הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Summary

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC ₅₀₎ וIC ₅₀ ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

Abstract

למרות מספר תרופות אנטי HIV אושרו, יש עדיין בעיות עם רעילות ועמידות לתרופה. זה מדגים את הצורך לזהות תרכובות חדשות שיכול לעכב זיהום על ידי זני HIV-1 הנפוץ בסמים עמידים עם רעילות מינימאלית. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי לקבוע את cytotoxicity ויעילות של מתחם כנגד זנים נגיפיים WT ומוטציה הסלולריים במהירות.

שורת תאי המטרה הרצויה היא זורעים בצלחת 96 היטב, ולאחר דגירה 24 שעות, באופן סדרתי דילולים של התרכובות להיבדק מתווספים. אין מניפולציות נוספות נדרשות למבחני cytotoxicity הסלולרי; עבור אנטי HIV מבחני סכום קבוע מראש של או WT או וקטור HIV-1 עמיד בפני תרופה המבטא לוציפראז מתווסף לתאים. Cytotoxicity נמדד באמצעות assay ATP תלוי הארה ואת ההשפעה של התרכובות בinfectivity נמדד על ידי קביעת סכום lucifeRase בנוכחות או היעדר מעכבים המשוערים.

assay הקרנה זה לוקח 4 ימים כדי להשלים ויכולים להיות מוקרן תרכובות מרובות במקביל. תרכובות מוקרנות בשלושה עותקים והנתונים מנורמלים לרמות infectivity / ATP בהעדר תרכובות יעד. טכניקה זו מספקת מדידה מהירה ומדויקת של היעילות ורעיל של תרכובות אנטי HIV פוטנציאליים.

Introduction

הזמינות של תרופות המכוונות כמה צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי HIV-1 הובילה לטיפול משולב תרופתי (נקרא טיפול אנטי retroviral פעיל מאוד, או HAART) ששפר את הטיפול ב-HIV-1 זיהומים, והישרדות לטווח הארוך מאוד של חולים. HAART, אשר בדרך כלל משתמש בשילובים של שני טרנסקריפטאז ההפוך נוקלאוזידים מעכבים (RT) וגם מעכבי פרוטאז או מעכבי RT נוקלאוזידים לא, יש עכשיו הוסב מחלה קטלנית למצב חיים ארוכים ^1-5. עם זאת, למרות הצלחות רבות של HAART בדיכוי מתמשך של שכפול נגיפי, יש לו מגבלות. HAART לא למגר את האיידס, ולכן החולים אינם נרפא וטיפול הוא חיים ארוכים. יש בעיות עם רעילות תרופה ועם הופעתה של סמים זנים עמידים. התנגדות יכולה להתעורר לכל תרופות שאושרו נגד האיידס, כוללים תרופות שאושרו לאחרונה כי יעד אינטגראז HIV (IN). עמידות לתרופות סבירה מתעוררת becaשימוש במוטציות ספונטניות המתרחשות בעת שכפול נגיפי (שיעור שגיאה של 3 x 10 מחזור ^-5 מוטציות / בסיס / שכפול) ^6. כאשר מוטציות להתעורר בקידוד גנים למטרות של תרופות אנטי רטרווירלי, קבוצה קטנה של מוטציות אלה תוביל לירידה ברגישות של הזן הנגיפי לסמים. כדי למנוע ההתפתחות של עמידות לתרופה, ריכוז תרופה חייב להישמר ברמות שלדכא את שכפול נגיף האיידס באופן מלא. דבקות עניים למשטר הטיפולי מחריפה את הבעיה, ויכולה להוביל להתפתחות המהירה של התנגדות ^7-9. למרות שריכוזי תרופה יכולים להשתנות בחולים עקב ספיגה שונה, חילוף חומרים, הפצה, ורמות הפרשה, ריכוזי תרופה גבוהים יכולים להוביל לרעילות ^10. מאז הטיפול ממשיך לחייו של המטופל, יש חששות בטיחות חמורים על הרעילות ארוכת הטווח של retrovirals אנטי. Retrovirals נגד שימוש נפוץ בHAART יכול להיות תופעות לוואיnd יש כבר מקרים שבהם תופעות הלוואי הייתה סכנת החיים ^11-15. בעיות חולים נתקלים עם ההתפתחות של עמידות ורעיל בבסיס הצורך בפיתוח תרופות חדשות שיעילות לחסום את השכפול של הזנים הנפוצים התרופה עמידות של הנגיף עם רעילות ארוך טווח קטן או לא.

לפיכך, יש צורך בassay שיכול להקרין לתרכובות לחסום צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי במהירות. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי להעריך את cytotoxicity של תרכובות והיכולת שלהם לחסום את השכפול של שני WT וזני HIV עמיד לתרופות במהירות וביעילות. Assay אנו משתמשים דומה לassay שפותח למסך בעמידות לתרופה בוירוס מבודד מהחולים ^16-18.

למרות assay ניתן להשתמש בם ללא שינוי למסך עבור תרכובות שיכולים לחסום שעתוק לאחור איידס, אנו descrIBE באמצעות assay להעריך במעכבים. IN הוא אנזים נגיפי חיוני שמוסיף את ה-DNA הנגיפי לתוך הגנום התאי ^19. למרות מספר מבטיח במעכבים מפותחים, שחלקם כעת בתהליך של ניסויים קליניים, רק ^{20 Isentress, 21} (הידוע גם בRaltegravir או RAL) ולאחרונה, Elvitegravir (EVG) ²² וDolutegravir (DTG) ²³ היו שאושר על ידי ה-FDA. תרכובות אלו הן פעילים נגד שני HIV B ו-B תת הלא בתרבית תאים ובחולים ^{24, 25.} עם זאת, טיפול בRAL בוחר לעמידים לתרופות HIV-1 במוטציות, כולל Y143R, N155H, וG140S/Q148H ^{24, 26-31.} N155H וG140S/Q148H גם להפחית את היעילות של EVG, המדגישה את הצורך לעצב ולפתח את הדור שני במעכבי העברת גדיל (INSTIs) כי הם יעילים נגד מוטציות עמידות אלה.

Protocol

1. הכנת מניות מאסטר

1. הפוך מניות ראשיים של התרכובות להיבדק בDMSO. הכן את המניות בריכוז סטנדרטי של 20 מ"מ.
   הערה: כל ריכוז מעל 10 מ"מ יכול לשמש. תרכובות שיכולים לשמש כביקורת חיובית כדי לאמת assay זה כוללים RAL, EVG, וDTG.
2. ודאו התרכובות מומסים DMSO ידי vortexing מספר הפעמים פתרונות ל15 שניות ודוגרים על RT במשך שעה 1. אחסן 20 פתרונות מניות מ"מ בחושך ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת צלחות 96 היטב להקרנת מתחם

1. בחר את הקו הסלולרי להיבדק (למשל HOS או TZM-BL), וזרעים של תאים אלה 100 μl בצפיפות של 4 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר (4,000 תאים / טוב) בתקשורת (למשל בינוני שונה Dulbecco הנשר של או DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת streptomycin).

3. דור של מניות וירוס

לייצר VSV-G-pseudotyped-HIV על ידי transfecting 293 תאים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 1) ^32-34.

1. ביום לפני transfection, צלחת 293 תאים ב100 מנות בקוטר מ"מ בצפיפות של 1.5 x 10 ⁶ תאים.
2. ביום של transfection, transfect 293 תאים עם 16 מיקרוגרם של סוג בר או איידס מוטציה (pNLNgoMIVR ^- ΔLUC) ו4 מיקרוגרם של VSV (pHCMV-g) בשיטת סידן זרחה ^35.
3. כ 6 שעות לאחר משקע סידן זרחה הוא הוסיף, לשטוף 293 תאים פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ודגירה עם תקשורת טריות ל48 שעות. [DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר)].
4. קציר הווירוס המכיל supernatants ידי הסרת התקשורת מקוטר 100 מ"ממנות, להבהיר את supernatants ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה ב3,000 סל"ד 10 דקות, לסנן את supernatants דרך מסנן 45 מזרק הגודל הנקבובית מיקרומטר, לטפל supernatants עם טורבו DNase ל30 דקות ב RT ולדלל את supernatants בתקשורת להכנה במבחני זיהום . אחסן את supernatants הנגיפי קפוא, בaliquots, ב -80 ° C.
   הערה: כמות p24 בsupernatant נקבעת באמצעות ערכת HIV-1 p24 צמוד אנזים immunosorbent assay. ריכוז p24 משמש לשליטה את כמות הנגיף במדגם. כ 500 ננוגרם של וירוס נוסף תאי HOS מצופים על צלחות בקוטר 60 מ"מ בצפיפות של 1.5 x 10 ⁵ תאים / תבשיל ביום לפני ההדבקה. לאחר שעה 48 של דגירה, התאים נקצרים, שנאספו על ידי צנטריפוגה, שטף, וresuspended בשל PBS 100 μl. מוסיף כמות שווה של מגיב assay גן כתב הארה ולמדוד את פעילות לוציפראז כמפורט בסעיפים 5.4.1 ו5.4.2. מכאן, דילול מתאים של הנגיף יכול להתבצע כאמור בשלב 4.6.

4. מתחם הקרנה בצלחות 96 היטב

מסך בכל מתחם בשלושה עותקים ומחשבים את ממוצע התוצאות.

הערה: ההשפעה של כל מתחם בשכפול נגיפי היא תיקנה על ידי נרמול לרמה של שכפול המתקבל בהעדר כל מתחם.

1. לקבוע את טווח הריכוז האמפירי שיוקרנו.
   הערה: בדרך כלל, מסכי עם 11 דילולים סדרתי מבוצעים על ידי הוספת המתחם לעמודת הצלחת לפי עמודה ומסכים עם 7 דילולים סדרתי מבוצעות על ידי הוספת המתחם אחר שורה. שלושה עותקים סט אחד של בארות חייבים להיות שמורות לשליטה אין מתחם. בנוסף, עמודה או שורה אחת אחד חייבת להישאר ריקה לפעול כביקורת השלילית / רקע. לבסוף, בין אם מדובר בcytotoxicity סלולארי או assay infectivity יכתיב אם הוא הוסיף וירוס.
2. להכיןדילולים סדרתי מפתרון מניות 20 מ"מ. הריכוזים נבחרים בהתאם לטווח אמפירי הנחוש של ריכוזים להיבדק (כפי שמוצגים בטבלה 1). הכן את דילולים בתקשורת ב10x הריכוז הסופי הרצוי, כלומר אם הריכוז הסופי הולך להיות 100 מיקרומטר, להפוך את המניה עובדת 1 מ"מ.
   הערה: תרכובות עם IC ₅₀ של מעל 5-10 מיקרומטר אינן מועמדים טובים בדרך כלל לפיתוח תרופה. במבחנים הראשוניים אנו בוחנים את התרכובות רק נגד וקטור WT. תרכובות מבטיחות שיעילות לעכב את וקטור WT מכן נבדקו מול פנל של מוטציות עמידות לתרופות.
3. הסר את צלחות 96 היטב מן האינקובטור ולהוסיף דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק לבארות בשלושה עותקים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 2).
   הערה: הנפח הוסיף לגם צריך להיות בריכוז הסופי 1/10 נפח. לפיכך, להוסיף 22 μl / טוב (עמ 'הנפח הסופיבנוסף וירוס OST הוא 220 μl) עבור מבחני infectivity. עבור מבחני cytotoxicity, להוסיף μl 11 / טוב (נפח סופי הוא 110 μl / טוב).
4. החזר את צלחות 96 היטב לחממה. למסך cytotoxicity הסלולרי, דגירה צלחות 96 היטב 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס ולא מניפולציות נוספות יש צורך בפרוטוקול 4: להמשיך לפרוטוקול 5 למבחני infectivity, תמשיך ביצוע ההנחיות בפרוטוקול 4..
5. מבחני Infectivity בלבד. הסר את הצלחות מן החממה לאחר מינימום של 3 שעות דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם התרכובות כדי להיות מנותחים.
   שים לב: זה מאפשר את המתחם שנלקח על ידי התאים לפני ההדבקה עם וקטור ה-HIV.
6. הכן את דילול מניות של הנגיף ^{33, 34} (בדרך כלל כ 1:3) שיפיק אות לוציפראז בין .2-1.5 יחידות יחסי לוציפראז (RLUs) בתאים שלא טופלו. כל צלחת תיקח כ 10 מיליליטר של diluוירוס טד. הוספה של וירוס 100 μl לכל אחת מהבארות, או באמצעות pipettor רבת ערוצים 8 או 12. אל תוסיף וירוס לבארות ביקורת שלילי / רקע. החזר את הצלחות ל37 מעלות צלזיוס החממה ל48 שעות.
   הערה: דילול מניות 1:03 של הנגיף הוא דילול טיפוסי שיפיק אות לוציפראז בין 0.2 -1.5 RLUs מבוססת על assay p24 מראה כי הריכוז הנגיפי בsupernatant הוא כ 500 ng ב1.0 מיליליטר.

5. הכנה ומדידה של Cytotoxicity וInfectivity צלחות 96 היטב

1. לשאוב את התקשורת מהבארות (פנול האדום בתקשורת יכולה להפריע לאות לוציפראז). השתמש פיפטה זכוכית עם קצה פיפטה 200 μl מצורף בסוף. התחל בחלק העליון של התקשורת ועובד לאט לכיוון הפינה התחתונה של הבאר. אל תבזבזו יותר מדי זמן בתחתית הבאר, או תאים ניתן להסיר מהבאר.
2. של PBS הוספה 100 μl בתוספת 0.5 מ 'M MgCl ₂ היטב כל אחד. זה צריך להיעשות באופן מיידי לאחר שהתקשורת מוסרת, כך שהתאים לא יתייבשו.
3. רק עבור מבחני cytotoxicity, מוסיף 5 מיליליטר של חיץ מצע מassay גילוי הארה ATP לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לצלחת 96 היטב.
   1. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה התא מassay גילוי הארה ATP היטב כל אחד. לנער את צלחת 96 היטב ב700 סל"ד ב RT במשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי.
   2. הוסף 50 μl של מגיב assay הגילוי מחדש הארה ATP לכל הבארות מלבד בארות שליטה / רקע השליליות. לנער ב700 סל"ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי. דגירה הצלחות ב RT עבור 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות.
   3. קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate.
      הערה: פתח את תכנית luminometer microplate Pro SoftMax. ודא luminometer מוגדר למדוד לומיםnescence ברגישות של 5 קריאות / כן.
4. רק עבור מבחני infectivity, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ מצע מassay גן כתב הארה לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לכל צלחת 96 היטב.
   1. הוספה של מגיב כתב הארה מחדש assay גן 100 μl היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות.
   2. קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate כפי שבוצע בסעיף 5.3.3.

6. קביעת CC ₅₀ וIC ₅₀ ערכים לתרכובות

1. להעביר את נתוני לוציפראז מluminometer microplate לתוך גיליון אלקטרוני Excel.
   1. ממוצע שני נתונים לוציפראז בשלושה עותקים ונתונים אות רקע / שליטה. להחסיר אות רקע / שליטה הממוצעת של האות בשלושה עותקים בממוצע לטווח הריכוז כולו.
   2. נרמל הרקע תיקן אות ממוצעת לטווחי הריכוז נגד הפעילות, בין אם מדובר cytotoxicity או infectivity, בהעדר כל מתחם על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים.
      הערה: עיכוב אחוזים מוגדר כפעילות לוציפראז בנוכחות הסמים מחולקת בפעילות לוציפראז בהעדר התרופה כפולה 100.
2. השתמש בתוכנת Kaleidagraph להשיג CC ₅₀ וIC ₅₀ ערכים
   1. העבר את שני טווח הריכוז באופן אמפירי נחוש ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז לKaleidagraph.
   2. להתוות את הנתונים בטווח הריכוז על ציר x ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז על ציר y.

תוצאות

אם assay (איור 1, על שלבים 1 ו -2) בוצע בהצלחה, ולאחר מכן את ערכי לוציפראז צריכים להיות דומים לנתונים המוצגים בטבלה 2 סריקה על פני טווח הריכוז.; מתחם פוטנציאל חזק יגלה הגברת פעילות לוציפראז משמאל לימין, והשליטה צריכה להיות פעילות לוציפראז הגבוהה ביותר. אם פעילות לוציפראז אינה עולה על 0.1 יחידות יחסית בלוציפראז (RLUs) על פני טווח הריכוז, זה בדרך כלל מצביע על כך שהמתחם הרג את התאים. אם נתוני לוציפראז הוא גדולים או שווה ל2.0 RLUs בכל דילולים סדרתי, ולאחר מכן את התרכובות לא היו מסוגלים לעכב HIV-1 זיהומים בריכוזים שנבדקו.

זומם את הריכוז של התרכובות לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph (לוח 3, חלק א '), לאחר ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית, יפיק תוצאות דומות לt צינור שמוצג בטבלה 3, ב 'חלק

איור 1. הכנה של HIV-1 מניות ויראלי וההתקנה של סלולארי Cytotoxicity ויחיד בסיבוב Infectivity מבחני. בשלב 1, תאי 293T הם transfected עם pNL4.3ΔEnv.LUC וVSV-G וטופחו במשך 48 שעות כדי לייצר וירוס ³⁴ . הווירוס שנקטפו ואוחסן (הוקפא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots) עד שהוא השתמש במבחני infectivity. עבור שלב 2, תאי HOS הם זורעים בצלחת 96 היטב וטופחו במשך 24 שעות. לאחר מכן תאי preincubated עם דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק במשך 3 שעות ולאחר מכן נגוע בוירוס (או WT או סמים עמידים). לאחר דגירה 48 שעות, פעילות לוציפראז נמדדת.

"Width =" le1.jpg 300 "/>
טבלת 1. תרופות הקרנת Prototype דילול סדרתי. הקרנה מחמירה יותר כרוכה 11 דילולים סדרתי אשר בדרך כלל מתחילים ב 10 מיקרומטר ויסתיימו ב0.0005 מיקרומטר. דילולים סדרה מוכנים 10x; יש תאי 100 μl ושל וירוס 100 μl בכל טוב). בכרך זה ולאחר חישובים אלה, דילולים סדרתי יהיו מספיק בשביל 3 שורות של צלחת 96 היטב כולו. מבחני cytotoxicity ערוכים באופן דומה; עם זאת 11 דילולים סדרתי להתחיל ב250 מיקרומטר ויסתיימו ב0.05 מיקרומטר. רק 11 μl של דילולים נוספים לבארות בצלחת המכילות תאי 100 μl. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 2. Readout וקביעת עיכוב אחוז מבלוציפראז פעילות נתונים בלוציפראז איתותים. טבלת הנתונים מציגה סדרה טיפוסית של נתונים לוציפראז למתחם מוצלח. הטבלה מציגה גם את החישובים הנוספים דרושים על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז וCC ₅₀ וIC ₅₀ ערכים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לוח 3. ינארית ניתוח רגרסיה טבלת נתונים. חלק א '. גרפים טווח הריכוז בשימוש לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph יפיק את עקומות העיכוב המתאימות. חלק ב ', עקומות העיכוב מוגדרות על ידי פרמטרית 3תפקוד ובכושר לנתונים על ידי רגרסיה ליניארית sigmoidal מנתח ^18. טבלת נתונים זה משמש לאחר מכן בשיתוף עם Microsoft Excel כדי לחשב את ריכוזי התרופה הנדרשים כדי לעכב אינטגרציה וירוס וcytotoxicity הסלולרי ב -50%, למשל IC ₅₀ וCC _50. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אנו מתארים assay מהיר, יעיל, ושחזור שניתן להשתמש בם לתרכובות מסך לcytotoxicity ויכולתם כדי לעכב את השכפול של שני WT וסמים עמידים HIV-1. היכולת לזהות במהירות תרכובות ובדיקת היעילות ורעילה לתאים שלהם היא קריטית בפיתוח של תרופות חדשות ומשופרות נגד HIV-1. ברגע שתרכובות עופרת מזוהות, אנלוגים של המתחם להוביל יכולים להיות מיוצרים ונבדקו תוך שימוש באותה assay. Assay הוא יחסית פשוט. ישנן שני בקרות חיוביות ושליליות המאפשרות למשתמש כדי לאבחן את הבעיות הנפוצות ביותר (תרכובות רעילות, בעיות עם מניית הווקטור). השימוש בסט שלושה עותקים של בארות ללא מתחם הוסיף מראה כי זיהום ויראלי התרחש. העובדה שcytotoxicity נמדד בassay עצמאי נמנעה פרשנות שגויה לירידה בלוציפראז נגרמת על ידי cytotoxicity כהשפעה ספציפית על שכפול נגיפי.

השלבים הקריטייםבפרוטוקול מכינים את הצלחות, כך שהתאים מפוזרים באופן אחיד בבארות, שיש להם הבארות ריכוזים תקינים של התרכובות להיבדק, ומוסיף את אותה הכמות של וירוס לכל אחת מהבארות, ומדידת פעילות לוציפראז כדי לקבוע את CC ₅₀ וIC ₅₀ ערכים.

Assay הוא בטוח, כמוני, ושחזור. Assay הוא בטוח כי הווקטור הוא שכפול פגום. Assay הוא כמוני ולשעתק משום שהיא מבוססת על וקטור אחד עגול שמבטא לוציפראז, אשר ניתן assayed במדויק ובנוחות. בassay שכפול נגיף עגול רב, IC נמדד ₅₀ תלוי במספר מחזורי חיים נגיפיים; מדובר בבעיה מסוימת כאשר מבחני כרוכים בשני WT ווירוסים עמידים לתרופות שעשויות להיות יכולות שכפול שונות באופן משמעותי.

יש כמה מבחני האנזימטית כבר דיווחו כי יכולים בעברלשמש מסך למעכבי IN. מבחני שכוללים טכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת כדי למדוד DNA המשולב דורשים חלבונים מטוהרים רקומביננטי (ים), והם, באופן כללי, הן יותר עבודה אינטנסיבית ויקר ^{36, 37.} למרות שניתן להשתמש במבחנים האנזימטית כדי למדוד את ההשפעה של תרכובות על אנזימים האחרים נגיפיים (RT ופרוטאז), כל אנזים דורש מערכת assay משלו. Assay וקטור הסיבוב אחד, כפי שתואר, ניתן להשתמש בם, ללא שינוי, מסך עבור מעכבי RT. Assay דומה יכול לשמש מסך למעכבי פרוטאז; עם זאת, בassay מעכבי פרוטאז, התרכובות יש להוסיף לתאים המשמשים לייצור הווקטורים. Assay בנושא, תוך שימוש בתאים ווקטורים שונים, יכול גם לשמש מסך למעטפה (env) ומעכבי איחוי כניסת ה-HIV. לבסוף, ניתן להשתמש assay, בקנה מידה גדול יותר, עם מכשירי רובוטית אוטומטיים. לפיכך, assay יכול לשמש מסך ספריות גדולות של תרכובות נגד WT ומטרutant-HIV. עם זאת, העובדה assay יכול לזהות מעכבי של שכפול נגיף איידס שפועל בשלבים שונים של מחזור החיים נגיפיות נקודות להגבלה בפרשנות הנתונים. על ידי עצמו assay אינו מגדיר ששלב במחזור החיים חסום על ידי מתחם. אם שאלה זו מתעוררת, ניתן לפתור אותו על ידי שימוש בזמן של מבחני בנוסף ^38, ועל ידי בדיקת המתחם נגד חלבונים נגיפיים רקומביננטי מטוהרים.

למרבה הצער, למרות ההצלחה של תרופות נגד HIV, יש עדיין בעיות עם שניהם התנגדות ורעילות. בהיעדר חיסון ל-HIV אנטי יעיל, יש צורך לא רק לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות שתהיינה יעיל נגד מוטציות עמידות לתרופות הקיימות, אלא גם לפתח תרופות מונעות שיכול לצמצם את התפשטות הנגיף. אם שימוש מניעתי בתרופות נגד HIV incudes הטיפול של אנשים נגוע, גישה זו תציב את נטל מיוחד על פיתוח תרופות שיש little או ללא רעילות לטווח ארוך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMSO	Sigma	D2650
DMEM	Corning Cellgro	10-017
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System	Perkin Elmer	6016941
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6016751
Dulbecco's PBS	Gibco-Life Technologies-Invitrogen	14190-136
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices
KaleidaGraph	Synergy Software
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate	Thomas Scientific	12-566-26
Eppendorf Thermomixer Compact	Sigma Aldrich	T1442-1EA
Turbo DNase	Ambion-Life Technologies-Invitrogen	AM2238
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM	Millipore	SLAHA033SS
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit	Perkin Elmer	NEK050B001KT
HOS cells	ATCC	CRL-1543
TZM-bl cells	NIH AIDS Reagent Program	8129
pNL4.3ΔEnv.LUC	NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
VSV-G	NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
SoftMax Pro	Molecular Devices	0200-310