实验模型后的自然传播到研究结核病，疟疾混合感染结核分枝杆菌和伯氏疟原虫</i

摘要

结核病和疟疾是两个人类和发病率和死亡率在热带地区贫困人口的主要原因最普遍的感染。我们建立的实验模型系统，通过受感染的自然路线的挑战后，研究疟疾结核病合并感染的结果小鼠两种病原体。

摘要

自然混合感染，由于不同类型的病原微生物的地理重叠发生。并发感染最容易调节到每个单一病原体各自的免疫反应，从而可能影响发病机理和疾病的结果。合并感染的患者也可能差异响应抗感染干预措施。造成的分枝杆菌和疟原虫 ，这两者都是coendemic在撒哈拉以南非洲的许多地方，结核病合并感染之间尚未详细研究。为了达到尽可能的具有挑战性的，但科学和如何疟疾肺结核合并感染调节宿主免疫和每一种疾病的过程中，我们建立了一个实验性小鼠模型，使我们能够剖析诱发免疫反应两种病原体的混合感染宿主临床高度相关的问题。值得注意的是，为了最准确地模仿自然获得人类感染，进行实验小鼠的两种病原体的感染者感染的自然路线， 即气溶胶和蚊虫叮咬，分别。

引言

人类群体中很少暴露于仅一种病原体。特别是在地区，感染，如撒哈拉以南非洲地区的发病率很高，占混合感染的黄金，但非常被低估的公共卫生问题。结核病和疟疾是人类，分别为最普遍的细菌和寄生虫感染，并继续成为发病率和死亡率在热带地区贫困人口的主要原因。尽管在合并感染的风险肺结核和疟疾以及大量的个人之间的广泛的地理重叠，很少有人知道有关各种与常抵消免疫调节和效应同时引发针对疟疾寄生虫和结核菌双重感染中个体之间的相互作用。

混合感染的啮齿动物模型允许在一台主机对特征明显的不同病原体的免疫反应，从而脱落光的相互十字形ENCES调节病理和个人疾病的临床结果，这也将有助于确定治疗和预防的新建议。我们已经建立了一个实验性小鼠模型，使我们在同一个主机¹中，调查引起并发感染结核分枝杆菌 （ 结核杆菌 ）的后果和啮齿动物种疟原虫 。重要的是，以模拟自然获得的人类感染尽可能地，我们的模型实现了感染都使用病原体的天然路由。结核病是一种空气传播，因此这主要表现在肺部。病原体， 结核杆菌是由人与疾病活动通过气溶胶途径，当他们咳嗽或打喷嚏时排出的传染性气溶胶飞沫传播。因此，气溶胶感染是选择的方法，以模仿自然感染。含有结核杆菌的气载粒子的生成可以通过使用可以实现的吸入暴露系统。这全身暴露室允许暴露实验动物的Mtb含有传染性气溶胶液滴（ 图1），其被吸入其中感染是引发²肺部的肺泡。

疟疾，另一方面是由原生动物，顶复门寄生虫恶性那自然是由按蚊雌性蚊子叮咬传播媒介传播的疾病。在血粉，传染性的子孢子被沉积在宿主的皮肤下，并随后经由血液流到达肝脏。肝细胞内他们开发并迅速繁衍成肝阶段裂殖。最终，成熟的裂殖体破裂并释放数以千计的致病第一代裂殖子进入血流，他们发起红细胞浸润，复制，红细胞破裂，并再侵入³的累进周期。 疟原虫生命周期康廷UE的一些裂殖子发育成性的寄生虫阶段，男性和女性配子体，可在血液饭菜就由蚊子。在蚊子体内疟原虫居住在蚊子的中肠卵囊内发展，并最终迁移到唾液腺，以便转交到另一台主机^3,4。

而在实验动物模型的结核杆菌通过气溶胶，因此最相关的路由传递是很普遍的，许多实验啮齿类疟原虫感染的研究，包括疟疾，结核病合并感染^5-7的研究已经进行了小鼠感染与寄生虫感染的红细胞，从而引发要同时排除了临床上沉默的肝段相血液阶段的疟疾感染。然而，肝期是感染和相关的期间强制性步骤，用于抗疟原虫免疫^8-11。我们认为，因此，重要的是包括肝pH值疟疾传播，以及在这两个疟疾和疟疾肺结核合并感染，分别研究维修的酶。另外，它已经表明，自然发射的子孢子比那些通过针头感染^12，这促使我们通过蚊子建立，而不是注入隔离唾液腺派生的子孢子的感染疟疾咬发送的传染性。获得蚊子传染疟疾寄生虫的自然传播的惟一途径是保持寄生虫的整个生命周期中都脊椎动物宿主（此处鼠标）和蚊子。因此，获得的养虫的寄生虫维修是不可避免的，以便通过叮咬进行自然传播。

我们这里所描述的协议的开发是为了研究如何合并感染疟原虫孢子对慢性肺结核¹的影响。这样做，将小鼠气溶胶感染了M。肺结核和40天后，当M。结核感染已达到慢性期，将小鼠暴露于疟疾感染的蚊子。无论疟疾和结核病的双重感染动物的结果可以跟随，监测血原虫和细菌负荷在组织分别。在我们的协议中，我们将通过他们的自然感染途径，以及如何确认成功病原体传播详细描述如何感染小鼠两种病原体。在我们的手中，一般达致的感染率为实验感染为100％。这些协议可以应用到研究均单独感染或，和我们一样，两个最具挑战性的人类传染病的建模和研究合并感染。这种模式也适用于其他分枝杆菌和啮齿类疟原虫种类超过本协议所描述的。

研究方案

安全措施及操守准则

本文介绍的研究工作涉及与人类病原体结核分枝杆菌和啮齿动物疟疾寄生虫恶性疟原虫（伯氏疟原虫）。实验与结核分枝杆菌 （菌株H37Rv）和P.疟原虫 ，必须在适当的生物安全的条件下进行。生物安全水平（BSL）2实验室所需要的灭鼠疟疾寄生虫如P。疟原虫和BSL 3对Mtb的 ，因此，对于所有共感染的研究本文所述。注意：感染了结核杆菌的小鼠没有在附近传播感染到其他小鼠（我们自己的观察）。蔓延到实验者因此可以排除，但是相应的防护服具有内BSL 3实验室可以穿在任何时候。按照我们的规定，实验者戴上手术袍，发网，一次性口罩，两副手套，其中外层被丢弃随时一有效值是从机柜排出。新的问题也提上再次进入内阁之前。两个容器，一个为2％Buraton（注：核准以失活Mtb的其它消毒剂可用于在核准的浓度）为液体和传染性废物材料和一种用于表面去污，实验前准备和放置在机柜内。此外，塑料袋将用于固体废物的非感染性。据德国规定，涉及到从结核杆菌衍生结核杆菌培养或组织的处理和加工的所有工作感染小鼠必须进行的2级生物安全柜中的BSL3实验室。虽然处理分枝杆菌，措施要注意避免在任何时候都气溶胶的产生。

雌性C57BL / 6小鼠（Charles River）6〜8周龄之间用于所有合并感染实验和具体的屏障条件BSL 3设备下维持。动物护理和实验是PErformed按照该部的动物实验为农业，环境和石勒苏益格 - 荷尔斯泰因州的农村经伦理委员会的协议

为了获得抗疟疾蚊子阶段，NMRI小鼠从Charles River实验室，Sulzfeld，德国购买和海德堡大学动物设施（IBF）内无特定病原体条件下保存。所有动物实验均按照欧洲法规的规定执行，并经巴登 - 符腾堡（Regierungspräsidium卡尔斯鲁厄）的国家机关。

1。使用GLAS-上校气雾室中与小鼠结核杆菌气溶胶感染

标准化实验动物与结核杆菌的气溶胶感染的最佳方法是使用由结核分枝杆菌冷冻的库存与已知的CFU滴度。为了准备股票文化，文化结核杆菌在米德尔7H9肉汤补充OADC（油酸酸，白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶）富集培养基和0.05％吐温80​​中，碳源为分枝杆菌和测量，以避免细菌聚集在同一时间。文化应该有一个外径≤1在收获的时候。在更高的外径，细菌丛生的增加和生存能力下降。店铺1ml等份在-80℃下确定可行的菌落形成单位（CFU）的冷冻的库存通过电镀一系列的上补充有0.5％甘油，1 g / L的天冬酰胺7H11琼脂平板上三个独立的小瓶中10倍稀释液的数量，并OADC和4之后列举的菌落周的潜伏期在37°C。执行如下所述的气溶胶感染。

1. 已知的CFU滴度解冻结核杆菌股票和混合仔细暂停五次用1毫升注射器配有27号针头驱散细菌团块。避免产生气溶胶。
2. 取决于所需的剂量感染，转移分枝杆菌库存的需要的体积成在50ml管中的无菌PBS中。最终体积为6毫升注意：通过改变微生物的数量在此悬浮液中，细菌轴承气溶胶液滴的比例是变化的。我们通常的目标是每肺癌（低剂量感染）100存活菌的摄取。在我们的经验，这需要大约1-2×10 ⁶的Mtb /毫升在6ml其中5.5毫升被雾化的总体积（见下文）。建议在做了一系列的不同浓度的细菌实验气溶胶挑战，找到适合您感染了理想的条件。而高剂量的感染具有高达5000的分枝杆菌可以做，以加快感染过程中，少至5个细菌可成功地用于感染小鼠的气雾剂。感染率一般为100％。
3. 电镀确定接种滴度删除足量（超过所需的最终体积的准备），我们通常除去500微升直接制版技术一式三份。
4. 将动物一个隔间网状筐（每筐一个鼠标）之通函气雾室中，并关闭气雾室的盖子。注：其他车型都配备了一个饼形篮子五个单独隔间，每个可容纳20只小鼠组成。
5. 附上文丘里雾化器单元的三个不锈钢套筒接头。
6. 从50毫升管一个10毫升注射器装有一个18G的钝针取出分枝杆菌悬浮和携带注射器气溶胶室在一个封闭的运输箱。
7. 取出喷雾器单元的螺丝帽，并仔细的分枝杆菌悬浮液注入到雾化器。避免气溶胶的产生。丢弃注射器插入含有2％Buraton一个尖锐物品容器。密封该雾化器与螺旋盖。
8. 关闭主电源开关，紫外线灯上。在控制面板上的显示屏显示“GLAS-上校器械有限公司”。
9. 打开程序开关。显示的意志显示“是对雾化器准备好了？”“是篮装？”按回车键时准备好“。按Enter键。
10. 显示屏显示“请输入预热时间900”，这意味着预热时间为焚烧炉（其中decontaminates排风）为900秒。按Enter键。
11. 显示屏将显示“输入雾化1,800时间”，这意味着雾化时间设置为1,800秒为默认值。为了延长雾化时间，输入“2400”，然后按回车。注：在雾化周期，在压力下雾化空气悬挂，从而产生含有细小的分枝杆菌气溶胶液滴。与主气流，这些液滴（大小约为2-5微米）被带入气雾室中。
12. 显示屏将显示“输入的CD时间1,800”，这意味着衰变周期为1800秒。设置为“2400”，然后按回车。注意：在这个周期中，云已建成ü在雾化循环中的p气溶胶室可衰减。小液滴由实验动物吸入。
13. 显示屏将显示“输入减速时间900”，这意味着紫外线消毒周期将采取900秒。按Enter键。机器将开始通过预热，雾化，云衰减和紫外线消毒循环。
    注意：真空流量计应注明60立方英尺/小时（检查时预热周期的开始，如果需要调整真空控制阀）和压缩空气流量计10立方英尺/小时（检查雾化周期开始时，相应地调整空气控制阀）。
14. 当循环完成时，键盘会显示“过程完成 - 取出标本”。关闭程序，UV和主电源开关。
15. 检查分枝杆菌悬浮液已被完全雾化，如果没有，通过仔细除去悬浮装有一个适当的注射器记录的剩余量18G的钝针。剩余的体积应不超过1毫升
16. 从接头取下​​雾化器，并将其放置在含2％Buraton最少2小时的锅，消毒，通常是做的O / N。此后，雾化器转移到一个新的锅，用清水彻底冲洗。离开雾化器风干。
17. 打开气雾室中，并返回到动物的笼子。袋子篮子在釜袋和高压灭菌。擦拭干净气雾室用2％Buraton 注意的内表面：出于安全考虑，电动送风过滤式呼吸器应在此过程中被磨损。
18. 使用剩余的500微升的分枝杆菌悬浮液（参见步骤1.3）在技术一式三份（3×100微升）在7H11琼脂平板上的板10倍稀释。

2。验证所需的CFU吸收的肺

实验动物的气溶胶感染后一天确定细菌LO广告中指定的对照动物的肺中，以便验证所要的CFU的吸收。注：我们通常指定3-5小鼠的额外组第1天CFU的决心。

以监测结核分枝杆菌感染随时间的过程中，分枝杆菌组织负担可以通过电镀的全器官匀浆物为菌落形成单位测定系列稀释液进行检查。肺是肺结核原发部位疾病的表现却脾，肝，淋巴结，通常相应的分析。待镀稀释依赖于预期的分枝杆菌负载的器官，这依赖于初始接种物（低剂量与高剂量），这就会引起对不同细菌负荷在组织中，以及在器官和时间点到进行分析。经低剂量感染， 结核分枝杆菌 H37Rv的在肺中的细菌负荷，通常达到25-30天之间的平台期。

1. 将实施安乐死的动物（安乐死： _二氧化碳窒息或终端麻醉）对解剖板在II类生物安全柜吸收纸和消毒小鼠用70％乙醇。注：70％的酒精仅供表面去污，并不会杀死结核杆菌。
2. 做一个小的切口在腹部正中和缩回小鼠皮肤的头部上方。
3. 打开腹部和胸廓用手术剪和去除胸壁，使肺的访问。
4. 取出肺并转移到15ml试管中，在均化缓冲液（无菌水/ 1％体积/体积的吐温80/1％w / v的白蛋白）。
5. 通过100微米的筛子用5毫升注射器株肺部的柱塞成一个小培养皿。
6. （;确保他们有一个良好的干燥表面约 250微升/板），使用几次1毫升吸管配备了屏障尖和分发8琼脂平板之间的肺组织匀浆冲洗筛子。
7. 小心使用被丢弃到2％的可支配吊具板样品Buraton。
8. 离开琼脂平板上以干燥柜内。每封单盘用封口膜，包装在铝箔直立孵育在37℃至少4周。

3。的逃生防蚊子笼施工

啮齿类疟原虫菌株对人体无害。然而，由于结核杆菌感染小鼠的寄生虫和工作的受助人是在BSL 3条件下进行，预防措施是必要的，以防止蚊虫逃逸他们的笼子。取决于计划感染疗法，高压灭菌并重复使用的金属框架的笼子或自制的一次性笼都可以使用。较后的会建议，如果通过实验动物的叮咬感染是必需的，以进行由所定义的每只小鼠的蚊子数。如果自制的笼子是必需的，准备笼子确切规格的蚊子​​和实验室的安全的健康取决于他们的源程序ND建设（ 图2）。

1. 拿一个纸箱，如半品脱冰淇淋纸盒或纸咖啡杯（ 图2）。
2. 切一小口进入纸盒的侧面和盖在胶乳的双层带切成每片的狭缝，以创建用于蚊子的安全入口。注意：该开口具有2厘米×2厘米的整体尺寸，管（吸气装置），我们使用带内和/或取出的蚊子是连接到真空泵的改性15毫升Falcon管中，因此可作为吸气器，其直径为1.5厘米。
3. 磁带上的​​一片滤纸上的纸箱来吸收水滴的内底。
4. 关闭关闭冰淇淋杯网（尼龙网眼双层，尺寸1毫米×1毫米），并用胶带和松紧带固定在纸箱。
5. 感染实验中，需要每鼠蚊子定义号码，准备笼中10-15感染的蚊子，其中每一个理想包含一个AV10000野生型唾液腺P. erage 疟原虫子孢子。
6. 理想情况下，饿死在执行血粉之前蚊子24小时。

4。小鼠通过蚊虫叮咬感染疟疾

本文中使用的啮齿动物疟疾寄生虫是P.然而疟原虫任何感兴趣的其他啮齿类动物疟原虫菌株都可以使用。为了获得感染的蚊子传播孢子寄生虫的整个生命周期保持在这两个脊椎动物宿主（鼠）和蚊子。寄生虫的维护是在一个养虫。对于天然传输实验，每唾液腺子孢子的最低人数应不低于10000。如需详细的协议，对寄生虫维护我们提到的方法在疟疾研究由莫尔等人 ，2013年。

1. 麻醉天真的小鼠或动物preinfected 40天用Mtb的氯胺酮（100毫克/千克）通过腹膜内注射（200微升/小鼠）和甲苯噻嗪（7毫克/千克）的溶液。注：结核杆菌和疟原虫感染之间的时间可以根据潜在的研究问题进行调整。同样，病原体挑战的顺序可以颠倒，即小鼠可以接触到感染蚊子叮咬之前，结核杆菌感染。
2. 将麻醉小鼠到蚊子笼（每笼蚊界定蚊子鼠标比一个鼠标）的网，让蚊子通过膜料10-15分钟。注：血液中的胆蚊子的存在意味着馈送，因此，子孢子的传输。
3. 转移小鼠放回笼子和监督不断，直到他们从麻醉中醒来。注：将小鼠在纸巾上，而不是在床上用品（窒息的危险），并保持温暖（地方紧密地结合在一起，并覆盖机构用纸巾）。
4. 通过在净价用70％乙醇或其它消毒剂喷洒他们杀蚊子ing的笼子。如果使用一次性的人反应釜笼并丢弃。

5。原虫监测

1. 穿刺尾静脉处用针快结束，并收集一滴血在幻灯片的每一端。
2. 使用另一张幻灯片拉一滴血超过一半的幻灯片的长度。翻转吊具使用其他边缘第二涂片。离开幻灯片风干。
3. 姬姆萨染色
   1. 将幻灯片在幻灯片持有人，并在无水甲醇短暂浸泡固定血涂片。注：由于使用玻璃洁具应保持在最低限度在BSL 3，我们使用的聚丙烯试管的所有解决方案。
   2. 沉浸（去离子水1:10）在姬姆萨涂片。 10分钟后，浸在染色试管装满去离子水几次冲洗掉多余的污渍进出的幻灯片。
   3. 最后，空气干燥载玻片在垂直位置。
4. 替代染色：赖特＆＃180;氏染色
   1. 溶解瑞氏染色以1毫克/毫升的甲醇溶液的浓度。
   2. 通过在使用前折叠滤芯过滤器。
   3. 浸血涂片染色溶液，孵育4分钟（注：涂片甲醇固定是没有必要，因为染色的解决方案是基于甲醇）。
   4. 通过漂洗幻灯片如上​​所述去离子水清洗并留下幻灯片风干。
   5. 一旦姬姆萨/赖特的染色完成后，轻轻地转用成含Buraton处置锅的所有试剂。
5. 血涂片分析
   1. 通过光学显微镜在100倍放大倍率的油浸分析染色血涂片。
   2. 计数未感染和感染的红细胞在红细胞被安排在一个单分子层的血涂片的区域。
   3. 为了实现一个良好定义的寄生虫血症，计数的视图显示红细胞单层至少10种不同的字段。
   4. 演算除以寄生红细胞的数量由红细胞的数目再乘以100吃的相对原虫（以％表示）。

结果

小鼠结核分枝杆菌和P的感染通过自然的途径， 即气溶胶和蚊虫叮咬，分别，结果所有动物（ 表1）的一致性和可重复性感染疟原虫 ^1。我们可以监视成功的感染，都疟疾和肺结核通过确定初次发生（prepatency）和寄生虫的数量在血液（ 伯氏疟原虫的寄生虫血症）和结核杆菌在不同器官的负担，分别的过程。由感染性蚊子叮咬成功疟原虫传输的一个例子示于表1和图3。对每只小鼠10子孢子感染的蚊子摄食导致100％的感染发生率证实了的血液阶段寄生虫的存在下4-5天之后（ 表1和图3A）。重要的是，我们发现类似的寄生虫数在相同的实验克的个别小鼠的血牛津大学出版社，指示由蚊子叮咬的结果一致和可重复感染，子孢子传播。在天真的对照组小鼠的prepatency与结核分枝杆菌中双重感染的动物进行比较，我们可以看到，prepatency稍微延迟已被preinfected与结核分枝杆菌 （ 表1，图3B）小鼠^1。正如我们以前^1日报道，我们可以判断， 如图3B 结核分枝杆菌混合感染的疟疾由日常监测原虫在姬姆萨染色血涂片过程的影响。

感染小鼠结核分枝杆菌通过与个别小鼠（ 图4A）之间的相对低的变异性肺部使用吸入暴露系统导致细菌的成功的沉积。我们可以按照负载分枝杆菌肺部以及由CFU测定随着时间的推移感兴趣的其他器官。在肺分枝杆菌负载为例结核分枝杆菌感染的C57BL / 6小鼠在P的存在或不存在疟原虫 如图4B所示 。

表1中。 Prepatency通过蚊子叮咬传播孢子后，所有小鼠发生血液阶段的感染P的自然传播后伯氏疟原虫子孢子蚊虫叮咬。从¹ PLoS ONE的 ，7（10），e48110经许可后改编。

实验组小鼠（C57BL / 6）	10感染蚊子叮咬挑战	每组动物的血液阶段阳性动物数目/	平均prepatency并[d]
天真	伯氏疟原虫	7/7	4,4
结核分枝杆菌感染	伯氏疟原虫	7/7	5,5 开发>

图1。实验过程的总体方案。C57BL / 6小鼠暴露在Glas-上校气雾室中含有结核杆菌的气溶胶液滴。一天后，喷雾感染， 结核分枝杆菌的摄取是由肺CFU分析验证。 40天之后的Mtb挑战（当结核已成为慢性感染小鼠），将动物暴露于P。伯氏疟原虫感染的蚊子。确认成功的子孢子传播，并遵循疟原虫感染的过程中，原虫在姬姆萨染色血涂片蚊虫叮咬后以3天的日监测。

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图2。一蚊笼的草图。感染蚊子都包含在一个纸箱内，如一个半品脱冰淇淋纸盒。一个小开口被切成纸箱的侧面和覆盖有胶乳的双层带切成每片的狭缝以创建蚊子的安全入口。一块滤纸录音的纸箱来吸收水滴的内底部。冰淇淋杯都关闭了与净额结算（尼龙网），这是由带和松紧带固定纸箱。

图3。一赖特单曲染色血涂片显示寄生虫感染的红细胞（比例尺，20＆＃ 血原虫A）示例181;米）B）原虫在小鼠血液通过分析日常姬姆萨染色血涂片监测。合并感染小鼠具有降低原虫相比， 疟原虫感染的单一小鼠（n = 10），结果显示为平均值±标准差; *** P <0,001。从¹ PLoS ONE的 ，7（10），e48110经许可后转载。

图4。在肺结核杆菌检测的。C57BL / 6小鼠气溶胶挑战与结核杆菌的100 CFU和40天后，合并感染P.疟原虫通过蚊子叮咬A）一天后的气溶胶感染结核杆菌的所需数量的摄取电镀全肺匀浆的CFU测定进行了验证。 二）细菌升负荷在合并感染的时间是在3小鼠肺裂解液通过CFU分析（ 结核杆菌 d40/d0）确定。共感染后12天，肺裂解物镀CFU分析，以确定疟原虫共感染对Mtb的控制的影响。请注意，在肺结核杆菌合并感染人数在增加，P。疟原虫 NK65。 X轴标签：合并感染结核分枝杆菌后后-infection/time时间。从¹ PLoS ONE的 ，7（10），e48110经许可后改编。

讨论

我们描述了如何老鼠可以高效感染结核杆菌和P.通过受感染的自然路线疟原虫 。我们应用建立感染协议研究实验肺结核¹³或¹²疟疾和最近通过他们学习结核杆菌和恶性之间的合并感染的小鼠模型^1。

对于成功的感染中最关键的步骤是两种病原体在所需的号码的传输。分枝杆菌的股票不应该是2岁以上的，因为他们将失去生存能力随着时间的推移，和股票的最初确定的滴度将极有可能不再准确。其结果是，感染的剂量将远低于预期。因此，股市文化的CFU滴度应确定每隔几个月。同等重要的是规范化栽培和代结核杆菌股票摆在首位。培养条件如培养基，营养补充剂，时间和体积应该标准化，以便能够使用不同的股票的Mtb的实验数据进行比较。分枝杆菌倾向于培养过程中结块，因此，保持培养条件标准化，收获细菌在相同的生长阶段和分装过程中频繁地重悬是很重要的。否则，就不可能在CFU滴度和感染的结果差异很大。

的均匀受感染的蚊子批次的产生是另一个关键的一步。因为不同的蚊子将饲料上每个单独的鼠标，也都用于一个实验感染蚊子的来自同一批次，只有那些其中超过90％的蚊子感染批次使用是很重要的。

目前的模型可以用来通过比较单一感染的宿主免疫反应来剖析免疫反应和免疫调制在合并感染的主机。我们可以应用VArious完善的方法，如组织学，免疫组织化学，流式细胞术的免疫细胞群的分析或PCR和ELISA对细胞因子和趋化因子的检测到所关注的组织或体液中。应当指出，这种小鼠模型中具有一定的局限性。而大多数人感染了结核杆菌培养潜伏感染的临床症状体征，小鼠发展为慢性疾病，进行性肺部疾病。尽管如此，C57BL / 6小鼠是结核杆菌感染相对性和不开发经典肉芽肿是人类结核病的患者中观察到。其结果是，在小鼠的免疫病理反应也适当地反映潜既不积极也不人类肺结核病。尽管在人类和小鼠潜伏和慢性疾病之间的差异，小鼠已被广泛用于鉴定并研究控制结核杆菌感染，是宝贵的，不可或缺的工具，调查宿主因素在感染性疾病的免疫应答。重要的是，易患结核分枝杆菌感染的常用近交系小鼠品系，更敏感菌如DBA或C3H之间有很大的差别可以被包括在共同和单一感染的研究。此外，除了本文所述的病原体种类，可以使用任何其他的分枝杆菌属物种的兴趣（ 例如临床分离株）。同样，虽然没有单一的疟疾模型复制人类疾病不同的小鼠模型的各个方面都酷似自然获得的人类疟疾感染的不同方面。例如， 第疟原虫安卡和P.约氏疟原虫 YM/17XL被广泛研究人类（ 恶性疟原虫引起的）重症疟疾的车型，与体育伯氏疟原虫安卡被视为人类大脑malari s ^14,15一个很好的模型。伯氏疟原虫 NK65是hyperparasitaemia和急性疟疾贫血一个很好的模型，并在最近被描述作为实验模型疟疾相关性急性呼吸窘迫综合征（MA-ARDS ^16）。使用所描述的共感染模型，我们可以最近表明，并行P.伯氏疟原虫 NK65感染加重慢性肺结核^1。

除了使用不同的啮齿动物疟疾寄生虫的感染事件的顺序和时间可根据基础研究问题改编。在现场，伴随疟原虫感染可能存在于结核杆菌感染时或其后收购。在这两种方案中的免疫应答的Mtb和疟原虫可能受到不同的影响。因此，老鼠可以之前或结核杆菌感染后，被感染疟原虫子孢子。此外，小鼠可以在不同的时间被挑战后的Mtb感染，评估疟原虫引起的免疫应答的急性与慢性的影响肺结核。重要的是，在选择疟原虫的研究疟疾肺结核合并感染，人们应该知道，一些啮齿类疟原虫株引起的急性疾病，某些小鼠品系，并屈从于感染仅在几天或几周，而结核杆菌引起的慢性和持久的感染免疫小鼠。因此，共感染的时序是至关重要的，以避免实验动物的过早死亡。

宿主免疫受感染的同时与多个病原体种类调制的了解甚少。我们的实验合并感染模型提供了一个功能强大的工具来调查分枝杆菌 - 恶性互动与共同感染宿主的免疫系统，将有助于我们了解如何合并感染可影响发病机制，疾病转归，疫苗接种，免疫诊断和治疗。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium	BD Biosciences	212240	Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-slide Holder w/Handle	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution	Merck Millipore	109204
Wright´s stain	Sigma	W0625
Inhalation Exposure System	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col
Ice cream cups	Häagen-Dazs		Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages	BioQuip Products	1450A