Correzione Drift seguente esempio 4D confocale Time-lapse imaging

Riepilogo

Microscopia time-lapse consente la visualizzazione dei processi di sviluppo. Crescita o deriva dei campioni durante l'acquisizione dell'immagine riduce la capacità di seguire con precisione e misurare i movimenti delle cellule durante lo sviluppo. Descriviamo l'uso di software di elaborazione di immagini open source per correggere tridimensionale deriva campione nel tempo.

Abstract

La generazione di quattro dimensioni (4D) dataset confocale; costituito da sequenze di immagini 3D nel tempo; fornisce un'eccellente metodologia per catturare comportamenti cellulari coinvolti nei processi di sviluppo. La possibilità di monitorare e seguire i movimenti delle cellule è limitata dai movimenti di esempio che si verificano a causa di deriva del campione o, in alcuni casi, la crescita durante l'acquisizione dell'immagine. Inseguimento cellule in dataset colpite da drift e / o la crescita sarà integrare questi movimenti in una qualsiasi analisi della posizione della cella. Ciò può provocare il movimento apparente strutture statiche all'interno del campione. Quindi prima di tracciamento delle cellule, la sua deriva campione deve essere corretto. Uso open source Fiji distribuzione ¹ di ImageJ ^2,3 e gli strumenti LOCI incorporati ^4, abbiamo sviluppato il corretto 3D deriva plug-in per rimuovere movimento campione erronea in dataset confocale. Questo protocollo compensa in modo efficace per la traduzione campione o alterazioni po focalezione utilizzando fase correlazione registrare ogni time-point di una quadridimensionali dataset confocale, pur mantenendo la capacità di visualizzare e misurare i movimenti delle cellule nel corso prolungati esperimenti di time-lapse.

Introduzione

Confocale è ampiamente usato in biologia cellulare e dello sviluppo di seguire i movimenti delle cellule e dei cambiamenti nella morfologia. Acquisizione di una serie di sezioni ottiche a diversi piani focali consente la generazione di un tridimensionale (3D) modello di un campione, che può essere esteso in quattro dimensioni (4D) creando una serie tempo-intervallo di set di dati 3D. La generazione di set di dati 4D permette la misurazione dettagliata dei movimenti delle cellule e dei comportamenti. In esperimenti di time-lapse a lungo termine è comune osservare il movimento del campione. Ciò può essere causato da lievi imprecisioni in fase di controllo hardware e le posizioni focali. Mentre in altri casi, la deriva è il risultato di movimenti indotti dalla crescita campione o flessibilità all'interno del mezzo di montaggio del campione. I metodi esistono per compensare o limitare questi movimenti compresi i miglioramenti ai sistemi di messa a fuoco hardware e una maggiore rigidità del mezzo di montaggio. Tuttavia, questi approcci non possono essere applicati in molti casi a causa del l'imaging set fino tenuta a fornire le condizioni adatte per il mantenimento e la crescita dei campioni. Esistono soluzioni software open source per la correzione del movimento in 2D nel corso del tempo, attraverso l'utilizzo delle StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ plugins in ImageJ o Fiji, ma questi non possono essere applicate ai dataset 4D.

Per correggere la deriva del campione abbiamo sviluppato un plug-in (Correct deriva 3D) per utilizzare la piattaforma di imaging di elaborazione open-source, Fiji ^1. Il nostro plug-in è in grado di eseguire fase di registrazione correlazione per correggere movimento che si verifica a causa di deriva campione tridimensionali esperimenti temporizzati. Correlazione di fase ⁶ è un metodo efficiente di calcolo per determinare traduzione tra immagini. Il plug-in qui descritto utilizza la libreria di fase-correlazione sviluppato da Preibisch et al. ^7. In esperimenti multi-canale, il plug-in utilizza un canale di determinazionene la correzione richiesta. Questa correzione viene quindi applicata a tutti i canali supplementari conseguente registrazione del set di dati 4D.

Nel sistema modello zebrafish è possibile effettuare time-lapse imaging in un periodo di molte ore o anche diversi giorni ^8. Un metodo comune per il montaggio del zebrafish è di incorporare l'embrione vivo anestetizzato in bassa agarosio punto di fusione (0,8-1,5%), limitando il suo movimento ^9-11. Mentre il movimento è limitato crescita del campione si verifica ancora, con conseguente cellule all'interno del campo visivo posizione spostamento. Al fine di seguire il movimento delle cellule all'interno dell'embrione è necessario correggere prima per il movimento dell'intero campione. Questo protocollo è stato sviluppato con i campioni di zebrafish, ed è stato utilizzato per lo sviluppo di immagini somite ^12, ma può essere applicato a qualsiasi confocale dataset 4D.

Protocollo

1. 4D Time-lapse esperimenti di imaging

Le impostazioni utilizzate per l'acquisizione di immagini variano a seconda del materiale utilizzato. La capacità di microscopia confocale a sezione otticamente un campione dipende da una serie di fattori: la lunghezza d'onda di eccitazione, dimensioni pinhole, apertura numerica dell'obiettivo, l'indice di rifrazione del campione e del mezzo in cui è incorporato il campione. La dimensione del foro stenopeico confocale selezionato determinerà lo spessore della sezione ottica raccolto. Un foro più piccolo produrrà una sezione ottica sottile aumentando la risoluzione asse z ma riducendo la quantità di luce catturata. Un foro più grande aumenta lo spessore della sezione ottica, riducendo la risoluzione asse z ma aumentando la quantità di luce catturata.

Altri fattori da considerare durante la raccolta dei dati 4D prima correzione includono:

1. Ottimizzare la velocità di scansione per rimuovere, o limite, deriva durante la cattura di un singolo punto temporale. Pertanto il tempo impiegato per la raccolta di immagini dovrebbe essere una piccola frazione dell'intervallo tra punti temporali.
2. Strutture perfettamente ripetitive, o griglie, non sono adatti come strutture per la registrazione in quanto non è possibile determinare la correzione richiesta. Perline casualmente distribuiti o strutture irregolari permetterà la registrazione univoca.
3. Se si prevede di deriva, aumentare l'area di scansione e limiti fuoco superiore e inferiore per assicurare l'area di interesse rimane all'interno della serie di immagini.
4. Oltre a garantire l'opportuno risoluzione spaziale per risolvere le strutture di interesse, impostare la frequenza di campionamento per fornire la risoluzione temporale per gli eventi dinamici in fase di studio.
   Nota: Il tempo tra immagine punti temporali dovrebbe quindi essere almeno la metà del tempo-intervallo tra eventi che si ripetono regolarmente e diminuire per eventi irregolari.

2. Apertura del confocale Dataset

Il pacchetto open source Fiji è una distribuzione del programma ImageJ, che contiene i plug-in pre-installati per eseguire numerosi processi sui dati raccolti dagli esperimenti di microscopia. Il software fornisce facile plug-in aggiornamento architettura e include una copia del corretto 3D deriva plug-in utilizzato per questo protocollo. Il software supporta l'importazione di una vasta gamma di formati proprietari di immagine al microscopio attraverso l'utilizzo di Bio-formati di importazione plug-in di Open Microscopia Ambiente.

1. Installare il programma Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Caricare il set di dati acquisiti tramite il plugin Importatore LOCI Bio-formati.
3. Se il dataset è maggiore rispetto alla memoria assegnata al programma, selezionare l'opzione "Utilizza l'opzione stack virtuale" all'interno della sezione gestione della memoria.

3. Correzione Drift di un oggetto 3D in Post Processing

Nel corso di un prolungato tempo-lapseesperimento di un campione può muoversi anche quando incorporato. Per correggere qualsiasi movimento e consentire gli eventi di migrazione impressi da analizzare, post-elaborazione delle immagini può essere effettuata. Tutta l'elaborazione dell'immagine postale deve essere chiaramente descritta nella metodologia di qualsiasi analisi derivata da questo lavoro.

1. Una volta che il dataset è stato caricato, eseguire il corretto 3D plug deriva.
2. Se ci sono canali di immagini multiple, selezionare il canale da utilizzare per registrare le immagini. Questo dovrebbe rappresentare idealmente una struttura statica all'interno del campione piuttosto che elementi migratori o mobili. Tuttavia, se ciò non è possibile il canale di minor movimento dovrebbe essere scelto.
3. Se la RAM disponibile sul sistema utilizzato per questa analisi è inferiore a due volte la dimensione di dati originale, selezionare l'opzione stack virtuale uso. Questo memorizzare il HyperStack registrato come una sequenza di immagini, piuttosto che salvare il file RAM.
   1. Selezionare una cartella per il plug-in per singola uscita corretto imafile Ges. Verrà creato un file di immagine separato per ogni canale in ciascuna posizione z.
4. Il plugin sarà quindi condurre un'analisi di correlazione di fase pair-wise tra ogni time-point per determinare la correzione richiesta che viene poi applicata al dataset.

Risultati

In zebrafish di sviluppo, le cellule muscolari veloci fondono in fibre multinucleate da 19 ore dopo la fecondazione (20 - fase somite) ^13. Per visualizzare il movimento di nuclei e fusione di cellule muscolari noi svolte 4D confocale time-lapse utilizzando un ceppo transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore scheletrico α-actina di etichettare tutti del muscolo celle ¹⁴ e iniettato RNA codificante la proteina fluorescente rossa mCherry etichettato ...

Discussione

La nostra capacità di utilizzare software di post-elaborazione per correggere la deriva campione di set di dati derivati ​​da estese time-lapse esperimenti di microscopia è limitato da una serie di fattori. La capacità di discernere deriva contro movimento migratorio di un campione dipende marcatori cellulari utilizzati. Marcatori cellulari che sono sia ampiamente espresse all'interno di un campione o non sono coinvolti in eventi migratori durante l'acquisizione dell'immagine garantiscono la migliore ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000