Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Riepilogo

La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

Abstract

Coinfezione naturalmente si verificano a causa della sovrapposizione geografica di diversi tipi di organismi patogeni. Infezioni concomitanti probabilmente modulano la rispettiva risposta immune ad ogni singolo agente patogeno e possono quindi influenzare la patogenesi e l'esito della malattia. Pazienti co-infetti possono anche rispondere in modo differenziato agli interventi anti-infettivi. La coinfezione tra tubercolosi causata da micobatteri e il parassita della malaria Plasmodium, che sono entrambi coendemic in molte parti dell'Africa sub-sahariana, non è stato studiato in dettaglio. Per accedere alla impegnativo ma scientificamente e clinicamente questione di grande rilevanza come la malaria, la tubercolosi coinfezione modulare l'immunità ospite e il decorso di ogni malattia, abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di sezionare le risposte immunitarie indotte a entrambi i patogeni nell'ospite coinfezione . Da segnalare, per la maggior parte delle infezioni umane precisamente imitare naturalmente acquisiti, eseguiamo sperimentaleinfezioni di topi con entrambi i patogeni da parte dei loro percorsi naturali di infezione, cioè aerosol e puntura di zanzara, rispettivamente.

Introduzione

Popolazioni umane sono raramente esposti a un solo patogeno. In particolare nelle regioni con alta incidenza di infezioni come l'Africa sub-sahariana, coinfezioni rappresentano un problema di salute pubblica primaria ma altamente sottovalutata. Tubercolosi e malaria sono le infezioni batteriche o parassitarie più frequenti nell'uomo, rispettivamente, e continuano ad essere le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Nonostante l'ampia sovrapposizione geografica tra la tubercolosi e la malaria e il gran numero di persone a rischio di coinfezione, si sa molto poco circa le interazioni tra i vari e spesso di contrasto regolatori del sistema immunitario ed effettori contemporaneamente suscitate contro i parassiti della malaria e bacilli tubercolari in individui con coinfezione.

Modelli di roditori di infezioni miste permettono di caratterizzare le reazioni immunitarie differenziali contro gli agenti patogeni distinti in un host, mettendo così in luce la reciproca influenzarenze modulando patologia e l'esito clinico della malattia individuale, che aiuterà anche a individuare nuove raccomandazioni per la terapia e la prevenzione. Abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di indagare le conseguenze causate da infezione concomitante da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e specie di roditori Plasmodium all'interno dello stesso host ^1. È importante sottolineare che, per emulare il più fedelmente possibile le infezioni umane naturalmente acquisite, il nostro modello implementa le vie naturali di infezione utilizzati da entrambi i patogeni. La tubercolosi è un'infezione aerea, che quindi manifesta principalmente nei polmoni. L'agente eziologico, Mtb è trasmesso da persone con malattia attiva per via aerosol quando si espellono goccioline di aerosol infettivi durante la tosse o starnuti. Pertanto, l'infezione aerosol è il metodo di scelta per imitare infezione naturale. Generazione di particelle sospese nell'aria che contengono Mtb può essere ottenuto mediante l'usodi un sistema di esposizione per inalazione. Questa intera camera di esposizione corpo permette di esporre animali sperimentali per Mtb contenenti goccioline di aerosol infettivi (Figura 1) che vengono inalati negli alveoli dei polmoni dove viene avviata infezione ^2.

Malaria invece è una malattia trasmessa da vettori causata dal protozoo, Apicomplexa parassita Plasmodium che è naturalmente trasmessa dal morso di una zanzara anofele femmina. Durante la farina di sangue, sporozoiti infettanti sono depositati sotto la pelle ospitante e successivamente raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno. All'interno di epatociti si sviluppano e si moltiplicano rapidamente in schizonti fegato stadio. Alla fine, schizonti maturi rompono e rilasciano migliaia di patogeni merozoiti di prima generazione nel flusso sanguigno, dove l'inizio di un ciclo progressivo di invasione dei globuli rossi, la replica, la rottura dei globuli rossi, e reinvasion ^3. Il Plasmodium ciclo di vita continUES come alcuni merozoiti si sviluppano nelle fasi parassiti sessuali, i gametociti maschili e femminili, che possono essere ripresi dalle zanzare durante i pasti di sangue. Nella zanzara, sporozoiti del Plasmodium si sviluppano all'interno di oocisti residenti nel midgut zanzara e, infine, migrano verso le ghiandole salivari per la ritrasmissione in un altro ^3,4 host.

Mentre in modelli sperimentali animali la consegna della Mtb tramite aerosol e via così più rilevante è molto comune, molti studi infezione roditori Plasmodium sperimentali compresi studi sulla malaria, tubercolosi coinfezione ^5-7 sono stati effettuati infettando topi con eritrociti parassitati, dando luogo alla malaria infezione del sangue-fase, mentre escludendo la fase epatica fase clinicamente silente. Tuttavia, la fase di fegato è una tappa obbligatoria durante l'infezione e rilevante per l'immunità anti-plasmodiale ^8-11. Riteniamo quindi importante includere il ph epaticaase di trasmissione della malaria e manutenzione in studi sia di malaria e tubercolosi malaria-coinfezione, rispettivamente. Inoltre, è stato dimostrato che sporozoiti trasmessi naturalmente sono più virulenta quelli trasmessi da infezioni ago ^12, che ci hanno spinto a stabilire l'infezione da malaria zanzara mordere invece di iniettare ghiandole salivari isolato sporozoiti derivati. L'unico modo per ottenere le zanzare infettive per la trasmissione naturale dei parassiti della malaria è quello di mantenere l'intero ciclo di vita del parassita sia l'ospite vertebrato (qui mouse) e il vettore zanzara. L'accesso ad un insectary per manutenzione parassita è inevitabile per eseguire la trasmissione naturale morso.

Il nostro protocollo qui descritto è stato sviluppato per studiare come coinfezione da Plasmodium sporozoiti impatti sulla tubercolosi cronica ^1. Per farlo, i topi sono aerosol infettati con M. tubercolosi e 40 giorni più tardi, quando M. infezione da tubercolosi ha raggiunto la fase cronica, i topi sono esposti alle zanzare malaria-infettiva. L'esito di entrambi malaria e tubercolosi sugli animali coinfezione può essere seguita monitorando parassitemia sangue e carica batterica nel tessuto, rispettivamente. Nel nostro protocollo, descriveremo in dettaglio come infettare i topi con entrambi i patogeni attraverso il loro percorso infezione naturale e come confermare la trasmissione del patogeno successo. Nelle nostre mani, il grado di infezione comunemente conseguito per entrambe le infezioni sperimentali è 100%. Questi protocolli possono essere applicati a studiare entrambe le infezioni separatamente o, come noi, per modellare e studiare coinfezione tra due delle malattie infettive umane più difficili. Questo modello è applicabile ad altre specie Mycobacterium e roditori Plasmodium oltre quelle descritte in questo protocollo.

Protocollo

Misure di sicurezza ed etica Statement

Gli studi qui presentati si riferiscono a lavori con l'agente patogeno umano Mtb e il parassita della malaria Plasmodium berghei roditori (P. berghei). Esperimenti con Mtb (ceppo H37Rv) e P. berghei deve essere effettuata in condizioni di biosicurezza adeguate. Livello di biosicurezza (BSL) 2 laboratori sono necessari per i parassiti della malaria roditore come P. berghei e BSL 3 per Mtb e, quindi, per tutti gli studi coinfezione qui descritti. NOTA: I topi infettati con Mtb non si diffondono l'infezione ad altri mouse all'interno immediate vicinanze (la nostra osservazione). Diffusione per lo sperimentatore può quindi essere escluso; indumenti protettivi comunque opportuno deve essere indossato all'interno della BSL 3 laboratorio in ogni momento. Secondo le nostre regole, sperimentatori indossano scrub chirurgico, retine per capelli, respiratori monouso, e due paia di guanti, di cui quello esterno è scartata ogni volta che unrms siano ritirati dal cabinet. Quelli nuovi sono messi in prima di entrare nuovamente l'armadio. Due contenitori, uno con 2% Buraton (NOTA: altri disinfettanti approvati per inattivare Mtb possono essere usate alla concentrazione approvata) per i materiali di rifiuti liquidi e infettive e uno per la decontaminazione superficiale, vengono preparati prima dell'esperimento e poste all'interno dell'armadio. Inoltre, saranno utilizzati i sacchetti di plastica per i rifiuti solidi non infettiva. Secondo la normativa tedesca, tutti i lavori che coinvolgono la manipolazione e la trasformazione di culture Mtb o tessuti derivati ​​da Mtb infettato topi devono essere effettuate in un armadio di sicurezza biologica classe 2 entro un laboratorio BSL3. Durante la manipolazione micobatteri, le misure devono essere adottate per evitare la formazione di aerosol in ogni momento.

Femminile C57BL / 6 topi (Charles River) di età compresa tra 6-8 settimane sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti coinfezione e conservati in condizioni di barriera specifiche in BSL 3 strutture. Cura degli animali e la sperimentazione sono stati performed secondo protocolli approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Ministero dell'Agricoltura, Ambiente e aree rurali dello stato di Schleswig-Holstein

Per ottenere fasi di zanzara della malaria, i topi NMRI sono stati acquistati da Charles River Laboratory, Sulzfeld, Germania e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici all'interno della struttura animale dell'Università di Heidelberg (IBF). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le normative europee e approvati dalle autorità del Land Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Aerosol infezione di topi con Mtb utilizzando un aerosol Camera Glas-Col

Il modo migliore per uniformare l'infezione aerosol di animali da esperimento con Mtb è quello di utilizzare i micobatteri da scorte congelate con noti titoli CFU. Per preparare colture stock, cultura Mtb in brodo Middlebrook 7H9 completato con OADC (oleicoacido, albumina, destrosio, catalasi) medio e 0,05% di arricchimento Tween 80, una fonte di carbonio per micobatteri e misurare per evitare grumi batterica allo stesso tempo. Colture devono avere un OD ≤ 1 al momento del raccolto. A più alto OD, aumenta agglomeranti batterici e diminuisce vitalità. Il negozio di 1 ml aliquote a -80 ° C. Determinare il numero di unità formanti colonie vitali (CFU) in azioni congelati placcatura una serie di diluizioni di 10 volte di tre fiale indipendenti sul 7H11 piastre di agar addizionato con lo 0,5% glicerolo, 1 g / L asparagina, e OADC ed enumerare le colonie dopo 4 settimane di incubazione a 37 ° C. Eseguire l'infezione aerosol come descritto di seguito.

1. Scongelare Mtb scorte di nota titolo CFU e mescolare accuratamente la sospensione per cinque volte per disperdere grumi batterica utilizzando una siringa da 1 ml dotato di un ago G 27. Evitare la produzione di aerosol.
2. A seconda della dose infezione desiderata, trasferire il volume richiesto dello stock micobatteri inun tubo da 50 ml contenente PBS sterile. Il volume finale è di 6 ml. NOTA: Variando il numero di microrganismi in questa sospensione, la percentuale di batteri recanti goccioline di aerosol è variata. Noi di solito puntiamo a un assorbimento di 100 bacilli vitali per polmonare (infezione a basso dosaggio). Nella nostra esperienza, questo richiede circa 1-2 x 10 ⁶ mtb / ml in un volume totale di 6 ml, di cui 5,5 ml vengono nebulizzati (vedi sotto). Si consiglia di fare una serie di sfide aerosol sperimentali con diverse concentrazioni di batteri per trovare le condizioni ideali per l'infezione. Considerando infezioni alte dosi con fino a 5.000 micobatteri può essere fatto per accelerare il processo infettivo, da un minimo di 5 batteri possono essere utilizzati per infettare successo topi da aerosol. Il grado di infezione è comunemente 100%.
3. Rimuovere un volume sufficiente (preparato in eccesso di volume finale richiesto) per la placcatura per determinare il titolo inoculo, solitamente rimuoviamo 500 microlitri alla piastra triplica tecnici.
4. Mettere animaliun cesto compartmented mesh (un mouse per cesto) all'interno della camera di aerosol circolare e chiudere il coperchio della camera di aerosol. NOTA: Altri modelli sono equipaggiati con un cesto a forma di torta composto da cinque scomparti individuali, ognuna delle quali può ospitare 20 topi.
5. Collegare l'unità Venturi-nebulizzatore ai tre giunti a manicotto in acciaio inossidabile.
6. Rimuovere la sospensione micobatteri dal tubo 50 ml con una siringa da 10 ml munita di un ago smussato 18 G e portare la siringa alla camera di aerosol in una scatola chiusa trasporto.
7. Rimuovere il tappo a vite dell'unità nebulizzatore e accuratamente iniettare la sospensione micobatteri nel nebulizzatore. Evitare la formazione di aerosol. Gettare la siringa in un apposito contenitore contenente il 2% Buraton. Sigillare il nebulizzatore con tappo a vite.
8. Accendere l'interruttore di alimentazione principale e la lampada UV. Il display sul pannello di controllo mostra "Glas-Col Apparatus Co".
9. Accendere l'interruttore programma su. La volontà di visualizzazionemostra "è il nebulizzatore pronto?" "È il cesto caricato?" Premere Invio quando è pronto ". Premere Invio.
10. Il display visualizza "Enter Tempo di preriscaldamento 900", questo significa che il tempo di preriscaldamento per l'inceneritore (che decontamina l'aria di scarico) è di 900 sec. Premere Invio.
11. Il display mostrerà "Inserire tempo nebulizzazione 1.800", questo significa che il tempo di nebulizzazione è impostato a 1.800 sec di default. Al fine di estendere il tempo di nebulizzazione, immettere "2400" e premere invio. NOTA: Durante il ciclo di nebulizzazione, aria sotto pressione atomizza la sospensione, generando così piccole goccioline di aerosol contenenti micobatteri. Con il flusso d'aria principale, queste goccioline (circa 2-5 micron di dimensione) sono portati nella camera di aerosol.
12. Il display mostrerà "Inserire CD Tempo 1800", ciò significa che il ciclo di decadimento prende 1.800 sec. Impostato a "2.400" e premere Invio. NOTA: Durante questo ciclo, la nube che è stata costruita up nella camera di aerosol durante il ciclo di nebulizzazione può decadere. Le piccole goccioline vengono inalati da animali da esperimento.
13. Il display mostrerà "Inserire Tempo dicembre 900", ciò significa che il ciclo di luce UV decontaminazione avrà 900 sec. Premere Invio. La macchina inizierà in bicicletta attraverso preriscaldamento, nebulizzazione, nube decadimento e la decontaminazione UV.
    ATTENZIONE: Il misuratore di portata vuoto dovrebbe indicare 60 cubic feet / hr (verificare quando il ciclo di preriscaldamento inizia, regolare la valvola di controllo del vuoto, se necessario) e il misuratore di flusso di aria compressa a 10 metri cubi / ora (controllare quando nebulizzazione inizio ciclo; regolare la valvola di controllo dell'aria di conseguenza ).
14. Quando il ciclo è completo, la tastiera mostrerà "Process Complete - Togliere Specimen". Spegnere il programma, UV e l'interruttore di alimentazione principale.
15. Verificare se la sospensione micobatteri è stato nebulizzato completamente e se non, registrare il volume rimanente rimuovendo accuratamente la sospensione con una siringa specifico munitoun ago smussato 18 G. Il volume rimanente non deve essere superiore a 1 ml.
16. Rimuovere il nebulizzatore dalle articolazioni e mettetelo in un tegame contenente il 2% Buraton per un minimo di 2 ore, di solito la disinfezione è fatto O / N. Successivamente, trasferire il nebulizzatore ad una padella fresco e risciacquare abbondantemente con acqua. Lasciare nebulizzatore asciugare.
17. Aprire la camera di aerosol e ritorno degli animali nelle loro gabbie. Bag i cestini in sacchi autoclave e autoclave. Pulire le superfici della parte interna della camera di aerosol con il 2% Buraton. Nota: per ragioni di sicurezza, un respiratore purificatore d'aria alimentato dovrebbero essere indossati durante questa procedura.
18. Utilizzando i restanti 500 ml di sospensione dei micobatteri (vedi punto 1.3) piastra diluizioni 10-fold di una triplice tecnica (3 x 100 ml) su piastre di agar 7H11.

2. Verificare assorbimento di desiderata CFU nei polmoni

Un giorno dopo l'infezione aerosol di animali da esperimento determinare la lo battericaannuncio nei polmoni di animali di controllo designate per verificare l'assorbimento del CFU desideri. NOTA: Noi di solito designa un gruppo supplementare di 3-5 topi per il giorno 1 determinazione CFU.

Per monitorare il decorso dell'infezione Mtb nel corso del tempo, l'onere tessuto micobatteri può essere esaminata dalla placcatura diluizioni seriali di omogenati interi organi per la determinazione CFU. Il polmone è il sito primario per la manifestazione della malattia nella tubercolosi tuttavia milza, fegato e linfonodi sono di solito analizzate di conseguenza. Le diluizioni essere placcato dipendono dal carico micobatteri previsto negli organi, che dipendono dal inoculo iniziale (dose bassa vs alta dose), che dà luogo a diversi carichi batterici in tessuto, nonché sull'organo e punto di tempo analizzare. Al momento dell'infezione dose bassa, la carica batterica di Mtb H37Rv nel polmone di solito raggiunge un plateau tra giorno 25-30.

1. Posizionare gli animali sacrificati (eutanasia: CO ₂ asfissia oanestesia terminale) su carta assorbente su una tavola di dissezione in un armadio biosicurezza di classe II e disinfettare i topi con il 70% di etanolo. NOTA: il 70% di alcol è solo per la decontaminazione superficiale e non ucciderà Mtb.
2. Fare una piccola incisione nel mezzo dell'addome e retrarre la pelle del mouse sopra la testa.
3. Aprire l'addome e la gabbia toracica con forbici chirurgiche e rimuovere la parete toracica in modo che i polmoni sono accessibili.
4. Rimuovere i polmoni e trasferire in una provetta da 15 ml con tampone di omogeneizzazione (acqua sterile / 1% v / v Tween 80/1% w / v albumina).
5. Utilizzando lo stantuffo di un 5 polmoni ml di deformazione siringa attraverso 100 micron setacci in una piccola capsula di Petri.
6. Setacci Lavare più volte con una pipetta 1 ml dotato di una punta barriera e distribuire l'omogeneizzato polmone tra 8 piastre di agar (circa 250 ml / piastra;. Assicurarsi che essi hanno una superficie ben essiccato).
7. Piastra con cura i campioni con crocette e getta che vengono eliminati nel 2%Buraton.
8. Lasciare piastre di agar asciugare all'interno del cabinet. Sigillare ogni singolo piatto con parafilm, avvolgerlo in un foglio di alluminio e incubare in posizione verticale a 37 ° C per almeno 4 settimane.

3. Costruzione di gabbie Mosquito a prova di fuga

Ceppi di roditori Plasmodium non sono nocivi per l'uomo. Tuttavia, poiché i topi Mtb-infettati sono i destinatari del parassita e del lavoro è fatto in BSL tre condizioni, precauzioni sono necessarie per evitare che le zanzare di fuggire loro gabbie. A seconda del regime di infezione previsto, può essere utilizzato autoclavabile e riutilizzabile gabbie di metallo del telaio o gabbie monouso self-made. Questi ultimi sono consigliate se da infezione morso di animali da esperimento è necessario per essere eseguite da un numero definito di zanzare per topo. Se sono richiesti gabbie self-made, preparare gabbie a specifiche esatte come la salute delle zanzare e la sicurezza del laboratorio dipende dalla loro sound costruzione (Figura 2).

1. Prendere una scatola come una mezza pinta gelato scatola o tazza di carta (Figura 2).
2. Tagliare una piccola apertura nel lato del cartone e coprire con un doppio strato di lattice con una fessura tagliata in ogni pezzo di creare un ingresso sicuro per le zanzare. NOTA: L'apertura ha una dimensione complessiva di 2 cm x 2 cm, il tubo (aspiratore) che usiamo per portare e / o prendere-out zanzare è una versione modificata del tubo da 15 ml Falcon collegato a una pompa a vuoto e, quindi, funge da un aspiratore con un diametro di 1,5 cm.
3. Nastro un pezzo di carta da filtro sul fondo interno della scatola per assorbire gocce.
4. Chiudete coppe gelato con la rete (doppio strato di maglia di nylon, taglia 1 mm x 1 millimetri) e fissare al cartone con nastro ed elastico.
5. Per esperimenti di infezione in cui servono numeri definiti di zanzare per topo, preparare gabbie con 10-15 zanzare infette, ognuno dei quali contiene idealmente un average di 10.000 wild-type ghiandola salivare P. sporozoiti berghei.
6. Idealmente, morire di fame zanzare per 24 ore prima di eseguire il pasto di sangue.

4. Malaria infezione di topi da Mosquito Bite

Il parassita della malaria roditore qui utilizzato è P. berghei comunque qualsiasi altro ceppo di roditori Plasmodium di interesse può essere utilizzato. Per ottenere le zanzare infettive per la trasmissione sporozoite l'intero ciclo di vita del parassita è mantenuto sia l'ospite vertebrato (mouse) e il vettore zanzara. Manutenzione parassita viene effettuata in un insectary. Per gli esperimenti di trasmissione naturali, il numero minimo di sporozoiti alla ghiandola salivare deve essere inferiore a 10.000. Per i protocolli dettagliati per la manutenzione parassita si fa riferimento ai metodi di ricerca sulla malaria da Moll et al., 2013.

1. Anestetizzare topi naïve o animali preinfected per 40 giorni con Mtb con ketamina (100 mg / kg)e xilazina (7 mg / kg) soluzione per iniezione intraperitoneale (200 ml / topo). NOTA: Il tempo tra l'infezione Mtb e Plasmodium può essere regolata a seconda della domanda di ricerca sottostante. Analogamente, l'ordine delle sfide patogeno può essere invertita, ossia topi possono essere esposti a infettiva puntura di zanzara prima dell'infezione Mtb.
2. Mettere i topi anestetizzati sulla rete delle gabbie zanzara (un topo per gabbia zanzara di zanzara definito il rapporto del mouse) e permettono le zanzare per alimentare attraverso la membrana per 10-15 min. NOTA: La presenza di sangue nelle viscere della zanzara implica alimentazione e, quindi, la trasmissione sporozoite.
3. Trasferire i topi nelle loro gabbie e supervisionare costantemente fino a quando si svegliano dall'anestesia. NOTA: Topi posto sul tovagliolo di carta e non sul assestamento (pericolo di soffocamento) e mantenere (posto in stretta collaborazione e coprire corpi con un tovagliolo di carta) caldo.
4. Uccidere le zanzare da loro spruzzo con il 70% di etanolo o altri disinfettanti attraverso la nettzione della gabbia. Gabbie autoclave e scartano se sono stati utilizzati quelli usa e getta.

5. Parassitemia Monitoraggio

1. Puntura coda vene alla fine con un ago e raccogliere una goccia di sangue a ciascuna estremità di una diapositiva.
2. Utilizzare un altro scivolo per tirare una goccia di sangue oltre la metà della lunghezza della diapositiva. Capovolgere il divaricatore di utilizzare l'altro bordo per il secondo striscio. Lasciare i vetrini asciugare all'aria.
3. Giemsa
   1. Porre i vetrini in portavetrini e fissare gli strisci di sangue da una breve immersione in metanolo assoluto. NOTA: Perché l'uso di articoli di vetro dovrebbe essere mantenuto al minimo in BSL 3 usiamo cuvette polipropilene per tutte le soluzioni.
   2. Immergere gli strisci di Giemsa (1:10 in acqua deionizzata). Dopo 10 minuti, immergere i vetrini dentro e fuori di cuvette colorazione riempiti con acqua deionizzata un paio di volte per lavare via la macchia in eccesso.
   3. Infine, asciugare i vetrini in posizione verticale.
4. MACCHIE ALTERNATIVA: Wright & #180; s macchia
   1. Sciogliere Wright macchia ad una concentrazione di 1 mg / ml in metanolo.
   2. Filtrare su filtro a pieghe prima dell'uso.
   3. Immergere gli strisci di sangue nella soluzione colorante e incubare per 4 minuti (NOTA: metanolo fissazione di strisci non è necessaria in quanto la soluzione colorante è metanolo based).
   4. Lavare i vetrini risciacquo in acqua deionizzata come descritto sopra e lasciare diapositive asciugare all'aria.
   5. Una volta Giemsa / Wright s 'è completa, trasferire delicatamente tutti i reagenti utilizzati in una disposizione pot-Buraton contiene.
5. Analisi striscio di sangue
   1. Analizzare striscio di sangue colorato al microscopio ottico con un ingrandimento di 100 volte con immersione in olio.
   2. Conte eritrociti infetti e infetti in una zona del striscio di sangue in cui eritrociti sono disposti in un monostrato.
   3. Al fine di raggiungere una parassitemia ben definita, contare almeno 10 diversi campi di vista che visualizzano un monostrato eritrociti.
   4. Calculmangiato la parassitemia relativa (in%) dividendo il numero di eritrociti parassitati dal numero di eritrociti e moltiplicando per 100.

Risultati

L'infezione di topi con Mtb e P. berghei per via naturale, cioè aerosol e puntura di zanzara, rispettivamente, provoca l'infezione e riproducibile di tutti gli animali (Tabella 1) ^1. Possiamo monitorare infettati e il corso di entrambi malaria e tubercolosi determinando il verificarsi iniziale (prepatency) e numero di parassiti nel sangue (P. berghei parassitemia) e l'onere di Mtb in diversi organi, rispettivamente. Un esempio di successo trasmissione parassita della malaria da puntura di zanzara infetta è mostrato nella Tabella 1 e nella Figura 3. Alimentazione di 10 zanzare sporozoite infettate di ciascun topo ha determinato un tasso di infezione 100% come confermato dalla presenza di parassiti sangue-fase 4-5 giorni (Tabella 1 e Figura 3A). Importante, troviamo numeri parassiti simili nel sangue di topi individuo della stessa gr sperimentaleOUP, indicando che la trasmissione sporozoite risultati per puntura di zanzara in una infezione e riproducibile. Confrontando la prepatency in topi di controllo naive con quella in animali Mtb-coinfezione, possiamo vedere che prepatency è leggermente ritardato nei topi che erano stati preinfected con Mtb (Tabella 1, Figura 3B) ^1. Come abbiamo riportato in precedenza ^1, possiamo determinare l'impatto di Mtb coinfezione sul corso della malaria da giornaliero parassitemia monitoraggio negli strisci di sangue colorati con Giemsa come mostrato in Figura 3B.

L'infezione di topi con Mtb con l'uso di un sistema di esposizione per inalazione provoca successo deposizione di batteri nei polmoni con relativamente bassa variabilità tra i topi individuale (Figura 4A). Possiamo seguire carichi micobatteri nei polmoni e in altri organi di interesse nel corso del tempo dalla determinazione CFU. Un esempio per il carico micobatteri in polmoni diMtb infettato topi C57BL / 6 in assenza o presenza di P. berghei è illustrato nella Figura 4B.

Tabella 1. Prepatency dopo la trasmissione sporozoite da puntura di zanzara. Tutti i topi hanno sviluppato infezioni del sangue-fase dopo la trasmissione naturale di P. berghei sporozoiti da puntura di zanzara. Adattato da ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso.

Gruppo sperimentale mouse (C57BL / 6)	Sfida di 10 punture di zanzare infettive	Numero di sangue tappa positiva animali / Numero di animali per gruppo	Media prepatency [d]
naïve	P. berghei	7/7	4,4
Mtb infetto	P. berghei	7/7	5,5 d>

Figura 1. Schema generale della procedura sperimentale. C57BL / 6 topi sono esposti alla Mtb contenenti goccioline di aerosol in una camera di aerosol Glas-Col. Un giorno dopo l'infezione aerosol, l'assorbimento di Mtb è verificata mediante analisi CFU del polmone. 40 giorni dopo Mtb sfida (quando la tubercolosi è diventata cronica in topi infettati), gli animali sono esposti a P. berghei infettato zanzare. Per confermare la trasmissione sporozoite di successo e di seguire il corso di infezione da Plasmodium, parassitemia viene monitorato giornalmente in Giemsa-macchiate strisci di sangue a partire tre giorni dopo la puntura di zanzara.

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Figura 2. Schizzo di una gabbia zanzara. Zanzare infettive sono contenuti all'interno di una scatola, come una mezza pinta di cartone gelato. Una piccola apertura viene tagliato nel lato del cartone e ricoperta con un doppio strato di lattice con una fessura tagliata in ogni pezzo di creare un ingresso sicuro per le zanzare. Un pezzo di carta da filtro è registrato sul fondo interno della scatola per assorbire gocce. Coppe gelato sono chiuse con compensazione (Nylon mesh) che è fissato alla scatola da nastro ed elastico.

Figura 3. Parassitemia sangue. A) Esempio di macchiato striscio di sangue di un Wright `s mostra eritrociti parassitati (bar Scala, 20 & #181;. M) B) parassitemia nel sangue topo è stato monitorato attraverso l'analisi quotidiana strisci di sangue Giemsa-macchiate. Topi coinfezione hanno una parassitemia ridotto rispetto al Plasmodium topi infettati singoli (n = 10); risultati sono riportati come media ± SD; *** p <0,001. Ristampato da ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso.

Figura 4. Rilevamento di Mtb nel polmone. C57BL / 6 topi sono stati aerosol sfidato con 100 CFU di Mtb e 40 giorni dopo, coinfezione con P. berghei da puntura di zanzara. A) Un giorno dopo l'infezione aerosol l'assorbimento del numero desiderato di Mtb è stata verificata mediante placcatura interi omogenati di polmone per la determinazione CFU. b) Battericarichi L al momento della coinfezione stati determinati in lisati polmonari di topi con 3 CFU analisi (Mtb d40/d0). 12 giorni dopo coinfezione, lisati polmonari sono stati placcati per l'analisi CFU per determinare l'impatto del Plasmodium coinfezione sul controllo Mtb. Si noti, che i numeri Mtb nei polmoni aumentati durante coinfezione con P. berghei NK65. Etichettatura X-axis: dopo Mtb -infection/time dopo coinfezione. Adattato da ¹ PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso.

Discussione

Abbiamo descritto come topi possono essere produttivamente infettati con Mtb e P. berghei attraverso i loro percorsi naturali di infezione. Applichiamo stabilito protocolli di infezione per studiare la tubercolosi o la malaria sperimentale ^{13 12} e recentemente li adottato per studiare coinfezione tra Mtb e Plasmodium nel modello murino ^1.

Le fasi più critiche per le infezioni di successo sono la trasmissione di entrambi i patogeni ai numeri desiderati. Scorte micobatteri non dovrebbero essere più vecchio di due anni perché perderanno vitalità nel tempo, e il titolo originariamente determinato degli stock molto probabilmente non saranno più accurate. Come risultato, le dosi infettive sarebbero molto inferiore al previsto. Pertanto, CFU titoli di culture archivi dovrebbero essere stabiliti ogni pochi mesi. Altrettanto importante è la coltivazione standardizzata e la generazione delle scorte Mtb, in primo luogo. Condizioni di coltura comemedio, integratori, tempo e volume dovrebbero essere standardizzati in modo da poter confrontare i dati provenienti da esperimenti utilizzando diversi scorte di Mtb. Micobatteri tendono a raggrupparsi in cultura, quindi è importante mantenere condizioni di coltura standardizzato, batteri raccolto presso la stessa fase di crescita e risospendere frequentemente durante aliquotazione. Altrimenti non ci può essere un'ampia variazione nei titoli e CFU esito infezione.

La generazione di lotti di zanzara omogeneamente infetti è un altro passo fondamentale. Da diversi zanzare si nutrono di ogni singolo topo, è importante che tutte le zanzare utilizzati per un esperimento di infezione provengono dallo stesso lotto e che sono utilizzati soltanto lotti in cui più del 90% delle zanzare sono infettati.

L'attuale modello può essere utilizzato per analizzare le risposte immunitarie e modulazioni immunitarie in un host coinfezione confrontandola con le risposte immunitarie in host infetti singoli. Possiamo applicare various metodologie già consolidati, come l'istologia, immunoistochimica, analisi di citometria di popolazioni di cellule immunitarie, o PCR ed ELISA per citochine e chemochine rilevazione ai tessuti o fluidi corporei di interesse. Va notato che tali modelli murini hanno alcune limitazioni. Considerando che la maggior parte delle persone infettate con Mtb sviluppare una infezione latente senza segni di sintomi clinici, i topi sviluppano una malattia cronica progressiva patologia polmonare. Eppure, C57BL / 6 topi sono relativamente resistenti all'infezione Mtb e non sviluppano granulomi classici come osservato in pazienti affetti da tubercolosi umani. Di conseguenza, le reazioni immunopatologici nel topo riflettono né malattia né attiva latente tubercolosi umana appropriato. Nonostante la discrepanza tra la malattia latente e cronica nell'uomo e mouse, i topi sono stati ampiamente utilizzati per identificare e studiare fattori dell'ospite che controllano l'infezione Mtb e sono strumenti preziosi e indispensabili per indagarerisposte immunitarie in malattie infettive. Importante, suscettibilità alle infezioni Mtb varia considerevolmente tra ceppi di topi inbred comunemente utilizzati e più ceppi sensibili come DBA o C3H possono essere inclusi in studi co-and-infezione singolo. Inoltre, a parte dell'agente patogeno qui descritti, possono essere usati qualsiasi altra specie Mycobacterium di interesse (ad esempio isolati clinici). Allo stesso modo, mentre un unico modello malaria replica tutti gli aspetti della malattia umana diversi modelli murini non assomigliano molto differenti aspetti della acquisita naturalmente malaria umana. Per esempio, P. berghei ANKA e P. yoelii YM/17XL sono ampiamente studiati modelli di umana (P. falciparum-indotta) malaria grave, con P. berghei ANKA essere considerato come un ottimo modello per Malari cerebrale umana s ^14,15. P. berghei NK65 è un ottimo modello per iperparassitemia e anemia malarica acuta, ed è stato recentementedescritto come modello sperimentale per la sindrome da distress respiratorio malaria-associata ^(MA-16 ARDS). Utilizzando il modello coinfezione descritto, abbiamo potuto dimostrare recentemente che concomitante P. infezione berghei NK65 aggrava la tubercolosi cronica ^1.

Oltre ad utilizzare diversi parassiti della malaria roditore, l'ordine e la tempistica degli eventi di infezione possono essere adeguati a seconda della domanda di ricerca sottostante. Nel campo, infezioni Plasmodium concomitanti possono essere presenti al momento dell'infezione Mtb o acquisite successivamente. In entrambi i casi le risposte immunitarie a Mtb e Plasmodium possono essere influenzati in modo diverso. Pertanto, i topi possono essere infettati da Plasmodium sporozoiti prima o dopo l'infezione Mtb. Inoltre, i topi possono essere contestate in tempi diversi postare infezione Mtb per valutare l'impatto della risposta immunitaria Plasmodium-indotta acuta rispetto cronicatubercolosi. È importante sottolineare che, quando si sceglie un parassita della malaria per studiare la malaria-tubercolosi coinfezione, si deve essere consapevoli del fatto che alcuni ceppi di Plasmodium roditori causano malattie acute in alcuni ceppi di topo e soccombere alle infezioni entro pochi giorni o settimane, mentre Mtb causa cronica e infezioni di lunga durata in immunocompetente topi. Quindi, i tempi di coinfezione è cruciale al fine di evitare la morte prematura degli animali da esperimento.

La modulazione dell'immunità ospite da infezione simultanea con più specie di patogeni rimane poco conosciuta. Il nostro modello di coinfezione sperimentale fornisce un potente strumento per indagare Mycobacterium - Plasmodium interazione con il sistema immunitario di un host coinfezione e contribuiranno alla nostra comprensione di come co-infezioni possono influenzare la patogenesi, decorso della malattia, la vaccinazione, immunodiagnostics, e la terapia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium	BD Biosciences	212240	Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-slide Holder w/Handle	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution	Merck Millipore	109204
Wright´s stain	Sigma	W0625
Inhalation Exposure System	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col
Ice cream cups	Häagen-Dazs		Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages	BioQuip Products	1450A