Beispiel Drift Korrektur Nach 4D Konfokale Zeitraffer-Imaging

Zusammenfassung

Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Entwicklungsprozessen. Wachstum oder Drift der Proben während der Bildaufnahme reduziert die Fähigkeit, genau zu verfolgen und zu messen Zellbewegungen während der Entwicklung. Wir beschreiben die Verwendung von Open-Source-Bildbearbeitungssoftware für dreidimensionale Probe Drift über die Zeit zu korrigieren.

Zusammenfassung

Die Erzeugung des vierdimensionalen (4D) konfokale Datensätze; bestehend aus 3D-Bildsequenzen über die Zeit; bietet eine hervorragende Methode, um Zellverhalten in Entwicklungsprozessen beteiligt zu erfassen. Die Fähigkeit zu verfolgen und folgen Zellbewegungen wird durch Probenbewegungen, die durch die Probe während der Bildaufnahme treiben oder, in einigen Fällen das Wachstum auftreten beschränkt. Tracking-Zellen in Datensätzen durch Drift und / oder Wachstums betroffen, diese Bewegungen in jede Analyse von Zell-Position zu übernehmen. Dieser kann aus der scheinbaren Bewegung des statischen Strukturen innerhalb der Probe führen. Daher vor der Zellverfolgung sollte jede Probe Drift korrigiert werden. Mit dem Open-Source-Distribution Fidschi ¹ von ImageJ ^2,3 und die einge LOCI Werkzeuge ⁴ des richtigen 3D-Drift-Plug-in, entwickelten wir zu fehlerhaften Probenbewegung in der konfokalen Datensätze zu entfernen. Dieses Protokoll effektiv kompensiert Probeübersetzung oder Änderungen in der Brenn position durch die Verwendung Phasenkorrelation zu jedem Zeitpunkt von einer vier-dimensionalen Datensätzen konfokalen registrieren und gleichzeitig die Fähigkeit, über längere Zeitraffer-Experimente visualisieren und messen Zellbewegungen.

Einleitung

Die konfokale Bildgebung ist weit verbreitet in Zell-und Entwicklungsbiologie, Zell Bewegungen und Veränderungen in der Morphologie zu folgen. Erfassen einer Reihe von optischen Schnitten in verschiedenen Brennebenen ermöglicht die Erzeugung einer dreidimensionalen (3D) Modells der Probe, die dann durch die Schaffung eines Zeitserien von 3D-Datensätzen in vier Dimensionen (4D) verlängert werden können. Die Generation von 4D-Datensätzen ermöglicht die detaillierte Messung von Zellbewegungen und Verhaltensweisen. In Langzeit-Zeitraffer-Experimente ist es üblich, Probenbewegung zu beobachten. Dies kann durch kleine Ungenauigkeiten in der Hardware-Steuerung Bühne und Fokuspositionen verursacht werden. Während in anderen Fällen ist ein Ergebnis der Driftbewegungen Probe Wachstum oder Flexibilität in der Probenmontage Medien induziert. Methoden existieren, um auszugleichen oder zu begrenzen, diese Bewegungen einschließlich der Verbesserung Hardware Fokussiersysteme und erhöhte Steifigkeit der Montage Medium. Jedoch sind diese Ansätze können in vielen Fällen aufgrund der Abbildungs ​​s angewendet werdenet up erforderlich, geeignete Bedingungen für die Proben Wartung und Wachstum. Open-Source-Software-Lösungen nicht für die Korrektur der Bewegung in 2D über die Zeit vorhanden ist, durch den Einsatz der STACKREG und TURBOREG (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ Plugins in ImageJ oder Fidschi, aber diese kann nicht 4D Datensätze angewendet werden.

Um für die Probe Drift zu korrigieren haben wir eine Plug-in (Richtiges 3D-Drift), um die Open-Source-Bildverarbeitungsplattform, Fidschi ¹ nutzen entwickelt. Unser Plug-in ist in der Lage, Phasenkorrelation Registrierung durchzuführen, um eine Bewegung, die als Ergebnis der Probendrift im dreidimensionalen Zeitraffer-Experimente erfolgt korrigieren. Phase ⁶ ist eine Korrelation Rechen effiziente Methode zur Übersetzung zwischen den Bildern zu bestimmen. Die hier beschriebene Plug-in nutzt die Phasenkorrelation Bibliothek von Preibisch et al. ⁷ entwickelt. Der Mehrkanal-Experimenten die Steck nutzt einen Kanal zur Bestimmungne die erforderliche Korrektur. Diese Korrektur wird dann auf zusätzliche Kanäle, was zu der Eintragung der 4D-Datensatz angelegt.

Im Zebrafisch-Modell-System ist es möglich, Zeitraffer-Bildgebung über einen Zeitraum von vielen Stunden oder sogar mehrere Tage ^8. Eine gängige Methode für die Montage des Zebrafisch ist es, die betäubt Live-Embryo in niedrig schmelzender Agarose (0,8-1,5%) einbetten, die Beschränkung ihrer Bewegung ^11.09. Während Bewegung eingeschränkt ist noch Wachstum der Probe auftritt, was in den Zellen innerhalb des Sichtfeldes Schaltposition. Um die Bewegung der Zellen innerhalb des Embryos zu folgen ist es notwendig, zuerst für die Bewegung der gesamten Probe zu korrigieren. Dieses Protokoll wurde mit Zebrafisch-Proben entwickelt und hat zu Bild ¹² Somitenentwicklung verwendet worden kann aber zu jedem 4D konfokalen Datenmenge angewendet werden.

Protokoll

Ein. 4D Zeitraffer-Imaging Experimente

Die für die Bildaufnahme verwendete Einstellungen in Abhängigkeit von der verwendeten Ausrüstung variieren. Die Fähigkeit der konfokalen Mikroskopie optisch Schnitt einer Probe hängt von einer Anzahl von Faktoren: die Wellenlänge des Anregungs, Lochblendengröße, numerische Apertur des Objektivs, den Brechungsindex der Probe und des Mediums, in dem die Probe eingebettet ist. Die Größe des konfokalen Lochblende ausgewählt wird, die Dicke der gesammelten optischen Abschnitt zu bestimmen. Eine kleinere Lochblende ein dünner optischer Schnitt Erhöhung der z-Achse Auflösung, sondern die Verringerung der Menge an Licht, eingefangen zu produzieren. Eine größere Lochblende wird die Dicke des optischen Schnitt erhöhen, wodurch z-Achse Auflösung, sondern die Erhöhung der Menge von Licht eingefangen.

Zusätzliche Faktoren, die bei der Sammlung von 4D-Daten vor der Korrektur berücksichtigen:

1. Scan-Geschwindigkeit zu optimieren, zu beseitigen oder zu begrenzen, treiben dährend die Erfassung von einem einzigen Zeitpunkt. Deshalb ist die Zeit für die Bildsammlung entnommen sollte ein kleiner Bruchteil des Intervalls zwischen den Zeitpunkten.
2. Perfekt wiederholenden Strukturen oder Gitter, sind nicht als Strukturen für die Registrierung geeignet, da es nicht möglich ist, um die erforderliche Korrektur zu bestimmen. Zufällig verteilt Perlen oder unebene Strukturen eindeutige Registrierung zu ermöglichen.
3. Wenn Drift wird erwartet, erhöhen Sie den Scanbereich und obere und untere Grenzen Fokus, um sicherzustellen, das Gebiet von Interesse innerhalb des Bildstapels bleibt.
4. Neben der Sicherstellung eine angemessene räumliche Auflösung, die Strukturen von Interesse zu beheben, legen Sie die Abtastrate auf zeitliche Auflösung für die dynamischen Ereignisse untersucht werden.
   Hinweis: Die Zeit zwischen Bildzeitpunkten sollte daher mindestens die Hälfte der Zeit-Intervall zwischen regelmäßigen wiederkehrende Ereignisse und senken für unregelmäßige Veranstaltungen.

2. Öffnen der konfokale Dataset

Die Open-Source-Paket Fidschi ist eine Verteilung der ImageJ-Programm, das vorinstallierte Plug-ins für zahlreiche Prozesse auf Daten aus der Mikroskopie Experimente durchführen gesammelt enthält. Die Software bietet einfacher Plug-in-Architektur und Update enthält eine Kopie der richtigen 3D-Drift-Plug-in für dieses Protokoll verwendet. Die Software unterstützt den Import einer Vielzahl von proprietäre Bildformate Mikroskopie durch den Einsatz des Open-Mikroskopie Umwelt Bio-Formate Import-Plug-in.

1. Installieren Sie den Fidschi-Programm (http://fiji.sc/Downloads).
2. Laden Sie die Datenmenge mit Hilfe der erworbenen LOCI Bio-Formate Importer-Plugin.
3. Wenn die Datenmenge ist größer als der Speicher für das Programm, wählen Sie die Option "Verwenden virtuellen Stack" in der Speicherverwaltung.

3. Drift Korrektur eines 3D-Objekt im Post Processing

Im Verlauf eines längeren Zeitrafferexperimentieren, eine Probe zu bewegen, auch wenn eingebettet. Um eine Bewegung zu korrigieren und damit die Migration Ereignisse abgebildet analysiert werden soll, kann die Nachbearbeitung der Bilder durchgeführt werden. Alle Bildnachbearbeitung muss deutlich in der Methodik der Analysen aus dieser Arbeit abgeleitet beschrieben werden.

1. Sobald der Datensatz geladen wurde, führen Sie die korrekte 3D-Drift-Plugin.
2. Wenn es mehrere Bildkanäle, wählen Sie die zu verwendenden Kanal, um die Bilder zu registrieren. Dies sollte idealerweise stellen eine statische Struktur innerhalb der Probe eher als alle Zugvögel oder mobile Elemente. Jedoch, wenn dies nicht möglich ist der Kanal mit der geringsten Bewegung gewählt werden.
3. Wenn der verfügbare RAM auf dem für diese Analyse verwendete System ist weniger als doppelt so groß wie die ursprüngliche Datenmenge, wählen Sie die Option Gebrauch virtuellen Stack. Dies wird die registrierte Hyperstack als Bildsequenz zu speichern, anstatt die Datei in den Arbeitsspeicher.
   1. Wählen Sie einen Ordner für das Plug-in die Ausgabe einzelner korrigiert images-Dateien. Eine separate Bilddatei wird für jeden Kanal an jeder z-Position erstellt werden.
4. Das Plugin wird dann führen eine paarweise Phasenkorrelationsanalyse zwischen den einzelnen Zeitpunkt, um die erforderliche Korrektur, die dann auf den Datensatz angewandt bestimmen.

Ergebnisse

In der sich entwickelnden Zebrafisch, verschmelzen schnellen Muskelkernige Zellen in Fasern von 19 Stunden nach der Befruchtung (20 - Somitenstadium) ^13. Um die Bewegung der Kerne und Fusion von Muskelzellen führten wir 4D konfokalen Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung eines transgenen Stamm, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle des α-Skelett-Aktin-Promotors exprimiert, um alle Muskeln kenn visualisieren Zellen ¹⁴ und injizierten RNA die rote fluoreszierende Protein mCh...

Diskussion

Unsere Fähigkeit, Post-Processing-Software verwenden, um Probendrift von Datensätzen aus erweiterten Zeitraffer-Mikroskopie Experimente abgeleitet korrigieren wird durch eine Reihe von Faktoren eingeschränkt. Die Fähigkeit, gegenüber Drift Wanderungs einer Probe zu erkennen ist abhängig von den zellulären Marker verwendet. Cellular Marker, die entweder weit innerhalb einer Probe ausgedrückt sind oder während der Bildaufnahme nicht in Migrations Veranstaltungen beteiligt bieten die beste Quelle für Driftkorrekt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000