Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация

Резюме

Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.

Аннотация

Поколение четырехмерных (4D) конфокальной данных; , состоящий из последовательностей изображений 3D в течение долгого времени; обеспечивает отличную методику, чтобы захватить клеточные поведения, связанные с процессами развития. Возможность отслеживать и следовать клеточные движения ограничена образцов движений, которые происходят из-за дрейфа образца или, в некоторых случаях, рост в течение получения изображений. Отслеживание клетки в наборах данных, пострадавших от дрейфа и / или роста будет включать эти движения в любом анализе положения клеток. Это может привести к видимым движением статических структур в образце. Поэтому до отслеживания клеток, любой образец дрейф должно быть исправлено. Использование с открытым исходным кодом Фиджи распределение ¹ из ImageJ ^2,3 и включены локусов инструменты ^4, мы разработали правильный 3D дрейфа плагин для удаления ошибочной движение образца в конфокальной данных. Этот протокол эффективно компенсирует перевода образца или изменением фокусного роsition, используя корреляцию фаз для регистрации каждого тайм-точку четырехмерного конфокальной наборов данных, сохраняя при этом способность визуализировать и измерять движения клетки в течение длительного экспериментов покадровой.

Введение

Конфокальной визуализации широко используется в клеточной и эволюционной биологии следовать клеточные движения и изменения в морфологии. Захват серию оптических срезов на разных фокальных плоскостях позволяет генерировать трехмерной (3D) модели образца, который затем может быть продлен на четыре измерениях (4D) путем создания покадровой серию 3D данных. Поколение 4D наборов данных позволяет детальное измерение движений и поведения клеток. В долгосрочных покадровой экспериментов он является общим для наблюдения движения образца. Это может быть вызвано небольшими неточностями в контролирующей стадии аппаратной и координационных позиций. В то время как в других случаях, дрейф является результатом движений, вызванных ростом образца или гибкости в образце монтажной СМИ. Существуют методы, чтобы компенсировать или ограничивать эти движения, включая усовершенствование системы фокусировки аппаратных и повышенной жесткости монтажной среды. Однако эти подходы не могут быть применены во многих случаях из-за формирования изображения сдр. до обязаны предоставлять благоприятные условия для поддержания и роста образцов. Программного обеспечения с открытым исходным кодом решения существуют для коррекции движения в 2D с течением времени, через использование StackReg и TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ плагинов в ImageJ или Фиджи, но они не могут применяться к 4D данных.

Для коррекции образца дрейфа мы разработали плагин (Правильное 3D дрейф), чтобы использовать с открытым исходным кодом визуализации обработки платформу, Фиджи ^1. Наш плагин способен выполнять фазовой корреляции регистрацию исправить движение, которое происходит в результате выборки дрейфа в трехмерных экспериментов покадровой. Фаза корреляция ⁶ является вычислительная эффективный метод, чтобы определить различия между изображениями. Плагин описано здесь использует фаза-корреляции библиотеку, разработанную Preibisch др.. ^7. В экспериментах многоканальных, плагин использует один канал, чтобы детерпе требуется коррекция. Эта поправка затем применяется к любым дополнительным каналам в результате чего регистрации набора данных 4D.

В данио модели системы можно осуществлять покадровой обработки изображений в течение многих часов или даже нескольких дней ^8. Распространенным методом для монтажа данио является внедрение анестезированной живой эмбрион в низкой температурой плавления агарозы (0,8-1,5%), ограничивая свое движение ^9-11. В то время как движение ограничено рост образца все еще имеет место, в результате чего клеток в поле зрения меняющихся положение. Для того чтобы проследить движение клеток в эмбрионе, необходимо сначала коррекции движения всей выборки. Этот протокол был разработан с данио образцов, и были использованы в разработке изображение сомитов ^12, но может быть применен к любой 4D конфокальной данных.

протокол

1. 4D Покадровый Визуализация Эксперименты

Используемые для получения изображений настройки будут отличаться в зависимости от используемого оборудования. Способность конфокальной микроскопии в оптически секции образца зависит от ряда факторов: длина волны возбуждения, отверстие размера, числовой апертурой объектива, показателя преломления образца и среды, в которой образец встроенной. Размер конфокальной точечным выбранной будет определять толщину оптической части собраны. Меньшее отверстие будет производить более тонкую секцию оптического увеличения разрешения Z-оси, но уменьшая количество света, захваченное. Большее отверстие будет увеличивать толщину оптической части, уменьшая разрешение Z-оси, но растет количество света, захваченное.

Дополнительные факторы, которые следует учитывать при сборе 4D данных до коррекции включают в себя:

1. Оптимизация скорости сканирования для удаления или предел, дрейф ðо время захвата одного момента времени. Поэтому время, необходимое для сбора изображений должна быть небольшая часть интервала между временных точках.
2. Прекрасно повторяющиеся структуры, или решетки, не пригодны в качестве структур для регистрации, как это не представляется возможным определить требуемую коррекцию. Случайно распределенных шарики или неровные структуры позволит однозначно регистрацию.
3. Если дрейф ожидается, увеличить площадь сканирования и верхний и нижний пределы фокус в целях обеспечения сферой интересов остается в стеке изображения.
4. В дополнение к обеспечению этом есть соответствующая пространственное разрешение, чтобы решить эти структуры интересов, установить частоту дискретизации, чтобы обеспечить временное разрешение для динамических событий изучаются.
   Примечание: В связи с этим время между изображением временных точках должно быть не менее половины времени интервал между регулярными повторяющихся событий и уменьшить для нерегулярных событий.

2. Открытие конфокальной Dataset

С открытым исходным кодом пакет Фиджи является распределение программы ImageJ, который содержит предварительно установленные плагины для выполнения многочисленных процессов на данных, собранных от микроскопических экспериментов. Программное обеспечение обеспечивает более легкий архитектуру обновления плагина и включает в себя копию правильном 3D дрейфа плагина, используемого для этого протокола. Программное обеспечение поддерживает импорт широкий спектр собственных форматов микроскопии изображения за счет использования био-форматы импорта плагина в открытом Микроскопия среды.

1. Установите программу Фиджи (http://fiji.sc/Downloads).
2. Загрузите приобретенный набор данных с помощью плагина Импортер LOCI Био-форматы.
3. Если набор данных больше, чем памяти, выделенной для программы, выберите "Использовать опцию виртуального стека" в секции управления памяти.

3. Коррекция Drift 3D-объекта в Постобработка

В ходе длительного покадровойэкспериментировать образец может двигаться даже при его внедрении. Чтобы исправить любое движение и позволить миграционные события распечатанных быть проанализированы, после обработки изображений может быть выполнена. Вся обработка сообщение Изображение должно быть четко описаны в методологии любого анализа, полученных от этой работы.

1. После того, как набор данных загружается, запустите Правильное 3D плагин дрейфа.
2. При наличии нескольких каналов изображения, выберите канал, который будет использоваться для регистрации изображения. Это в идеале должны представлять статическую структуру в образце, а не каких-либо миграционных или подвижных элементов. Однако, если это невозможно канал с наименьшим движения должны быть выбраны.
3. Если свободной оперативной памяти в системе, используемой для анализа меньше в два раза больше первоначального набора данных, выберите опцию использовать виртуальные стека. Это будет хранить зарегистрированный HyperStack в виде последовательности изображений, а не сохранять файл в ОЗУ.
   1. Выберите папку для плагина для вывода человека исправлены ИМАGES файлы. Отдельный файл изображения будет создан для каждого канала в каждой позиции г.
4. Модуль будет проводить фазовый анализ корреляции парного между каждой временной точке, чтобы определить требуемую коррекцию который затем применяется к набору данных.

Результаты

В развивающихся данио, быстрые мышечные клетки сливаются в многоядерных волокон от 19 часов после оплодотворения (20 - сомитов) ^13. Для того чтобы визуализировать движение ядер и слияние мышечных клеток мы проведенных 4D конфокальной микроскопии покадровой использованием трансгенн?...

Обсуждение

Наша способность использовать программное обеспечение постобработки исправить образец дрейф наборов данных, полученных из расширенных покадровой экспериментов микроскопии ограничивается рядом факторов. Способность различать дрейф в зависимости от миграционного движения образца ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000