Heterotopic הרירי Engrafting נוהל העברת תרופות ישיר למוח בעכברים

Summary

מודל עכבר של שיקום בסיס גולגולת אנדוסקופית האנושי פותח שיוצר ממשק semipermeable בין המוח והאף באמצעות שתלי רירית האף. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מסירה למערכת העצבים המרכזית של הרפוי משקל מולקולרי גבוהה שאינם נכללים אחרת על ידי מחסום דם המוח, כאשר באופן מערכתי.

Abstract

משלוח של תרופות לתוך המוח היא הקשתה על ידי הנוכחות של מחסום דם המוח (BBB) ​​המגביל את המעבר של תרכובות במשקל מולקולריות קוטביות וגבוהות ממחזור הדם ולתוך רקמת המוח. הצלחה מסוימת משלוח ישירה בבני האדם הושגה באמצעות השתלה של צנתרים transcranial; עם זאת שיטה זו היא פולשני מאוד וקשור לסיבוכים רבים. אלטרנטיבה פחות פולשנית תהיה מינון המוח דרך קרום מושתל בניתוח, semipermeable כגון רירית האף המשמש לתיקון פגמים בסיס גולגולת לאחר ניתוח אנדוסקופי transnasal גידול ההסרה בבני אדם. העברת תרופות אם כי קרום זה הייתי בצורה יעילה לעקוף את BBB ולפזר ישירות לתוך המוח ונוזל השדרה. בהשראת גישה זו, גישה ניתוחית בעכברים פותחה המשתמשת בקרום הרירי במחיצה בין תורם engrafted על פגם BBB כירורגית extracranial. מודל זה הוכח ביעילותלאפשר המעבר של תרכובות במשקל מולקולריות גבוהות לתוך המוח. מאז לתרופות רבות אינן מסוגלות לחצות את BBB, מודל זה הוא בעל ערך לביצוע בדיקה קליני של טיפולים חדשניים למחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.

Introduction

הטיפול במחל נוירולוגיות ופסיכיאטריות מתעכבת קשות על ידי הנוכחות של מחסום דם המוח (BBB) ​​המונע על 95% מכלל סוכני התרופות הפוטנציאליים מלהגיע למערכת העצבים המרכזית ^1-3. לדוגמא, גליה נגזר neurotrophic פקטור (GDNF) הוכח כיעיל בטיפול במחלת פרקינסון כאשר הוא מוזרק ישירות לתוך המוח, עם זאת הוא לא יעיל כאשר נמסרו מערכתי, כי זה לא יכול לחדור ^4-6 BBB.

רב פנו פותחו כדי לנסות לעקוף את הבעיה הזו. שיפור במשלוח מערכתי של neurotheraputics הודגם באמצעות conjugates תרופה המכיל נוגדנים סלקטיבית לחלבוני תחבורה ממוקמים על האנדותל נימים במוח; עם זאת שיטה זו לא הוכח כישימה למגוון רחב של תרופות ^7,8. בנוסף, פתיחה האוסמוטי של BBB נעשתה שימוש במרפאתברית, אולם בשיטה זו סובלת ממינון תרופה מערכתי בניגוד למשלוח ישיר יותר לאזור במוח של עניין ^9. מאמץ ניכר כבר הכניס לתוך ייעול משלוח transnasal בתקווה ישירות מיקוד המוח ^10-12. למרות הצלחה מסוימת הושגה, תוצאות חד משמעיות שרק התקבלו לתרופות שיש להם קולטנים אנדוגני, כגון ^13,14 אינסולין. יתר על כן המנגנון של משלוח transnasal היה שנוי במחלוקת עם ראיות המצביעות על כניסה עקיפה אל המוח דרך עצב ספיגת ריח או באמצעות ¹¹ זרם הדם. משלוח ישיר, transcranial באמצעות צנתרים מושתלים הושג, עם זאת הליך זה הוא פולשני מאוד וקשור עם מספר רב של סיבוכי ^15,16. נכון להיום, לא קיימת שיטה כללית, פולשנית כדי לספק תרכובות במשקל מולקולריות גבוהות לתוך המוח.

המוצג כאן הוא הליך כירורגי עכברישיוצר ממשק semipermeable עם המוח. המטרה זו מושגת על ידי engrafting explant קרום הרירי ¹⁷ על פגם craniotomy כירורגית בעכבר. באמצעות הליך זה זה כבר הראה כי תרכובות מסיסים עד 500 kDa יכולות להיות מועברות למערכת העצבים המרכזית (ישירות לתוך parenchyma המוח, כמו גם לנוזל השדרה) בשני זמן ואופנה תלויה במשקל מולקולרי ^18. שיטה זו של עקיפת BBB היא מודל לתיקוני פגם בסיס גולגולת בבני אדם אשר עושה שימוש בשתלים ברירית vascularized כדי לתקן חורים בגולגולת בעקבות ניתוח אנדוסקופי transnasal ^19,20.

Protocol

לפני הניתוח לוודא שכל הנהלים להיעשות מאושרים על ידי IACUC וכל רשויות אתיות או משפטיות נוספות ולהשתמש בשיטות טיפול בבעלי החיים אנושיות. זה כולל שימוש בתנאים סטריליים ניתוח, הרדמת העכבר באמצעות IACUC אישר שיטה, סיכה עיני עכברים עם משחה וטרינר במהלך ניתוח, ומתן טיפול לאחר ניתוח. לא להמשיך עם ניתוח אם יש כל שאלה אם היבטים של הליך אישורם. כל ההליכים שבוצעו במסמך זה אושרו על ידי ועדת אוניברסיטה מוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבוסטון.

1. הכנת בעלי חיים וציוד כירורגי

1. החיטוי כל כלי הניתוח שישמשו במהלך הניתוח.
2. ודא שכל הטכניקות שאינן להתבצע מאושרות על ידי הרשויות רגולטוריות בבעלי החיים.

2. קציר של השתל הרירי

1. בחר עכבר זהה מבחינה גנטית בגיל דומה כמוהעכבר הניסיוני ולהרדים אותו בשיטה שאושרה IACUC (כאן: מחנק isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם).
2. בעזרת מספריים כירורגית, להסיר את העור מסביב לאזור האף של ראש העכבר לחשוף את הגולגולת.
3. עם מקדחה, סימן פנאומטי עם שלוש שורות שניים מהם רוחבי לאגף את אזור האף ושלישי בקו אחד עם העיניים שמחברות את שני הקווים בניצב.
4. להסתעף ventrally כדי להפריד את מחיצת האף מהרקמות שמסביב. נתיב רחב יותר יהיה למנוע נזק להממברנה הרירית עם זאת זה יהיה גם להפוך אותו ליותר קשה לבודד את הממברנה. חתך צר יותר קרוב לקו האמצע מומלץ.
5. השתמש במספריים כדי לחתוך את המחיצה חופשית מכל רקמה דבקה בו ולאחסן אותו בתמיסת מלח סטרילית. בשלב זה את השתל ניתן לנקות להסיר את כל רקמה מחוברת. המצב האידיאלי הוא שיש קרומים הריריים ניזוק חשוף משני צידי מחיצת הסחוס. גרם אחדומאחור יכול לספק קרום לשני עכברים סיפקו את שטח הפנים של הקרום הוא מספיק כדי לכסות את אתרי פתיחת הגולגולת. מומלץ שהשתל משמש במהירות אפשרית והחוקר ממשיך לשלב 3 ברגע שהשתל הוא מבודד.

3. השתלה כירורגית של שתל הרירי

1. באמצעות נהלים סטנדרטיים, אספטיים עכבריים ניתוחיים, להרדים והר עכבר במסגרת stereological. השתמש isoflurane כ -2% בחמצן טהור באמצעות מכונה הרדמה מכרסם.
2. לשתק את העכבר במנגנון stereotaxic עם ברים אוזן ומחזיק את האף. החל המשחה עיניים לעיניים ולשפשף את הקרקפת עם בטאדין ו75% אתנול לשלושה סיבובים. או באמצעות מספריים או גוזם שיער, להסיר את הפרווה על הראש. לחשוף את הגולגולת עם סכין גילוח ואת רמת הראש. לבצע פתיחת גולגולת מעל המיקום במוח שיהיה במינון. לדוגמא, כאשר מיקוד הסטריאטום לחתוך 1.25 מ"מחור עגול בקוטר בגולגולת (מרוכזת ב AP: 1.00 מ"מ; ML: 0.88 מ"מ) באמצעות פטיש אוויר. להרטיב את האזור שנקדח עם מי מלח סטריליים ולהשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את הגולגולת.
3. מוציא בזהירות את הדורה באמצעות קצה מחט. בנוסף, זה יכול להתבצע על ידי מריחת כמות מינימאלית של דבק רקמות אל פני השטח dural הלח. ברגע ששכבה זו יש קשוח, תנועה לרוחב עם קצה סכין גילוח יכולה לשמש כדי להסיר את הקרום.
4. מניחים את הקרום הרירי מעל פני המוח דואגים קיצוני כדי לשמור בצד אפיתל מול מן הפצע. זה נעשה הכי טוב על ידי העברת כל המחיצה על פני השטח של הגולגולת הסמוכה לאתר craniotomy עם פינצטה. באמצעות הקצה של זוג מספריים כירורגיות, למשוך את הקרום משל הסחוס ועל גבי משטח הגולגולת והמוח. אל תתנו את הקרום להתייבש או לגעת בו עם כל חומר סופג. השתל צריך בנדיבות חופף כל קצוות הגרמיים של של פתיחת הגולגולתITE.
5. מכסה את השתל עם חתיכת nitrile סטרילי. זה פועל על מנת למנוע הידבקות של העור לשתל במהלך ריפוי. Nitrile צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את כל הקרום הרירי. לקצץ קרום מוגזם במידת צורך. הימנע מכל תנועה של nitrile פעם אחת בא במגע עם השתל.
6. סגור את העור עם תפר סטרילי ריצת 5-0 ולתת לעכבר להתאושש במשך 3-7 ימים לפני שתמשיך לשלב הבא. יש להיזהר שלא להפריע את מחסום nitrile או השתל הרירי במהלך סגירת עור.

4. מינהל מינון הפתרון

1. לאחר הבטחת העכבר הרדים במסגרת stereotaxic, לחתוך את התפר עם מספריים ולהסיר עודפי עור סביב הגולגולת.
2. הסרת מכשול nitrile ולנקות את פני השטח של הגולגולת. השתמש במטליות מלוחה והכותנה סטרילי כדי לנקות את האזור עד שהשתל נראה לעין. ייתכן שיהיה צורך לחתוך את השתל בסכין גילוח אם גדל גדול יותר מאשר דesired שטח פנים.
3. אם הניסוי יהיה יותר מכמה ימים, זה חכם להשתיל לפחות שני ברגים בגולגולת כדי לחזק את שתל הראש.
4. הנח את הרבה מעל השתל, כך שהקצוות נמצאים בקשר עם הגולגולת. החל דבק cyanoacrylate בצומת שבין טוב והגולגולת. מלא היטב עם תמיסת מלח סטרילית ולבדוק כדי לוודא שאין נזילות. ולס עשויים ממחטי מזרק לחתוך.
5. החל מלט עצם בגולגולת כדי לאבטח היטב במקום.
6. הסר מלוח מהבאר עם טפטפת. לשטוף היטב כמה פעמים כדי לאמת את הדבק שלא דלף פנימה מוסיף את הפתרון הרצוי; במקרה זה 50 μl של dextran הניאון משמש. צפוי כי תרכובות מסיסים במים של קוטביות דומה תתנהג כמו dextran. משלוח של תרכובות או השעיות הידרופובי לא נחקר בשיטה זו.
7. מכסה את החלק העליון של כן באמצעות פיסה עגולה של nitrile מאובטחתהעליון באמצעות דבק cyanoacrylate. ודא שהדבק אינו בא במגע עם התוכן טוב.

5. ניתוח של משלוח transmucosal

1. לאחר את הכמות הרצויה של זמן עבר, להרדים את העכבר ולהחליף את התוכן גם עם תמיסה של הצבע הכחול של אוון. צבע זה משמש כדי לוודא שהשתל היה שלם.
2. לאחר 30 דקות, להרדים את העכבר בכבדות, להסיר את פתרון הצבע, ולהרדים באמצעות עריפת הראש.
3. הסרה ידנית של השתל ולהסיר את המוח באמצעות מספריים כירורגיות. הקפד לשמור את השתל במקום.
4. לאחר הוצאתו, פלאש להקפיא את המוח בתמיסה של בוטן מקורר באמבט קרח יבש.
5. שבץ המוח בטמפרטורה אופטימלית חיתוך פתרון (אוקטובר) ופרוסה ב50 מיקרומטר.
6. מניחים את הפרוסות הרצויות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ.
7. תמונה הפרוסה באמצעות מיקרוסקופ בתפרחת בהקדם פתרון אוקטובר התייבש.

תוצאות

קבלת explant מחיצה גדולה מספיק באף חיונית לשלבים הבאים. ניתן להשיג זאת על ידי קידוח במיקום על הגולגולת של עכבר התורם שמוצגת באיור 1 א. חיתוך בדרך זו יפיק explant של מספיק הגודל כפי שמוצג באיור 1b. אם עומק הקידוח הוא לא עמוק מספיק, השתל יהיה קטוע וזה יהיה קשה לה...

Discussion

הצעד הקשה ביותר של ההליך המתואר במסמך זה הוא ההעברה המוצלחת של קרום הרירי בגודל מתאים על גבי משטח המוח. צעד זה נעשה קל יותר באופן משמעותי, אם מחיצת האף שנקטפו היא גדולה מספיק וניקה היטב. אם החלק הגחוני של מחיצת האף נחתך, יש לקבל שתל חדש. זווית הקידוח צריכה להיות בניצב לר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice