Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi

Riepilogo

Un modello murino di ricostruzione base cranica endoscopica umana sviluppato che crea un'interfaccia semipermeabile tra il cervello e il naso utilizzando innesti mucose nasali. Questo metodo permette ai ricercatori di studiare consegna al sistema nervoso centrale di alto peso molecolare terapeutica che altrimenti esclusi dalla barriera emato-encefalica, se somministrati per via sistemica.

Abstract

Consegna di terapeutica nel cervello è ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che limita il passaggio di composti polari e ad alto peso molecolare dal flusso sanguigno e nel tessuto cerebrale. Alcuni successi consegna diretta negli esseri umani è stato raggiunto tramite l'impianto di cateteri transcraniali; Tuttavia questo metodo è altamente invasiva e associati con numerose complicazioni. Un'alternativa meno invasiva sarebbe dosare il cervello attraverso una impiantato chirurgicamente, membrana semipermeabile come la mucosa nasale che viene utilizzato per riparare difetti base cranica seguente endoscopica transnasale rimozione chirurgica del tumore nell'uomo. Trasferimento Drug se questa membrana potrebbe effettivamente bypassare la BBB e diffondere direttamente nel cervello e nel liquido cerebrospinale. Ispirato da questo approccio, un approccio chirurgico nei topi è stata sviluppata che utilizza una membrana mucosa del setto donatore innestato su un difetto extracranica BBB chirurgico. Questo modello è stato dimostrato efficaceconsentire il passaggio di composti ad alto peso molecolare nel cervello. Dal momento che numerosi farmaci candidati sono in grado di attraversare la BBB, questo modello è utile per l'esecuzione di sperimentazione preclinica di nuove terapie per le malattie neurologiche e psichiatriche.

Introduzione

Il trattamento della malattia neurologica e psichiatrica è fortemente ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che impedisce oltre il 95% di tutti i potenziali agenti farmaceutici di raggiungere il sistema nervoso centrale ^1-3. Ad esempio, derivazione gliale fattore neurotrofico (GDNF) ha dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia di Parkinson quando iniettato direttamente nel cervello, tuttavia è inefficace quando consegnato sistemica perché non può penetrare la BBB ^4-6.

Numerosi avvicinato sono stati sviluppati per cercare di aggirare questo problema. Miglioramento della consegna sistematica di neurotheraputics è stata dimostrata utilizzando coniugati contenenti anticorpi selettivi per le proteine ​​di trasporto localizzate sull'endotelio capillare cervello; tuttavia questo metodo non ha dimostrato di essere applicabile per una vasta gamma di farmaci ^7,8. Inoltre, l'apertura osmotica della BBB è stato usato clinicaalleato, tuttavia questo metodo soffre di dosaggio di farmaci sistemici rispetto a una consegna più diretto alla regione del cervello di interesse ^9. Notevole sforzo è stato messo in ottimizzazione consegna transnasale nella speranza di mira direttamente il cervello ^10-12. Sebbene un certo successo è stato raggiunto, risultati conclusivi sono stati ottenuti solo per farmaci che posseggono recettori endogeni, come l'insulina ^13,14. Inoltre il meccanismo di consegna transnasale è stato controverso con prove che suggeriscono ingresso indiretto nel cervello attraverso olfattivo neurone assorbimento o attraverso il flusso sanguigno ^11. , Consegna transcranica diretta utilizzando cateteri impiantabili è stato raggiunto, tuttavia questa procedura è altamente invasiva e associata a numerose complicanze ^15,16. Ad oggi, non esiste un metodo generale, minimamente invasivo per fornire composti ad alto peso molecolare nel cervello.

Qui presentata è una procedura chirurgica murinoche crea un'interfaccia semipermeabile con il cervello. Questo si ottiene innestando un espianto membrana mucosa ¹⁷ su un difetto craniotomia chirurgica in un topo. Utilizzando questa procedura è stato dimostrato che i composti solubili fino a 500 kDa possono essere trasportati nel sistema nervoso centrale (direttamente nel parenchima cerebrale e nel liquido cerebrospinale) sia un tempo e peso molecolare di modo dipendente ^18. Questo metodo di aggirare la BBB è un modello per la riparazione dei difetti di base del cranio negli esseri umani che utilizza innesti di mucosa vascolarizzati per riparare buchi nel cranio dopo la chirurgia endoscopica transnasale ^19,20.

Protocollo

Prima dell'intervento assicurarsi tutte le procedure da fare sono approvati dalla IACUC e qualsiasi autorità etiche o giuridiche addizionali e utilizzare crudeli pratiche di trattamento degli animali. Questo include l'utilizzo di condizioni di chirurgia sterili, anestetizzare il mouse utilizzando IACUC metodo approvato, lubrificanti occhi topi con vet unguento durante l'intervento chirurgico, e fornire assistenza post-chirurgica. Non procedere con la chirurgia se c'è qualche problema se aspetti della procedura sono approvati. Tutte le procedure eseguite nel presente documento sono state approvate dalla Università Institutional Animal Care ed uso comitato di Boston.

1. Preparazione degli animali e Forniture chirurgici

1. Autoclavare tutto strumento chirurgico che verrà utilizzato durante l'intervento chirurgico.
2. Assicurarsi che tutte le tecniche che devono essere eseguite sono approvati dalle agenzie di regolamentazione degli animali.

2. Raccolta della mucosa Graft

1. Ha scelto un topo geneticamente identico di età simile comeil mouse sperimentale e eutanasia in un metodo approvato IACUC (qui: asfissia isoflurane seguita da dislocazione cervicale).
2. Utilizzando forbici chirurgiche, togliere la pelle intorno alla regione nasale della testa del mouse esporre il cranio.
3. Con un martello pneumatico, volume con tre linee di cui due laterali fiancheggiano la regione nasale e un terzo in linea con gli occhi che collega le due linee perpendicolarmente.
4. Drill-down ventralmente al fine di separare il setto nasale dal tessuto circostante. Un percorso più ampio eviterà danni alla membrana mucosa tuttavia sarà anche rendere più difficile isolare la membrana. Si raccomanda un taglio stretto vicino al linea mediana.
5. Usare le forbici per tagliare il setto libero da qualsiasi tessuto aderito ad essa e conservarla in una soluzione salina sterile. A questo punto l'innesto può essere pulito per rimuovere qualsiasi tessuto collegato. La situazione ideale è avere membrane mucose integre esposti su entrambi i lati del setto cartilagine. Uno grpoppiera può fornire membrana per due topi disponibile la superficie della membrana è sufficiente a coprire i siti craniotomia. Si raccomanda che l'innesto viene utilizzato il più rapidamente possibile e il ricercatore procede alla fase 3 non appena l'innesto è isolato.

3. Impianto chirurgico di innesto mucoso

1. Utilizzo di procedure standard, asettiche murini chirurgici, anestetizzare e montare un topo nella cornice stereologica. Utilizzare circa il 2% isoflurano in ossigeno puro utilizzando una macchina di anestesia roditore.
2. Immobilizzare il mouse in un apparato stereotassico con orecchio bar e un supporto naso. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi e strofinare il cuoio capelluto con Betadine e il 75% di etanolo per tre turni. Utilizzando sia le forbici o un regolatore dei capelli, rimuovere il pelo sulla testa. Esporre il cranio con una lametta e livellare la testa. Eseguire una craniotomia sopra la posizione del cervello che verrà dosato. Per esempio, quando il targeting striato tagliare un 1,25 millimetridiametro del foro circolare nel cranio (centrato a AP: 1,00 mm, ML: 0,88 mm) utilizzando un martello pneumatico. Bagnare la zona forata con soluzione fisiologica sterile e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere il cranio.
3. Rimuovere con cautela la dura con la punta di un ago. Inoltre, questo può essere realizzato applicando una quantità minima di tessuto adesivo alla superficie durale umida. Una volta che questo strato è indurito, il movimento laterale con una punta lametta può essere usato per rimuovere la membrana.
4. Posizionare la membrana mucosa al di sopra della superficie del cervello avendo cura estrema per mantenere il lato epiteliale rivolto lontano dalla ferita. Questo è fatto meglio trasferendo l'intero setto sulla superficie del cranio adiacente al sito craniotomia con le pinzette. Con la punta di un paio di forbici chirurgiche, tirare fuori la membrana della cartilagine e sulla superficie del cranio e cervello. Non lasciate che la membrana asciugare o toccare con qualsiasi materiale assorbente. L'innesto dovrebbe generosamente sovrapporsi tutti i bordi ossee del craniotomia site.
5. Coprire l'innesto con un pezzo sterile di nitrile. Questo agisce per impedire l'adesione della pelle per l'innesto durante la guarigione. Il nitrile deve essere abbastanza grande da coprire l'intera membrana mucosa. Tagliare eccessivo membrana se necessario. Evitare qualsiasi movimento del nitrile una volta entrato in contatto con l'innesto.
6. Chiudere la pelle con un running 5-0 sutura sterile e lasciare il mouse recuperare per 3-7 giorni prima di procedere alla fase successiva. Fare attenzione a non perturbare la barriera nitrile o l'innesto di mucosa durante la chiusura della pelle.

4. Amministrazione di dosaggio Soluzione

1. Dopo aver assicurato il topo anestetizzato nel frame stereotassico, tagliare la sutura con le forbici e togliere la pelle in eccesso intorno al cranio.
2. Rimuovere la barriera nitrile e pulire la superficie del cranio. Usare tamponi salini e cotone sterile per pulire la zona fino a quando l'innesto è visibile. Può essere necessario tagliare l'innesto con un rasoio se ha assunto dimensioni desired superficie.
3. Se l'esperimento sarà più lungo di un paio di giorni, è saggio impiantare almeno due viti cranio a rafforzare l'impianto testa.
4. Posizionare il ben sopra l'innesto in modo che i bordi sono in contatto con il cranio. Applicare l'adesivo cianoacrilato all'incrocio tra il bene e il cranio. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterile e verificare che non vi siano perdite. Wells sono costituiti da aghi di siringa taglio.
5. Applicare cemento osseo sul cranio per fissare il bene in posizione.
6. Rimuovere la soluzione fisiologica dal pozzo con una pipetta. Lavare le ben diverse volte per verificare che l'adesivo non è trapelato trovi Aggiungi la soluzione desiderata; in questo caso viene utilizzato 50 ml di destrano fluorescente. Si prevede che i composti idrosolubili di una polarità simile si comportano come destrano. Consegna di composti idrofobi o sospensione non è stato esplorato con questo metodo.
7. Chiudere la parte superiore del pozzo utilizzando un pezzo circolare di nitrile fissato altop con cianoacrilato. Controllare che l'adesivo non venga a contatto con il contenuto dei pozzetti.

5. Analisi dei Transmucosal consegna

1. Dopo la quantità desiderata di tempo è passato, anestetizzare il mouse e scambiare il contenuto dei pozzetti con una soluzione di colorante blu di Evan. Questo colorante è utilizzato per verificare che l'innesto era intatto.
2. Dopo 30 minuti, anestetizzare il mouse pesantemente, rimuovere la soluzione colorante, e eutanasia mediante decapitazione.
3. Rimuovere manualmente l'impianto e rimuovere il cervello con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a tenere l'innesto in posizione.
4. Una volta rimosso, Flash-congelare il cervello in una soluzione di isobutano raffreddata in un bagno di ghiaccio secco.
5. Incorporare il cervello in Ottimale taglio Temperatura soluzione (OCT) e la fetta a 50 micron.
6. Collocare le fette desiderati direttamente su un vetrino da microscopio.
7. Immagine della sezione utilizzando un microscopio a fluorescenza non appena la soluzione Ottobre è asciugato.

Risultati

Ottenere un grande abbastanza setto nasale espianto è fondamentale per le fasi successive. Questo può essere realizzato mediante foratura nella posizione sul cranio del topo donatore mostrato in Figura 1a. Tagliando lungo questo percorso produrrà un espianto di sufficiente dimensione come mostrato in Figura 1b. Se la profondità non è abbastanza profonda, l'innesto sarà troncata e sarà difficile ottenere una grande membrana sufficiente a coprire la superficie del cervello. Per...

Discussione

Il passo più difficile della procedura qui descritta è la riuscita del trasferimento di una membrana mucosa adeguate dimensioni sulla superficie del cervello. Questo passaggio è notevolmente semplificata se il setto nasale raccolto è abbastanza grande e ben puliti. Se la parte ventrale del setto viene troncato, un nuovo innesto deve essere ottenuta. L'angolo di perforazione deve essere perpendicolare alla testa mouse per assicurare che la membrana mucosa non è danneggiato dal trapano. Se viene preso un percorso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice