוא שיטת הבחירה לחקות זיהום טבעי. דור של חלקיקים הנישאים באוויר המכילים MTB יכול להיות מושגת על ידי השימוששל מערכת חשיפת משאיפת. תא חשיפת כל גוף זה מאפשר לחשוף חיות מעבדה לMTB המכיל טיפות תרסיס זיהומיות (איור 1) שבו הם נשאפים לתוך alveoli של הריאות שבו זיהום הוא יזם ^2.

מלריה ומצד שני היא מחלה וקטור נישא הנגרמת על ידי protozoan, Plasmodium טפיל apicomplexan אשר מועבר על ידי עקיצת יתוש Anopheline נשי באופן טבעי. במהלך ארוחת דם, sporozoites זיהומיות מופקדים מתחת לעור המארח ולאחר מכן להגיע לכבד דרך זרם הדם. בתוך הפטוציטים שהם מפתחים במהירות ולהתרבות לschizonts כבד השלבים. סופו של הדבר, schizonts הבוגר הקרע ולשחרר אלפי merozoites הדור הראשון פתוגניים לתוך זרם הדם שם הם ליזום מחזור מתקדם של פלישה אדומה תא, שכפול, קרע תא אדום, וreinvasion ^3. Contin מחזור החיים PlasmodiumUES כמו כמה merozoites להתפתח לשלבי הטפיל המיניים, gametocytes הזכר והנקבה, אשר יכול להיות נלקח על ידי יתושים במהלך ארוחות דם. ביתושים, sporozoites Plasmodium להתפתח בתוך ביצים המתגוררות בmidgut היתושים וסופו של דבר להגר לבלוטות הרוק להעברה הלאה ^ל3,4 מארח אחר.

בעוד במודלים של בעלי חיים ניסיוני המשלוח של MTB באמצעות התרסיס ומסלול ובכך הרלוונטי ביותר הוא נפוץ מאוד, מחקרים רבים זיהום ניסיון Plasmodium המכרסמים כוללים מחקרים על coinfection מלריה שחפת ^5-7 בוצעו על ידי הדבקה של עכברים עם אריתרוציטים parasitized, והוליד להידבקות במלריה בדם בשלב תוך הדרת שלב כבד בשלב הקלינית השקט. עם זאת, בשלב הכבד הוא צעד הכרחי במהלך זיהום ורלוונטי לחסינות נגד plasmodial ^8-11. אנחנו רואים את זה ולכן חשוב לכלול את ה-pH בכבדASE של שידור מלריה ותחזוקה בלימודים של שניהם מלריה וcoinfection מלריה שחפת, בהתאמה. בנוסף, זה כבר הראה כי sporozoites מועבר באופן טבעי יותר זיהומיות מאלה מועברים באמצעות מחט ¹² זיהומים, שגרמו לנו להקים את ההידבקות במלריה על ידי עקיצת יתוש במקום הזרקת sporozoites נגזר בלוטת רוק מבודדת. הדרך היחידה להשיג יתושים זיהומיות לשידור טבעי של טפילי מלריה היא לשמור על כל מחזור החיים של הטפיל בשני מארח החוליות (כאן בעכבר) ווקטור היתוש. לפיכך, גישה לinsectary לתחזוקת הטפיל היא בלתי נמנעת על מנת לבצע העברת טבעית על ידי נשיכה.

הפרוטוקול שלנו שיתואר בהמשך פותח כדי לחקור כיצד coinfection עם Plasmodium sporozoites משפיע על שחפת כרונית ^1. לשם כך, עכברים נגועים בתרסיס עם מ ' שחפת ו40 ימים לאחר מכן, כאשר מ ' זיהום השחפת הגיע לשלב הכרוני, עכברים שנחשפו ליתושי מלריה מדבקת. תוצאתם של שתי מלריה ושחפת בבעלי החיים הנישאים יכולה להיות מלווה ניטור parasitemia דם ועומס חיידקים ברקמות, בהתאמה. בפרוטוקול שלנו, נתאר בפירוט כיצד להדביק עכברים עם שני פתוגנים דרך כביש הזיהום הטבעי שלהם וכיצד לאשר העברת הפתוגן מוצלחת. בידיים שלנו, שיעור הזיהום הנפוץ השיג עבור שני הזיהומים הניסיוניים הוא 100%. יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה ללמוד שני זיהומים בנפרד או, כפי שאנו עושים, למודל וללמוד coinfection בין שתי המחלות זיהומיות האדם המאתגרות ביותר. מודל זה ישים למינים Mycobacterium וPlasmodium מכרסמים אחרים מעבר לאלה שתוארו בפרוטוקול זה.

Protocol

אמצעי בטיחות והצהרת האתיקה

המחקרים שהוצגו במסמך זה כרוך בעבודה עם הפתוגן האנושי MTB וטפיל המלריה המכרסם Plasmodium berghei (פ berghei). ניסויים עם MTB (H37Rv זן) ופ berghei חייבת להתבצע בתנאי הבטיחות הביולוגיים המתאימים. רמת בטיחות ביולוגית (מנהלת הליגה) 2 מעבדות נדרשות לטפילי מלריה מכרסם כגון פ berghei ומנהלת הליגה 3 לMTB ולכן, לכל מחקרי coinfection מתואר כאן. הערה: עכברים נגועים בMTB אינם מתפשטים הזיהום לעכברים אחרים בסביבה קרובה (התצפית שלנו). התפשטות לנסיין ניתן לשלול לכן; בגדי מגן מתאימים עם זאת יש להיות משוחק בתוך המעבדה מנהלת הליגה 3 בכל העת. על פי הכללים שלנו, הנסיינים לבוש מסכת מנתחים, רשתות לשיער, מנשימים חד פעמי, ושני זוגות כפפות, מתוכם החיצוני אחד הוא מושלכת בכל עתrms הם נסוגו מהארון. חדש לשים על לפני הכניסה לארון שוב. שני מיכלים, אחד עם 2% Buraton (הערה: חומרי חיטוי אחרים שאושרו כדי להשבית MTB ניתן להשתמש בריכוז שאושר) לחומרי פסולת נוזליים וזיהומיות ואחד לטיהור פני השטח, מוכנים לפני הניסוי והניחו בתוך הארון. בנוסף, שקיות ניילון תשמש לפסולת מוצקה לא מידבקת. על פי כללים גרמנים, את כל העבודה כרוכה בטיפול ועיבוד של תרבויות MTB או רקמות נגזרות מMTB נגוע עכברים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי ברמת 2 בתוך מעבדה BSL3. בזמן טיפול mycobacteria, צעדים שיש לנקוט כדי למנוע את הדור של אירוסולים בכל העת.

נקבה עכברי C57BL / 6 (Charles River) בגילים שבין 6-8 שבועות שימשו לכל ניסויי coinfection וקיומם תחת תנאי מחסום מסוימים במנהלת הליגה 3 מתקנים. טיפול בבעלי חיים וניסויים היו PErformed בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במשרד חקלאות, איכות הסביבה, והאזורים הכפריים של המדינה שלזוויג הולשטיין

לקבלת שלבי יתושים מלריה, עכברי NMRI נרכשו מריבר המעבדה צ'ארלס, Sulzfeld, גרמניה והוחזקו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים בתוך מתקן היידלברג אוניברסיטת החי (IBF). כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות אירופאיות ואושרו על ידי רשויות המדינה באדן וירטמברג (Regierungspräsidium קרלסרוהה).

1. זיהום תרסיס של עכברים עם MTB באמצעות גלאס-Col תרסיס קאמרי

הדרך הטובה ביותר לתקן זיהום אירוסול של חיות ניסוי עם MTB היא להשתמש mycobacteria ממניות קפוא עם כותרות CFU ידועות. כדי להכין תרבויות המניה, תרבות MTB במרק מידלברוק 7H9 בתוספת OADC (אולאיתהחומצה, אלבומין, דקסטרוז, Catalase) Tween העשרה הבינוני ו0.05% 80, מקור פחמן לmycobacteria ולמדוד כדי למנוע הצטברויות חיידקים באותו הזמן. תרבויות צריכים ≤ OD 1 בעת הקציר. בOD גבוה יותר, עליות הצטברויות חיידקים וירידות כדאיות. 1 מיליליטר aliquots החנות ב -80 ° C. לקבוע את מספר המושבה קיימא להרכיב יחידות (CFU) במניות קפוא על ידי ציפוי סדרה של דילולים 10 פי שלושה בקבוקונים עצמאיים על 7H11 צלחות אגר השלימו עם גליצרול 0.5%, asparagine גרם 1 / L, וOADC ולמנות את המושבות לאחר 4 שבועות של דגירה על 37 ° C. בצע זיהום אירוסול כמתואר להלן.

1. מניות ההפשרה MTB של כייל CFU ידוע ובזהירות לערבב את ההשעיה חמש פעמים כדי לפזר גושי חיידקים באמצעות מצויד במחט G 27 מזרק 1 מיליליטר. הימנע מהייצור של אירוסולים.
2. בהתאם למינון הזיהום הרצוי, להעביר את הנפח הנדרש של מניות mycobacterial לתוךצינור 50 מיליליטר המכיל PBS סטרילית. הנפח הסופי הוא 6 מיליליטר. הערה: על ידי שינוי מספר מיקרואורגניזם בהשעיה זו, חלקם של חיידקים הנושאים טיפות תרסיס מגוונת. אנחנו בדרך כלל מכוונים לספיגה של 100 חיידקי קיימא לריאות (דלקת במינון נמוך). מניסיוננו, זה דורש סביב 1-2 x 10 ⁶ MTB / מיליליטר בנפח כולל של 6 מיליליטר של ש5.5 מיליליטר הם nebulized (ראה להלן). מומלץ לעשות סדרה של אתגרים בתרסיס ניסיוני עם ריכוזים שונים של חיידקים כדי למצוא את התנאים אידיאליים לזיהום שלך. בעוד שניתן לעשות זיהומים במינון גבוה עם עד 5,000 mycobacteria כדי לזרז את תהליך זיהומיות, כמה כמו 5 חיידקים ניתן להשתמש כדי להדביק בהצלחה בעכברים על ידי תרסיס. שיעור ההדבקה הוא בדרך כלל 100%.
3. הסר נפח מספיק (שהוכן בעודף של נפח הסופי חובה) לציפוי כדי לקבוע את כייל הבידוד; אנחנו בדרך כלל להסיר 500 μl לצלחת triplicates הטכני.
4. הנח בעלי חיים בסל מחולק רשת (עכבר אחד לכל סל) בתוך תא התרסיס המעגלי ולסגור את המכסה של החדר בתרסיס. הערה: מודלים אחרים מצוידים בסל בצורת עוגה המורכב מחמישה תאים נפרדים, כל אחד מהם יכולים להכיל 20 עכברים.
5. צרף את היחידה ונטורי-nebulizer לשלושה מפרקי שקע הנירוסטה.
6. הסר את ההשעיה mycobacterial מצינור 50 מיליליטר עם מצויד במחט קהה 18 G מזרק 10 מיליליטר ולשאת את המזרק לתא אירוסול בתיבת הובלה סגורה.
7. הסר את מכסה הבורג של יחידת nebulizer וזהירות להזריק את ההשעיה mycobacteria לnebulizer. הימנע מהדור של אירוסולים. מחק את המזרק לתוך מיכל חד המכיל 2% Buraton. לאטום nebulizer עם כובע הבורג.
8. הפעל את מתג החשמל הראשי ומנורת UV. התצוגה בלוח מקשי הבקרה מציגה "Apparatus גלאס-Col Co".
9. סובב את מתג התכנית ב. תציגלהראות "האם nebulizer מוכן?" "האם הסל טעון?" הקש Enter כאשר מוכן ". לחץ על Enter.
10. התצוגה מראה "הזן מחממים זמן 900", זה אומר הזמן מחממים למשרפה (שמטהר אוויר הפליטה) היא 900 שניות. לחץ על Enter.
11. התצוגה תראה "הזן זמן Nebulizing 1,800", זה אומר זמן nebulizing מוגדר 1,800 שניות כברירת מחדל. על מנת להאריך את זמן nebulizing, הזן "2,400" ולחץ תנטר. הערה: במהלך מחזור nebulizing, אוויר בלחץ atomizes ההשעיה, ובכך לייצר טיפות תרסיס קטנות המכילות mycobacteria. עם זרימת האוויר הראשית, טיפות אלו (כ 2-5 מיקרומטר בגודל) מתבצעות לתוך התא בתרסיס.
12. התצוגה תראה "הזן זמן תקליטור 1,800", זה אומר שמחזור הריקבון לוקח 1,800 שניות. מוגדר "2,400" ולחצו תנטר. הערה: במהלך מחזור זה, הענן שכבר בנוי up בתא התרסיס במהלך מחזור nebulizing יכול להירקב. הטיפות קטנות הם נשאפות על ידי חיות ניסוי.
13. התצוגה תראה "הזן זמן דצמבר 900", זה אומר שמחזור טיהור אור UV ייקח 900 שניות. לחץ על Enter. המכונה תתחיל רכיבה דרך מחממים, nebulizing, ריקבון ענן וטיהור UV.
    זהירות: מד זרימת הוואקום צריך לציין 60 רגליים / שעה מעוקב (לבדוק מתי מחזור מחממים מתחיל; להתאים שסתום בקרת ואקום במידת צורך) ומד זרימת האוויר הדחוס 10 רגל מעוקב / שעה (לבדוק מתי nebulizing מתחיל מחזור; להתאים שסתום בקרת אוויר בהתאם ).
14. כאשר המחזור יושלם, המקשים יראה "תהליך שלם - הסרת דגימה". כבה את התכנית, UV ומתג הפעלה ראשי.
15. בדקו אם ההשעיה mycobacterial כבר nebulized לחלוטין ואם לא, רשום את הנפח שנותר על ידי הסרת בזהירות את ההשעיה עם מצויד במזרק מתאיםמחט קהה 18 G. הנפח שנותר לא צריך להיות יותר מ 1 מיליליטר.
16. הסר את nebulizer מהמפרקים ולמקם אותו במחבת המכילה Buraton 2% למינימום של 2 שעות, בדרך כלל חיטוי נעשה O / נ לאחר מכן, להעביר את nebulizer למחבת נקיה ושטוף היטב במים. השאר nebulizer לאוויר יבש.
17. פתח את תא התרסיס ולהחזיר חיות לכלובים שלהם. שקית הסלים בשקיות וחיטוי החיטוי. נקה את המשטחים של החלק הפנימי של החדר בתרסיסים עם 2% Buraton הערה:. מטעמי בטיחות, מונשמים לטיהור אוויר מופעל צריכים להיות משוחק במהלך הליך זה.
18. שימוש 500 μl הנותר של ההשעיה mycobacterial (ראה שלב 1.3) פי 10 דילולים צלחת של שלושה עותקים טכניים (3 x 100 μl) ב7H11 צלחות אגר.

2. ודא ספיגה של CFU הרצוי בריאות

יום אחד לאחר הדבקה בתרסיס של חיות ניסוי לקבוע את lo החיידקיםמודעה של הריאות של חיות בקרה ייעודיות על מנת לוודא את הספיגה של CFU הרצוי. הערה: אנחנו בדרך כלל לייעד קבוצה נוספת של 3-5 עכברים ליום 1 נחישות CFU.

כדי לפקח על מהלך זיהום MTB לאורך זמן, נטל רקמת mycobacterial יכול להיבחן על ידי ציפוי דילולים סדרתי של homogenates האיבר כולו להגדרה CFU. הריאות היא האתר העיקרי לביטוי מחלה שבחפת עם זאת בלוטות טחול, בכבד ובהלימפה בדרך כלל ניתחו בהתאם. דילולים להיות מצופים תלויים בעומס הצפוי mycobacterial באיברים, אשר תלוי בבידוד הראשוני (במינון נמוך לעומת מינון גבוה), מה שמוליד המון חיידקים שונים ברקמות, כמו גם על האיברים ונקודת זמן להיות מנותח. עם זיהום במינון נמוך, עומס החיידקים של MTB H37Rv בריאה בדרך כלל מגיע לרמה שבין 25-30 היום.

1. הנח חיות מורדמים (המתת חסד: CO ₂ או מחנקהרדמה מסוף) על נייר סופג על לוח לנתח בארון בטיחות ביולוגי ברמה השנייה ולחטא עכברים עם 70% אתנול. הערה: אלכוהול 70% הוא לטיהור פני השטח בלבד, ולא יהרוג את MTB.
2. לעשות חתך קטן באמצע הבטן ולחזור בו העור של העכבר מעל לראש.
3. פתח את הבטן ואת כלוב בית החזה במספריים כירורגית ולהסיר את קיר בית החזה, כך שהריאות הן נגישות.
4. הסר את הריאות ולהעביר לתוך צינור 15 מיליליטר עם חיץ הומוגניזציה (מים סטריליים / 1% Tween v v / 80/1% w / v אלבומין).
5. באמצעות הבוכנה של ריאות 5 מתח מזרק מיליליטר דרך 100 מיקרומטר מסננות לתוך צלחת פטרי קטנה.
6. מסננות סומק מספר פעמים באמצעות פיפטה 1 מיליליטר מצויד בקצה מחסום ולהפיץ את homogenate הריאות בקרב 8 צלחות אגר (ca 250 μl / צלחת;. לוודא שיש להם משטח מיובש היטב).
7. צלחת בזהירות את הדגימות באמצעות מפזרי חד פעמי אשר מושלכים לתוך 2%Buraton.
8. השאר צלחות אגר לייבוש בתוך הארון. חותם כל צלחת עם parafilm, לעטוף ברדיד אלומיניום והדגירה זקוף ב37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 4 שבועות.

3. בניית כלובי כילה נגד בריחה הוכחה

זנים מכרסמים Plasmodium אינם מזיקים לבני אדם. עם זאת, מאז עכברים נגועים ב-MTB הם הנמענים של הטפיל והעבודה נעשה תחת מנהלת הליגה 3 תנאים, אמצעי הזהירות נחוץ כדי למנוע את היתושים לברוח הכלובים שלהם. בהתאם למשטר הזיהום המתוכנן, ניתן להשתמש בם לשימוש חוזר autoclavable וכלובי מתכת מסגרת או כלובים חד פעמי מתוצרת עצמית. אלה האחרונים מומלצים אם על ידי זיהום נשיכה של חיות ניסוי נדרש להתבצע על ידי מספר מוגדר של יתושים לכל עכבר. אם כלובים מתוצרת עצמי נדרשים, להכין את הכלובים למפרט על בריאותם של היתושים ואת הבטיחות של המעבדה מדויק תלוי סוnd בנייה (איור 2).

1. קח קרטון כמו קופסת גלידה חצי ליטר או כוס קפה מנייר (איור 2).
2. לחתוך פתח קטן לצד השני של הקרטון ומכסים בשכבה כפולה של לטקס עם פתח בכל חתיכה כדי ליצור כניסה מאובטחת ליתושים. הערה: הפתיחה יש גודל כולל של 2 ס"מ X 2 סנטימטר, צינורות (מכשיר aspirator) שאנו משתמשים כדי להביא ו / או לקחת את יתושים הוא צינור 15 מיליליטר פלקון שונה מחובר למשאבת ואקום ולכן משמש כ aspirator בקוטר של 1.5 סנטימטר.
3. הדבק פיסת נייר סינון בתחתית הפנימית של הקרטון כדי לספוג את הטיפות.
4. סגור את כוסות גלידה עם רשת (שכבה כפולה של רשת ניילון, מ"מ x 1 מ"מ גודל 1) ולתקן לקרטון על ידי קלטת וגומייה.
5. עבור ניסויי זיהום שבו מספרים מוגדרים של יתושים לכל עכבר נדרשים, להכין את הכלובים עם 10-15 יתושים נגועים, כל אחד מהם באופן אידיאלי מכיל average של 10,000 בלוטת רוק פ wild-type sporozoites berghei.
6. באופן אידיאלי, להרעיב את היתושים ל24 שעות קודם לביצוע ארוחת דם.

4. זיהום מלריה של עכברים על ידי עקיצת יתוש

טפיל המלריה המכרסם בשימוש במסמך זה פ לעומת זאת כל זן Plasmodium מכרסמים אחר של עניין יכול לשמש berghei. כדי להשיג יתושים זיהומיות לשידור sporozoite כל מחזור החיים של הטפיל נשמר בשני מארח החוליות (עכבר) ווקטור היתוש. תחזוקת טפיל מתבצעת בinsectary. עבור ניסויי שידור טבעיים, המספר המינימאלי של sporozoites לבלוטת רוק צריך להיות לא פחות מ 10,000. לפרוטוקולים מפורטים על תחזוקת טפיל אנו מתייחסים לשיטות מחקר במלריה על ידי מול et al. 2013.

1. לטשטש עכברים או חיות preinfected 40 יום עם MTB עם קטמין נאיביים (100 מ"ג / קילוגרם)פתרון וXylazine (7 מ"ג / קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal (200 μl / עכבר). הערה: בפעם בין זיהום MTB וPlasmodium יכול להיות מותאמת בהתאם לשאלת המחקר הבסיסית. כמו כן, את סדר אתגרי הפתוגן יכול להיות הפוך, יכולים להיות חשופים עכברים כלומר לעקיצת יתוש זיהומיות לפני זיהום MTB.
2. הנח עכברים מורדמים גבי הרשת של כלובי יתושים (עכבר אחד לכלוב יתוש ליתוש מוגדר יחס עכבר) ולאפשר היתושים להאכיל דרך הממברנה של 10-15 דקות. הערה: הנוכחות של דם במעיים של היתוש מרמזת האכלה ובכך, שידור sporozoite.
3. העבר את העכברים בחזרה לכלובים שלהם ולפקח עד שהם מתעוררים מהרדמה כל הזמן. הערה: עכברים מניחים על מגבת נייר ולא על מצעים (סכנת חנק) ולשמור (מקום יחד באופן הדוק ולכסות את הגוף עם מגבת נייר) חם.
4. להרוג את היתושים על ידי ריסוס אותם עם 70% אתנול או חומרי חיטוי אחרים באמצעות נטוing של הכלוב. כלובים וחיטוי להשליך אם אלה הפנוי היו בשימוש.

5. Parasitemia ניטור

1. זנב לנקב ורידים ממש בסוף עם מחט ולאסוף טיפת דם אחת בכל קצה של שקופיות.
2. השתמש בשקופית אחרת כדי למשוך את טיפת דם אחת יותר ממחצית האורך של השקופיות. להתהפך המפזר להשתמש בקצה האחר למריחה השנייה. עזוב את השקופיות לייבוש באוויר.
3. כתם Giemsa
   1. הנח שקופיות בבעלי שקופיות ולתקן את כתמי דם על ידי טבילה קצרה במתנול המוחלט. הערה: מאחר שהשימוש בכלי זכוכית צריך להיות כל הזמן במינימום במנהלת הליגה 3 אנו משתמשים cuvettes פוליפרופילן לכל הפתרונות.
   2. לטבול את המריחות בGiemsa (1:10 במי deionized). לאחר 10 דקות, טובל את השקופיות ובמתוך cuvettes מכתים מלא מים deionized כמה פעמים כדי לשטוף את הכתם העודף.
   3. לבסוף, שקופיות אוויר יבשות במצב אנכי.
4. כתם חלופי: # רייט &180; של כתם
   1. לפזר הכתם של רייט בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר במתנול.
   2. לסנן דרך מסנן מקופל לפני השימוש.
   3. לטבול את כתמי הדם בפתרון מכתים ודגירה של 4 דקות (הערה: קיבעון מתנול של מריחות לא הכרחי כפתרון מכתים הוא מתנול מבוסס).
   4. לשטוף שקופיות שטיפה במי deionized כפי שתואר לעיל ולהשאיר שקופיות לייבוש באוויר.
   5. ברגע שהכתם של Giemsa / רייט הוא מלא, בעדינות להעביר את כל חומרים כימיים המשמשים לתוך סיר לרשות המכיל Buraton.
5. ניתוח כתם דם
   1. נתח את כתמי דם מוכתמים על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 100 עם טבילת שמן.
   2. רוזן אריתרוציטים נגוע ונגועים בשטח של כתם הדם שבי אריתרוציטים מסודרים בשכבה.
   3. על מנת להשיג parasitemia מוגדר היטב, לספור לפחות 10 שדות מבט שונים בו מוצגות monolayer כדורית אדומה.
   4. Calculאכלתי parasitemia היחסי (ב%) על ידי חלוקת מספר אריתרוציטים parasitized במספר אריתרוציטים והכפלה ב -100.

תוצאות

זיהום של עכברים עם MTB ופ berghei דרך התוואי הטבעי, כלומר בתרסיס ועקיצת יתוש, בהתאמה, בתוצאות זיהום של כל בעלי החיים (טבלת 1) עקבי לשחזור ^1. אנחנו יכולים לפקח על זיהום מוצלח וכמובן של שניהם מלריה ושחפת על ידי קביעת ההתרחשות הראשונית (prepatency) ומספר הטפילים בדם (parasitemia פ berghei) ואת הנטל של MTB באיברים שונים, בהתאמה. דוגמא להעברת טפיל מלריה מוצלחת על ידי עקיצת יתוש זיהומיות מוצגת בטבלה 1 ואיור 3. האכלה של 10 יתושים נגועים sporozoite על כל עכבר הביאה לשיעור זיהום 100% כפי שאושרה על ידי הנוכחות של טפילי דם בשלב 4-5 ימים מאוחר יותר (טבלת 1 ואיור 3 א). חשוב מכך, אנו מוצאים מספרי טפיל דומים בדמם של עכברים בודדים של אותו גר ניסיוניOUP, המציין כי העברת sporozoite ידי תוצאות עקיצת יתוש בזיהום עקבי ושחזור. על ידי השוואת prepatency בעכברי שליטה נאיביות עם זה בחיות MTB-נישאים, אנו יכולים לראות prepatency שמתעכבת מעט בעכברים שהיה preinfected עם MTB (טבלת 1, איור 3 ב) ^1. כפי שכבר דווחו בעבר ^1, אנו יכולים לקבוע את ההשפעה של coinfection MTB על המהלך של מלריה על ידי parasitemia ניטור היומיומי בכתמי דם צבעוניים Giemsa כפי שמוצג באיור 3.

זיהום של עכברים עם MTB על ידי השימוש בתוצאות מערכת חשיפת משאיפת בתצהיר מוצלח של חיידקים לריאות עם השתנות נמוכה יחסית בין עכברים הבודדים (איור 4 א). אנחנו יכולים לעקוב אחר עומסי mycobacterial ריאות ואיברים אחרים של עניין לאורך זמן על ידי נחישות CFU. דוגמא לעומס mycobacterial ריאות שלMTB נגוע C57BL / 6 עכברים בהעדר או הנוכחות של פ berghei מוצג באיור 4.

טבלת 1. Prepatency לאחר שידור sporozoite על ידי עקיצת יתוש. כל העכברים פיתחו זיהומים בדם בשלב לאחר שידור טבעי של פ berghei sporozoites על ידי עקיצת יתוש. מעובד מתוך ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו.

קבוצת עכבר ניסיונית (C57BL / 6)	אתגר על ידי 10 עקיצות יתושים זיהומיות	מס 'של דם בשלב חיות / מס חיובי של חיות לכל קבוצה	Mean prepatency [ד]
נאיבי	פ berghei	7/7	4,4
MTB נגוע	פ berghei	7/7	5,5 ד>

איור 1. תכנית כוללת של ההליך ניסיוני. C57BL / 6 עכברים שנחשפו לטיפי תרסיס MTB המכילים בתא תרסיס גלאס-Col. יום אחד לאחר הדבקה בתרסיס, את הספיגה של MTB מאומתת על ידי ניתוח CFU של הריאות. 40 ימים לאחר אתגר MTB (כשמחלת השחפת הפכה לכרונית בעכברים נגועים), בעלי חיים שנחשפו לפ berghei נגוע יתושים. כדי לאשר את העברת sporozoite מוצלחת ולעקוב אחר המהלך של זיהום Plasmodium, parasitemia מנוטר יומי בכתמי דם צבעוניים Giemsa מתחילים 3 ימים לאחר עקיצת יתוש.

/ Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/>
איור 2. סקיצה של כלוב יתושים. יתושי זיהומיות כלולים בתוך קרטון כמו קופסת גלידה חצי ליטר. פתח קטן הוא חתך לתוך הצד של הקרטון ומכוסה בשכבה כפולה של לטקס עם פתח בכל חתיכה כדי ליצור כניסה מאובטחת ליתושים. פיסת נייר סינון היא מודבקת בתחתית הפנימית של הקרטון כדי לספוג את הטיפות. כוסות גלידה הם סגורות עם רשת (רשת ניילון) שהוא קבוע לקרטון על ידי קלטת וגומייה.

איור 3. parasitemia דם לדוגמא.) של כתם דם מוכתם רייט `s מראה אריתרוציטים parasitized (סרגל קנה מידה, 20 & #181;. Parasitemia מ ') B) בדם עכבר היה פיקוח על ידי ניתוח כתמי דם צבעוני Giemsa יומיים. יש עכברי נישאים parasitemia מופחת בהשוואה לעכברי Plasmodium אחת נגועים (n = 10); תוצאות מוצגות כאמצעי ± SD; *** p <0001. הודפס מ ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו.

איור 4. זיהוי של MTB בריאות. עכברי C57BL / 6 היו תיגר עם תרסיס של MTB 100 CFU ו40 ימים לאחר מכן, נישאים עם פ חיידקי B berghei על ידי עקיצת יתוש.) יום אחד לאחר הדבקה בתרסיס את הספיגה של המספר הרצוי של MTB אומתה על ידי ציפוי homogenates ריאה כולה לקביעת CFU).המון l בזמן coinfection נקבעו בlysates ריאות של 3 עכברים באמצעות ניתוח CFU (d40/d0 MTB). 12 ימים לאחר coinfection, lysates ריאות היו מצופה לניתוח CFU כדי לקבוע את ההשפעה של coinfection Plasmodium על שליטת MTB. שים לב, שמספרי MTB בריאות עלו במהלך coinfection עם פ berghei NK65. תיוג ציר ה-X: פעם אחר -infection/time MTB לאחר coinfection. מעובד מתוך ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו.

Discussion

אנחנו תיארתי כיצד עכברים יכולים להיות נגועים באופן פרודוקטיבי עם MTB ופ berghei דרך נתיביהם הטבעיים של זיהום. אנחנו מיישמים הוקמו פרוטוקולי זיהום ללמוד ניסיונית שחפת ¹³ או מלריה ¹² ולאחרונה אימצנו אותם ללמוד coinfection בין MTB וPlasmodium במודל העכבר ^1.

השלבים הקריטיים ביותר לזיהומים מוצלחים הם השידור של שני פתוגנים במספרים הרצויים. מניות mycobacterial לא צריכים להיות מבוגרות יותר מ 2 שנים, כי הם יאבדו את יכולת קיום לאורך זמן, וכיילו במקור הנחוש של המניות סבירות להניח שכבר לא יהיו מדויק. כתוצאה מכך, מינוני זיהום יהיו נמוכים בהרבה מהצפוי. לכן, כותרות CFU של תרבויות המניה צריכה להיקבע בכל כמה חודשים. לא פחות חשוב הוא הטיפוח הסטנדרטי והדור של מניות MTB במקום הראשון. תנאי תרבות כגוןבינוני, תוספי מזון, זמן, ונפח צריכים להיות אחידים כדי שתוכל להשוות נתונים מניסויים באמצעות מניות שונות של MTB. Mycobacteria נוטה גוש בתרבות, ולכן חשוב לשמור על תנאי תרבות טופל, חיידקי קציר באותו שלב הצמיחה וresuspend לעתים קרובות במהלך aliquoting. אחרת לא יכולה להיות וריאציה רחבה של כותרות CFU ותוצאת זיהום.

הדור של קבוצות יתושים נגועים הומוגנית הוא עוד שלב קריטי. מאז יתושים שונים יהיה להאכיל על כל עכבר בודד, חשוב שכל היתושים המשמשים לניסוי זיהום אחד באים מאותו אצווה וכי רק אלה קבוצות שבו יותר מ -90% מיתושים נגועים נמצאות בשימוש.

המודל הנוכחי יכול לשמש כדי לנתח את תגובה חיסונית ומודולציות חיסוניים במארח נישאים ידי השוואתה לתגובה החיסונית במארחים נגועים אחד. אנחנו יכולים ליישם את vaמתודולוגיות מבוססות היטב rious כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, cytometry הניתוח של אוכלוסיות תאים חיסוניים, או PCR וELISA לציטוקינים וזיהוי chemokine לנוזלים ברקמות גוף או של עניין. יש לציין, שיש להם מודלים עכבר כזה מגבלות מסוימות. ואילו הרוב המכריע של אנשים שנדבקו בMTB לפתח זיהום סמוי ללא סימנים של תסמינים קליניים, עכברים לפתח מחלה כרונית עם הפתולוגיה ריאות מתקדמת. ובכל זאת, עכברי C57BL / 6 הם עמידים יחסית לזיהום MTB ולא לפתח גרנולומות הקלסית כפי שנצפו בחולי שחפת אדם. כתוצאה מכך, תגובות immunopathological בעכבר משקפות לא מחלת שחפת אדם רדומה ולא פעילה כראוי. למרות הפער בין מחלה הסמויה וכרונית באדם ובעכבר, עכברים נעשו שימוש נרחב כדי לזהות וללמוד גורמי מארח ששולטים זיהום MTB והם כלים חשובים והכרחיים כדי לחקורתגובה חיסונית במחלות זיהומיות. חשוב מכך, רגישות לזיהום MTB משתנה במידה ניכרת בין זנים נפוצים טהורים עכבר וזנים רגישים יותר כגון DBA או C3H יכול להיכלל במחקרים משותפים וחד זיהום. יתר על כן, מלבד מיני פתוגן שתוארו במסמך זה, יכול לשמש לכל מיני Mycobacterium אחרים בעלי עניין (למשל קליני מבודד). כמו כן, בזמן שאין מודל מלריה אחד משכפל את כל ההיבטים של דגמי עכבר שונים מחלה אנושית שדומים היבטים שונים של הידבקות במלריה אנושית שנרכשה באופן טבעי. למשל, פ berghei אנקה ופ yoelii YM/17XL נלמדים בהרחבה מודלים של מלריה חמורה אנושית (מושרה פ falciparum), עם פ berghei אנקה להיחשב כמודל מצוין לאדם malari של מוחין ^14,15. פ berghei NK65 הוא מודל מצוין לhyperparasitaemia ואנמיה מלריה חריפה, וכבר מזמןתואר כמודל ניסיוני לתסמונת הקשורים מלריה מצוקה נשימתית חריפה (ARDS ^MA-16). שימוש במודל coinfection תאר, שנוכל לאחרונה מראה כי פ 'במקביל זיהום berghei NK65 מחריף חפת כרונית ^1.

מלבד שימוש טפילי מלריה מכרסם שונים, הסדר והתזמון של אירועי זיהום עלול להיות מותאם בהתאם לשאלת המחקר הבסיסית. בתחום, זיהומי Plasmodium נלווים עשויים להיות נוכחים בזמן זיהום MTB או נרכש לאחר מכן. בשני תרחישי התגובה החיסונית לMTB וPlasmodium עשויה להיות מושפעת באופן שונה. לכן, יכולים להיות נגועים בעכברים עם sporozoites Plasmodium לפני או אחרי זיהום MTB. יתר על כן, ניתן לערער עכברים בזמנים שונים לאחר זיהום MTB כדי להעריך את ההשפעה של התגובה החיסונית הנגרם על Plasmodium אקוטי מול כרונישחפת. חשוב מכך, בעת בחירת טפיל מלריה ללימוד coinfection מלריה שחפת, אחד צריך להיות מודע לכך שכמה זני Plasmodium מכרסמים לגרום למחלה חריפה בזני עכבר מסוימים ונכנעים לזיהום בתוך ימים או שבועות בלבד ואילו MTB גורם כרוני וזיהומים ארוכים טווח במערכת חיסון עכברים. לפיכך, עיתוי coinfection הוא קריטי על מנת למנוע מוות בטרם עת של חיות ניסוי.

האפנון של חסינות מארח על ידי זיהום בו זמנית עם מיני הפתוגן מרובים נשאר הבין היטב. מודל coinfection הניסיוני שלנו מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור Mycobacterium - האינטראקציה Plasmodium עם המערכת החיסונית של מארח נישאים ויתרמו להבנה שלנו איך coinfections יכול להשפיע על פתוגנזה, תוצאות מחלה, חיסון, immunodiagnostics, וטיפול.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium	BD Biosciences	212240	Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-slide Holder w/Handle	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution	Merck Millipore	109204
Wright´s stain	Sigma	W0625
Inhalation Exposure System	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col
Ice cream cups	Häagen-Dazs		Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages	BioQuip Products	1450A