תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal

Summary

מיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרת ההדמיה של תהליכים התפתחותיים. צמיחה או סחיפה של דגימות במהלך רכישת תמונה מפחיתה את היכולת לעקוב באופן מדויק ולמדוד תנועות תא במהלך פיתוח. אנו מתארים את השימוש בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח לתיקון לשלושה להיסחף מדגם ממדי לאורך זמן.

Abstract

הדור של מערכי נתונים confocal (4D) ארבעת ממדים; בהיקף של רצפי תמונת 3D לאורך זמן; מספק מתודולוגיה מעולה כדי ללכוד התנהגויות הסלולר מעורבות בתהליכי התפתחות. היכולת לעקוב ולעקוב אחר תנועות תא היא מוגבלת על ידי תנועות מדגם המתרחשות עקב סחיפה של המדגם או, במקרים מסוימים, צמיחה במהלך רכישת תמונה. תאי מעקב במערכי נתונים מושפעים מסחף ו / או צמיחה ישלבו התנועות הללו לכל ניתוח של מצב תא. זה עלול לגרום לתנועה לכאורה של מבנים סטטיים בתוך המדגם. לכן לפני המעקב סלולרי, צריך להיות מתוקן כל להיסחף מדגם. שימוש בקוד פתוח הפצת פיג'י ¹ של ImageJ ^2,3 והכלים לוקוסים שילבו ^4, פיתחנו את סחף התוספת 3D הנכונה כדי להסיר תנועת מדגם שגויה במערכי נתוני confocal. פרוטוקול זה מפצה באופן יעיל לתרגום מדגם או שינויים בפו המוקדsition ידי ניצול מתאם שלב לרשום בכל פעם נקודה של מערכי נתונים confocal ארבעה ממדים תוך שמירה על היכולת לחזות ולמדוד תנועות תא מעל ניסויי הזמן לשגות מורחבים.

Introduction

confocal הדמיה נעשתה שימוש נרחב בתא וביולוגיה התפתחותית לעקוב תנועות תא ושינויים במורפולוגיה. לכידת סדרה של סעיפים אופטיים במטוסי מוקד שונים מאפשרת את הדור של מודל תלת ממדי (3D) של מדגם, אשר לאחר מכן ניתן להרחיב לארבעה ממדים (4D) על ידי יצירת סדרת הזמן לשגות של מערכי נתונים 3D. הדור של מערכי נתונים 4D מאפשר מדידה מפורטת של תנועות תא והתנהגויות. בניסויי הזמן לשגות לטווח ארוך זה נפוץ לצפות בתנועה לדוגמא. זה יכול להיגרם על ידי אי דיוקים קלים בשלב השליטה החומרה ועמדות מוקד. בעוד שבמקרים אחרים, סחיפה היא תוצאה של תנועות הנגרמות על ידי צמיחת מדגם או גמישות בתוך מדגם תקשורת ההרכבה. שיטות קיימות כדי לפצות או להגביל את תנועות אלה כוללים שיפורים במערכות התמקדות חומרה וקשיחות מוגברת של ההרכבה בינונית. עם זאת, לא ניתן להחיל גישות אלה במקרים רבים עקב של ההדמיהet הנדרש כדי לספק תנאים מתאימים לשימור הדגימות והצמיחה. פתרונות תוכנת קוד פתוח קיימים לתיקון התנועה ב2D לאורך זמן, באמצעות השימוש בStackReg וTurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ התוספים בImageJ או פיג'י, אבל לא יכולים אלה להיות מיושם על מערכי נתונים 4D.

כדי לתקן את סחיפת המדגם שפיתחנו plug-in (להיסחף 3D נכון) לנצל את פלטפורמת עיבוד ההדמיה קוד הפתוח, ¹ פיג'י. התוספת שלנו היא מסוגלת לבצע רישום מתאם שלב לתקן תנועה המתרחשת כתוצאה מסחיפת מדגם בניסויי הזמן לשגות בתלת ממד. מתאם שלב ⁶ הוא שיטה יעילה חישובית כדי לקבוע תרגום בין תמונות. Plug-in שתואר כאן מנצל את ספריית שלב המתאם שפותחה על ידי Preibisch et al. ^7. בניסויים רב ערוצית, התוספת מנצלת ערוץ אחד לdetermine התיקון הנדרש. תיקון זה הוא אז מיושם על כל ערוצים נוספים וכתוצאה מכך הרישום של בסיס נתוני 4D.

במערכת מודל דג הזברה זה אפשרי לבצע הדמיה הזמן לשגות על פני תקופה של שעות רבות, או אפילו כמה ימים ^8. שיטה נפוצה להרכבת דג הזברה היא להטביע את העובר החי מורדם בagarose נקודת התכה הנמוך (.8-1.5%), המגביל את תנועתה ^9-11. בעוד תנועה מוגבלת צמיחה של המדגם עדיין מתרחשת, וכתוצאה מכך התאים בתוך שדה ראיית הסטת עמדה. על מנת לעקוב אחר תנועתם של התאים בתוך העובר יש צורך תחילה לתקן את תנועה של המדגם כולו. פרוטוקול זה פותח עם דגימות דג הזברה, ונוצל לפיתוח somite התמונה ¹² אבל יכול להיות מיושם על כל מערך נתונים confocal 4D.

Protocol

1. ניסויי ההדמיה 4D הזמן לשגות

ההגדרות המשמשות לרכישת תמונה תהיה שונות בהתאם לציוד המשמש. היכולת של מיקרוסקופיה confocal סעיף אופטי מדגם תלוי במספר הגורמים: אורך הגל של עירור, גודל חריר, צמצם מספרי של המטרה, השבירה של המדגם והמדיום שבו המדגם הוא משובץ. גודל חריר confocal נבחר יקבע את העובי של הסעיף האופטי שנאסף. חריר קטן יותר יפיק סעיף אופטי דק יותר הגדלת הרזולוציה Z-הציר, אבל להפחית את כמות האור שנתפס. חריר גדול יותר יגדיל את העובי של הסעיף האופטי, הקטנת רזולוציה Z-ציר, אלא מגביר את כמות האור שנתפס.

גורמים נוספים שיש לשקול בעת איסוף נתוני 4D לפני התיקון כוללים:

1. לייעל את מהירות סריקה כדי להסיר, או מגבלה, להיסחף דuring לכידתו של זמן בנקודה אחת. לכן הזמן שלוקח לאוסף התמונה צריך להיות חלק קטן של המרווח בין נקודות זמן.
2. מבנים בצורה מושלמת החוזרים, או רשתות, אינם מתאימים כמבנים לרישום כפי שלא ניתן לקבוע את התיקון הנדרש. חרוזים מתפזרים באופן אקראי או מבנים לא אחידים יאפשר רישום חד משמעי.
3. אם להיסחף צפוי, להגדיל את שטח הסריקה וגבולות מוקד עליון ותחתונים על מנת להבטיח את השטח של עניין נשאר בתוך ערימת התמונה.
4. בנוסף להבטחה שיש רזולוציה מרחבית מתאימה כדי לפתור את המבנים של עניין, להגדיר את קצב הדגימה על מנת לספק פתרון זמני לאירועים הדינמיים הנלמדים.
   הערה: הזמן בין נקודות זמן תמונה ולכן צריך להיות לפחות חצי בזמן ההפסקה בין אירועים חוזרים הרגילים ולהקטין לאירועים חריגים.

2. פתיחת Confocal Dataset

חבילת הקוד הפתוחה פיג'י היא הפצה של תכנית ImageJ, המכילה תוספות מותקנות מראש לביצוע תהליכים רבים על נתונים שנאספו מניסויים במיקרוסקופ. התוכנה מספקת ארכיטקטורת עדכון התוספת קלה וכוללת עותק של התוספת להיסחף הנכונה 3D המשמשת לפרוטוקול זה. התוכנה תומכת ביבוא של מגוון רחב של פורמטים של תמונות מיקרוסקופיה קניינית באמצעות השימוש בביו פורמטי יבוא plug-in של מיקרוסקופית פתח הסביבה.

1. התקן את תכנית פיג'י (http://fiji.sc/Downloads).
2. טען את בסיס הנתונים נרכשו באמצעות תוסף יבואן לוקוסים Bio-הפורמטים.
3. אם בסיס הנתונים גדול יותר מהזיכרון שהוקצה לתכנית, בחר באפשרות "השימוש וירטואלית הערימה" בתוך קטע ניהול זיכרון.

3. תיקון הסחף של אובייקט 3D בהודעת עיבוד

במהלך זמן לשגות מורחבלהתנסות מדגם עשוי לעבור גם כאשר משובץ. כדי לתקן את כל תנועה ולאפשר לאירועי ההגירה צילמו להיות מנותחים, שלאחר עיבוד של תמונות ניתן לבצע. כל ההודעה תמונת העיבוד חייב להיות מתואר באופן ברור במתודולוגיה של כל ניתוח הנגזר מעבודה זו.

1. ברגע שהבסיס הנתונים נטען, להפעיל את התוסף להיסחף 3D הנכון.
2. אם יש ערוצי תמונה מרובים, בחר את הערוץ שישמש לרשום את התמונות. זה אידיאלי צריך לייצג את מבנה סטטי בתוך המדגם ולא כל אלמנטים נודדים או ניידים. עם זאת, אם זה לא אפשרי יש לבחור את הערוץ עם התנועה לפחות.
3. אם זיכרון RAM הזמינים במערכת המשמשת לניתוח זה הוא פחות מכפול בגודל של בסיס הנתונים המקוריים, בחר באפשרות הערימה הווירטואלית השימוש. זה יהיה לאחסן hyperstack הרשום כתמונה ברצף, ולא לשמור את הקובץ ל-RAM.
   1. בחר תיקייה לתוספת לאדם פלט מתוקן הר"יקבצי GES. קובץ תמונה נפרד יופק עבור כל ערוץ בכל עמדת z.
4. לאחר מכן התוסף יערוך ניתוח מתאם שלב זוג חכם בין כל נקודת זמן כדי לקבוע את התיקון הנדרש אשר לאחר מכן מוחל על בסיס הנתונים.

תוצאות

בדג הזברה מתפתחת, תאי שריר מהירים למזג לתוך סיבי multinucleated מ19 שעות לאחר הפריה (20 - שלב somite) ^13. על מנת להמחיש את תנועתם של גרעינים ואיחוי של תאי שריר שבוצעו זמן לשגות הדמיה confocal 4D באמצעות זן מהונדס המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של ​​אמרגן α-אקטין הש?...

Discussion

היכולת שלנו להשתמש בתוכנה שלאחר עיבוד כדי לתקן להיסחף מדגם של מערכי נתונים הנגזרים מניסויים מיקרוסקופיה זמן לשגות מורחבים מוגבלת על ידי מספר הגורמים. היכולת להבחין להיסחף לעומת תנועת נדידה של מדגם תלויה בסמנים הסלולריים בשימוש. סמנים נייד שהם גם הביעו נרחב בתוך מדג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000