Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Резюме

Здесь мы опишем клеточную цитотоксичность и один раунд анализы инфекционности, которые позволяют для быстрого и точного скрининга соединений с целью определения их клеточную цитотоксичность (CC ₅₀₎ и значения ИК ₅₀ против WT и прочной ВИЧ-1 препарата.

Аннотация

Хотя ряд анти лекарств против ВИЧ были одобрены, все еще существуют проблемы с токсичностью и лекарственной устойчивости. Это показывает необходимость идентификации новых соединений, которые могут ингибировать инфекцию общими лекарственной устойчивостью штаммов ВИЧ-1 с минимальной токсичностью. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для быстрого определения клеточной цитотоксичности и эффективность соединения против дикого типа и мутантных штаммов вируса.

Желаемый целевой линии клеток высевали в 96-луночный планшет с и после 24 ч инкубации последовательно разведения тестируемых соединений добавлены. Никаких дополнительных манипуляций не требуется для сотовых цитотоксичность; для анти ВИЧ анализах заранее определенное количество либо WT или лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 вектора, который экспрессирует люциферазы добавляют к клеткам. Цитотоксичность измеряется с помощью АТФ зависимую люминесценции анализа и воздействие соединений на инфекционность измеряется определением количества lucifeRase в присутствии или в отсутствие предполагаемых ингибиторов.

Этот скрининг анализ занимает 4 дня, чтобы закончить и несколько соединения могут быть подвергнуты скринингу параллельно. Проводили скрининг соединений в трех экземплярах и данные нормированы на уровнях инфективность / СПС в отсутствии целевых соединений. Эта техника обеспечивает быстрое и точное измерение эффективности и токсичности потенциальных анти соединений ВИЧ.

Введение

Наличие препаратов, ориентированных на несколько важных шагов в ВИЧ-1 жизненного цикла вируса привело к комбинированной лекарственной терапии (так называемый высокую активность антиретровирусная терапия, или ВААРТ), что позволило значительно улучшить лечение ВИЧ-1 инфекции, а также долгосрочное выживание пациентов. ВААРТ, которая обычно использует комбинации двух нуклеозидов обратной транскриптазы (RT) ингибиторов и либо ингибитор протеазы или не ингибитора РТ нуклеозид, в настоящее время преобразован смертельную болезнь, в длинной жизни состоянии ^1-5. Однако, несмотря на многочисленные успехи ВААРТ в устойчивой подавления вирусной репликации, он имеет свои ограничения. ВААРТ не искореняет ВИЧ, поэтому пациенты не излечиваются и терапия длительный срок. Есть проблемы с наркотиками токсичности и с появлением штаммов устойчивы наркотиков. Сопротивление может возникнуть для всех утвержденных анти лекарств против ВИЧ, в том числе новых утвержденных препаратов, предназначенных ВИЧ интегразы (ПО). Лекарственная устойчивость всего возникает BECAиспользование спонтанных мутаций, которые происходят во вирусной репликации (скорость погрешность 3 х 10 цикла ^-5 мутации / база / репликации) ^6. Когда мутации возникают в генах, кодирующих мишеней анти ретровирусов, небольшая часть этих мутаций приведет к снижению восприимчивости вирусного штамма к препаратам. Чтобы избежать развития лекарственной устойчивости, концентрации препарата должна поддерживаться на уровне, который полностью подавляют репликацию ВИЧ. Несоблюдение лечебного режима усугубляет проблему, и может привести к быстрому развитию резистентности ^7-9. Хотя концентрации препарата может варьироваться у пациентов из-за отличающейся поглощения, обмена веществ, распределения и уровней экскреции, высокие концентрации препарата может привести к токсичности ^10. Поскольку терапия продолжается в течение жизни пациента, существуют серьезные проблемы безопасности о долгосрочной токсичности анти retrovirals. Анти retrovirals, обычно используемые в ВААРТ может иметь неблагоприятные последствияй были случаи, когда побочные эффекты были опасными для жизни ^11-15. Проблемы пациентов сталкиваются с развитием резистентности и токсичности объясняют необходимость разработки новых лекарств, которые эффективно блокируют репликацию общих лекарствам штаммов вируса практически без долгосрочного токсичности.

Таким образом, существует потребность в анализе, который может скрининга соединений, которые блокируют основные этапы в жизненном цикле вируса быстро. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для оценки цитотоксичности в соединений и их способностью блокировать репликацию как дикого типа и штаммов ВИЧ с лекарственной устойчивостью быстро и эффективно. Анализ мы используем похож на анализе, который был разработан для выявления лекарственной устойчивости вируса, выделенного у больных ^16-18.

Хотя анализ может быть использован без модификации для скрининга соединений, которые могут блокировать обратную транскрипцию ВИЧ, мы будем DescrМБП с использованием анализа для оценки В ингибиторы. В является важным вирусный фермент, который вставляет вирусной ДНК в клеточный геном ^19. Хотя ряд перспективных в ингибиторов в настоящее время разрабатываются, некоторые из которых в настоящее время проходят клинические испытания, только Isentress ^{20, 21} (также известный как Ралтегравир или RAL) и совсем недавно, элвитегравира (ГО) ²² и Dolutegravir (DTG) ^{23 закончились} утвержден FDA. Эти соединения являются активными и против ВИЧ B и не являющихся B подтипов в клеточной культуре и больных ^{24, 25.} Однако лечение RAL выбирает для лекарственно-устойчивого ВИЧ-1 у мутантов, в том числе Y143R, N155H и G140S/Q148H ^{24 26-31.} N155H и G140S/Q148H также снизить эффективность EVG, и это подчеркивает необходимость проектирования и разработки второго поколения в ингибиторов переноса цепи (INSTIs), которые являются эффективными против этих мутаций резистентности.

протокол

1. Подготовка магистерских Акции

1. Сделать мастер запасы соединений, которые будут протестированы в ДМСО. Подготовка материала по стандартной концентрации 20 мМ.
   Примечание: любая концентрация выше 10 мМ могут быть использованы. Соединения, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля для проверки этого теста включают RAL, EVG и DTG.
2. Обеспечить соединения растворяют в ДМСО при интенсивном перемешивании решений несколько раз в течение 15 секунд и инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа. Храните 20 мм растворы в темноте при температуре -20 ° С до использования.

2. Подготовка 96-луночных для соединения скрининга

1. Выберите клеточной линии, подлежащий испытанию (например HOS или ТЗМ-BL), и семян 100 мкл этих клеток при плотности 4 х 10 ⁴ клеток / мл (4000 клеток / лунку) в средствах массовой информации (например, изменение орла или DMEM среда Дульбекко с добавлением 5% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки, 5% новорожденных телячьей сывороткой, пенициллином и (50 ед / мл) плюс Streptomycin).

3. Генерация запасов вируса

Производить VSV-G-pseudotyped ВИЧ путем трансфекции клеток 293 (как показано на рисунке 1, стадия 1) ^32-34.

1. В день до трансфекции пластины 293 клеток на 100 блюд диаметра мм при плотности 1,5 × 10 ⁶ клеток.
2. В день трансфекции трансфекции клеток 293 с 16 мкг дикого типа или мутантного ВИЧ (pNLNgoMIVR ^- ΔLUC) и 4 мкг (VSV-pHCMV г) с использованием метода фосфата кальция ^35.
3. Приблизительно 6 ч после осадка фосфата кальция добавляется, мыть 293 клеток дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и инкубируют в свежей средой в течение 48 часов. [DMEM с добавлением 5% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки, 5% новорожденных телячьей сыворотки, и пенициллин (50 единиц / мл) плюс стрептомицин (50 мкг / мл)].
4. Урожай вирус, содержащий супернатантами по извлечением носителя из диаметра 100 ммблюда, уточнить супернатантов от низкоскоростного центрифугирования при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин, отфильтровать супернатантами через 45 размер пор мкм шприцевой фильтр, лечить супернатантов с Turbo ДНКазы в течение 30 мин при комнатной температуре и разбавляют супернатанты в СМИ для подготовки в инфекционных анализах . Храните вирусные супернатанты замороженные, в аликвотах, при температуре -80 ° С.
   Примечание: количество p24 в супернатанте определяется с помощью p24 иммуноферментного набора для анализа на ВИЧ-1. Концентрацию p24 используется для контроля количества вируса в образце. Примерно 500 нг вируса добавляется в HOS посеянных клеток на чашках диаметром 60 мм при плотности 1,5 х 10 ⁵ клеток / блюдо в день до инфекции. После 48 ч инкубации клетки собирали, собирали центрифугированием, промывали и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Добавить равное количество люминесценции репортера гена анализа реагента и измеряют активность люциферазы, как описано в разделах 5.4.1 и5.4.2. Исходя из этого, целесообразно разведение вируса может быть сделано, как описано в шаге 4.6.

4. Соединение скрининг в 96-луночных

Экран каждого соединения в трех экземплярах и усреднить результаты.

Примечание: эффект каждого соединения по репликации вируса корректируется путем нормализации до уровня репликации, полученной в отсутствие какого-либо соединения.

1. Определите эмпирическую диапазон концентраций быть экранированный.
   Примечание: Как правило, экраны с 11 серийных разведений изготовлены путем добавлени соединени в тарельчатой ​​колонне по колонне и экранов с 7 серийных разведений изготовлены путем добавлени соединени по ряду. Один набор скважин трех экземплярах должны быть зарезервированы для контроля нет соединения. Кроме того, один столбец или одну строку должен оставаться пустым, чтобы выступать в качестве отрицательного / фонового контроля. Наконец, является ли он или клеточную цитотоксичность анализ инфекционности будет диктовать если вирус добавляется.
2. Готовитьсерийные разведения от 20 мМ маточного раствора. Концентрации выбирают в зависимости от эмпирически определенной области концентраций, подлежащего испытанию (как показано в Таблице 1). Подготовьте разведения в СМИ в 10 раз конечная концентрация желании, то есть, если конечная концентрация будет 100 мкм, сделать рабочую акции 1 мм.
   Примечание: соединения с IC ₅₀ с выше 5-10 мкм обычно не хорошими кандидатами для разработки лекарств. На начальных анализов мы испытаний соединений только против вектора мас. Перспективные соединения, которые эффективно подавляют вектор WT затем испытывают против панели лекарственной устойчивостью мутантов.
3. Удалить 96-луночных с из инкубатора и добавить серийные разведения соединений, которые будут протестированы в лунки в трех экземплярах (как показано на рисунке 1, стадия 2).
   Примечание: объем добавлен в скважине должна быть 1/10 объем конечной концентрации. Таким образом, добавить 22 мкл / лунку (конечный объем рВирус ост добавление 220 мкл) для инфекционности анализов. Для цитотоксичность, добавить 11 мкл / лунку (конечный объем 110 мкл / лунку).
4. Вернуться 96-луночных с в инкубатор. Для экрана клеточной цитотоксичности, инкубировать 96-луночных планшетах 48 ч при 37 ° С и дальнейшие манипуляции не нужны в Протоколе 4: перейти к протоколу 5 Для инфекционности анализов, по-прежнему следуя инструкциям в Протоколе 4..
5. Инфекционность анализы только. Удаление пластины из инкубатора после как минимум 3 ч инкубации при 37 ° С с соединениями для анализа.
   Примечание: это позволяет соединение будет рассмотрен клеток до инфицирования ВИЧ вектора.
6. Подготовка исходного разведения вируса ^{33, 34} (как правило, примерно 1:3), который будет производить сигнал люциферазы между 0,2-1,5 относительных люциферазных единиц (RLUS) в необработанных клетках. Вся пластинка займет около 10 мл DiluВирус Тед. Добавьте 100 мкл вируса в каждой из лунок, с использованием либо 8 или 12 многоканальной пипетки. Не добавляйте вирус контрольных лунках негатив / фона. Возврат пластины с 37 ° C инкубаторе в течение 48 часов.
   Примечание: запас разбавление 1:03 вируса характерно разбавление что будет производить люциферазы сигнал между 0,2 -1,5 RLUS на основе p24 анализа, показывающие, что вирусный концентрация в надосадочной жидкости составляет примерно 500 нг в 1,0 мл.

5. Приготовление и оценка цитотоксичности и инфекционность в 96-луночных

1. Аспирируйте носители из скважин (фенол красный в средствах массовой информации может влиять на сигнал люциферазы). Используйте стеклянную пипетку с кончика пипетки 200 мкл, закрепленный на конце. Начало в верхней СМИ и медленно работать вниз к нижнем углу хорошо. Не тратьте слишком много времени на дне колодца, или клетки могут быть удалены из колодца.
2. Добавить 100 мкл PBS с добавлением 0,5 мМ MgCl ₂ в каждую лунку. Это должно быть сделано сразу же после среду удаляют, так что клетки не высыхают.
3. Только для цитотоксичность, добавить 5 мл субстратного буфера от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждый флакон поставляемой лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для 96-луночный планшет с.
   1. Добавить 50 мкл буфера для лизиса клеток от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждую лунку. Встряхнуть 96-луночного планшета при 700 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer.
   2. Добавить 50 мкл восстановленного люминесценции АТФ анализа обнаружения реагента во все лунки для отрицательного контроля / фоновых скважин, кроме. Взболтать при 700 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала.
   3. Читайте пластину 96-а, используя микропланшетного люминометра.
      Примечание: открыть программу SOFTmax Pro микропланшет люминометра. Убедитесь, что люминометра установлен для измерения Lumiлюминесценции при чувствительности 5 показаний / лунку.
4. Только для анализы в отношении инфекционности, добавляют 10 мл субстратного буфера от гена-репортера анализа люминесценции в каждый флакон подаваемого лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для каждого 96-луночного планшета.
   1. Добавить 100 мкл восстановленного люминесценции репортера гена анализа реагента в каждую лунку. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала.
   2. Прочитать 96-луночного планшета с использованием микропланшет-люминометра, как выполняется в разделе 5.3.3.

6. Определение КС ₅₀ и IC ₅₀ для соединений

1. Перенесите люциферазы данные из микропланшетов люминометра в таблицу Excel.
   1. Средний и люциферазы данные в трех экземплярах и данных сигнала фон / управления. Вычтите средний фон / управляющий сигнал от среднего сигнала трех экземплярах на всем диапазоне концентраций.
   2. нормализовать фон исправлены среднего сигнала для диапазонах концентраций против активности, будь то цитотоксичность или инфекционность, в отсутствие любого соединения, чтобы определить процент ингибировани.
      Примечание: Процент ингибирования определяется как активность люциферазы в присутствии препарата, разделенной на активность люциферазы в отсутствие лекарственного средства, умноженное на 100.
2. Используйте программу Kaleidagraph получить CC ₅₀ и IC ₅₀ значения
   1. Передача, как эмпирически определенный диапазон концентраций и процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph.
   2. Участок данные с диапазоне концентраций по оси х и процент ингибирования активности люциферазы на оси у.

Результаты

Если анализ (рис. 1, шаги 1 и 2) была успешно выполнена, то значения люциферазы должна напоминать данные, представленные в таблице 2 Сканирование во всем диапазоне концентраций.; потенциально мощным соединение покажет увеличение активности люциферазы слева направо, и контроль должны иметь самый высокий активность люциферазы. Если активность люциферазы не превышает 0,1 Относительная люциферазы единиц (RLUS) во всем диапазоне концентраций, это обычно означает, что соединение убил клетки. Если данные люциферазы больше или равна 2,0 RLUS во всех серийных разведений, то соединения не были способны ингибировать ВИЧ-1 инфекции у испытанных концентрациях.

Построение концентрацию соединений по сравнению процента ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph (табл. 3, часть А), после выполнения линейного регрессионного анализа, будет производить результаты, аналогичные т шланг показано в таблице 3, часть Б

Рисунок 1. Подготовка ВИЧ-1 вирусные штаммы и установки клеточной цитотоксичности и один тур анализы в отношении инфекционности. На стадии 1 293T клетки трансфицировали pNL4.3ΔEnv.LUC и VSV-G и выдерживают в течение 48 часов, чтобы произвести вирус ³⁴ . Вирус собирали и хранили (замораживали при -80 ° С в аликвотах), пока он не используется в анализы в отношении инфекционности. На шаге 2, HOS клетки высевают в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки предварительно инкубировали с серийными разведени ми тестируемых соединений в течение 3 часов, а затем инфицируют вирусом (или WT или лекарственной устойчивостью). После 48 ч инкубации активность люциферазы измеряют.

le1.jpg "ширина =" 300 "/>
Таблица 1. Наркотиками Скрининг серийного разведения Prototype. Более жесткими скрининга включает 11 серийных разведений, которые обычно начинаются в 10 мкМ и заканчиваются на 0,0005 мкМ. Серийные разведения готовятся 10x; Есть 100 мкл клеток и 100 мкл вируса в каждой лунке). В этом объеме и в соответствии этих расчетов, серийные разведения будет достаточно для 3 рядов целой 96-луночного планшета. На цитотоксичность готовятся аналогично; однако серийные разведения 11 начинаются от 250 мкм и заканчиваются в 0,05 мкм. Только 11 мкл разведений в лунки добавляют в пластине, которые содержат 100 мкл клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 2. Люциферазы сигнала считывания данных и определение процента ингибирования активности люциферазы. Таблица данных показывает типичный набор люциферазных данных для успешного соединения. В таблице также показаны дополнительные расчеты, необходимые для определения процента ингибирования активности люциферазы и CC ₅₀ и IC ₅₀ значений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 3. Линейная регрессия Анализ данных таблицы. Часть. Графические диапазон концентраций, используемый по отношению к процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph будет производить соответствующие кривые ингибирования. Часть B, Кривые ингибирования определены три параметрическихсигмоидальная функция и нужным в данных по линейной регрессии анализирует ^18. Эта таблица данные затем используются в сочетании с Microsoft Excel для расчета концентрации наркотиков, необходимые для подавления интеграции вируса и клеточной цитотоксичности на 50%, например, IC ₅₀ и СС _50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Опишем быстрый, эффективный и воспроизводимый анализ, который может быть использован для скрининга соединений на цитотоксичность и для их способности ингибировать репликацию как WT и прочной ВИЧ-1 препарата. Способность быстро идентификации соединений и проверить их эффективность и цитотоксичность имеет решающее значение в развитии новых и улучшенных препаратов против ВИЧ-1. После соединения свинца идентифицированы, аналоги соединения свинца могут быть изготовлены и испытаны с использованием того же анализа. Анализ является относительно простым. Есть как положительные, так и отрицательные элементы управления, которые позволяют пользователю диагностировать наиболее распространенные проблемы (токсических соединений, проблемы с вектором складе). Использование трех экземплярах множества скважин без добавления соединения показывает, что вирусная инфекция произошла. Тот факт, что цитотоксичность измеряется в качестве независимого анализа избегает неправильной интерпретации снижение люциферазы, вызванного цитотоксичности в качестве специфического эффекта на вирусную репликацию.

Критические шагив протоколе готовят пластины таким образом, что клетки равномерно распределены в лунках, что скважины иметь соответствующие концентраций тестируемых соединений, добавляя такое же количество вируса в каждой из лунок, и измерения активности люциферазы в определить CC ₅₀ и IC ₅₀ значения.

Анализ является безопасным, количественный, и воспроизводимым. Анализ безопасно, потому что вектор является репликация неисправен. Анализ количественный и воспроизводимым, поскольку она основана на одном круглого вектора, который экспрессирует люциферазы, который может быть оценена точно и удобно. В нескольких круглого анализа в репликации вируса, измеренная ИК ₅₀ зависит от количества вирусных жизненных циклов; это особая проблема, когда анализы включают в себя как WT и лекарственной устойчивостью вирусов, которые могут иметь значительно различные возможности репликации.

Там было несколько ферментативные анализы сообщалось ранее, что можетбыть использованы для выявления ингибиторов в. Анализы, которые включают в реальном времени технологию PCR для измерения интегрированную ДНК требуют очищенные рекомбинантные белки (ы), и, в общем, и более трудоемким и дорогим ^{36, 37.} Хотя можно использовать ферментативные анализы для измерения воздействия соединений на других вирусных ферментов (RT и протеазы), каждый фермент требует свою собственную систему анализа. Один круглый вектор анализ, как описано, может быть использован, без изменений, для скрининга ингибиторов обратной транскриптазы. Аналогичный анализ может быть использован для скрининга ингибиторов протеазы; Однако в ингибитора протеазы анализе соединения должны быть добавлены к клеткам, используемых для получения векторов. Связанных анализ, используя различные клетки и векторы, также могут быть использованы для выявления конверте (ENV) и ингибиторов запись слияния ВИЧ. Наконец, анализ может быть использован, в увеличенном масштабе, с роботизированные распылителей. Таким образом, анализ может быть использован для скрининга больших библиотек соединений против дикого типа и мutant ВИЧ. Однако тот факт, анализ может обнаружить ингибитор репликации ВИЧ, который действует на разных стадиях вирусных точек жизненного цикла до ограничения в интерпретации данных. Сам по себе анализ не определяет, какой этап в жизненном цикле заблокирован соединения. Если возникает вопрос, она может быть решена с помощью время добавления анализов ^38, и путем проверки соединение от очищенных рекомбинантных вирусных белков.

К сожалению, несмотря на успех анти лекарств против ВИЧ, есть еще проблемы и с сопротивлением и токсичности. В отсутствие эффективного противотанкового вакцины против ВИЧ, существует необходимость не только для разработки новых терапевтических препаратов, которые будут эффективны против существующих устойчивых мутантов наркотиков, но и для развития профилактических препаратов, которые могут уменьшить распространение вируса. Если профилактическое применение анти лекарств против ВИЧ incudes лечение неинфицированных людей, этот подход будет уделять особое бремя на разработке препаратов, которые имеют лIttle или нет долгосрочный токсичность.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMSO	Sigma	D2650
DMEM	Corning Cellgro	10-017
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System	Perkin Elmer	6016941
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6016751
Dulbecco's PBS	Gibco-Life Technologies-Invitrogen	14190-136
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices
KaleidaGraph	Synergy Software
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate	Thomas Scientific	12-566-26
Eppendorf Thermomixer Compact	Sigma Aldrich	T1442-1EA
Turbo DNase	Ambion-Life Technologies-Invitrogen	AM2238
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM	Millipore	SLAHA033SS
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit	Perkin Elmer	NEK050B001KT
HOS cells	ATCC	CRL-1543
TZM-bl cells	NIH AIDS Reagent Program	8129
pNL4.3ΔEnv.LUC	NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
VSV-G	NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab
SoftMax Pro	Molecular Devices	0200-310