הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Summary

פרוטוקול לביטוי כמותית, תפוקה הגבוהה הקרנה וטיהור אנליטי של חלבוני היתוך מתרבויות חיידקי Escherichia בקנה מידה קטנה מתואר ומוחל על הביטוי של מטרות חלבון הארס של בעלי החיים דיסולפיד עשיר.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) הוא מערכת הביטוי הנפוצה ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים למחקרים מבניים ותפקודיים. עם זאת, לטיהור חלבונים היא לפעמים מאתגרת מאז חלבונים רבים באים לידי ביטוי בצורה בלתי מסיס. כאשר עובד עם מטרות קשות או מרובות לכן מומלץ לשימוש תפוקה גבוהה (HTP) הקרנת ביטוי חלבון בקנה מידה קטנה (1-4 מיליליטר תרבויות) כדי לזהות במהירות תנאים לביטוי מסיס. כדי להתמודד עם התוכניות השונות מבניות הגנומיקה של המעבדה, כמוני (בטווח של .1-100 תרבות מ"ג / ליטר של חלבון רקומביננטי) ופרוטוקול הקרנת ביטוי חלבון HTP יושם ומאומתים על אלפי חלבונים. הפרוטוקולים היו אוטומטיים עם השימוש ברובוט טיפול נוזלי אבל יכולים גם להתבצע באופן ידני, ללא ציוד מיוחד.

חלבוני ארס דיסולפיד עשיר צובריםהגדלת הכרה בפוטנציאל שלהם כמוביל תרופה טיפולי. הם יכולים להיות חזקים מאוד סלקטיבית, אבל רשתות אג"ח דיסולפיד המורכבת שלהם להפוך אותם מאתגרות לייצר. כחבר בפרויקט FP7 האירופי Venomics (www.venomics.eu), האתגר שלנו הוא לפתח אסטרטגיות ייצור מוצלחות במטרה לייצר אלפי חלבוני ארס רומן לאפיון פונקציונלי. בעזרת מאפייני חיזור של קשר דיסולפיד isomerase DsbC, התאמנו ייצור צנרת HTP שלנו לביטוי של חמצון, פפטידים ארס תפקודיים בE. ציטופלסמה coli. הפרוטוקולים חלים גם על הייצור של חלבוני דיסולפיד עשיר מגוונים. כאן אנו מדגימים הצינור שלנו מוחל על הייצור של חלבוני ארס בבעלי החיים. עם הפרוטוקולים מתוארים כאן סביר להניח כי יתקבלו חלבוני דיסולפיד עשיר מסיסים קטנים כמו שבוע. אפילו בקנה מידה קטנה, יש את הפוטנציאל להשתמש בהדואר מטוהר חלבונים לאימות מצב החמצון על ידי ספקטרומטריית מסה, לאפיון בלימודי טייס, או למייקרו מבחני רגישים.

Introduction

מונע על ידי הקידום של גנומיקה וקצב מואץ של גילוי של חלבונים חדשים, צינורות תפוקה גבוהים פותחו למקבל גישות מסורתיות להקרנה וזיהוי של אסטרטגיות ייצור חלבון אופטימליות. משתני פוטנציאל להיות מותאמים כוללים, אך לא מוגבלים לביטוי שונה זני ^1,2, הטמפרטורה ^3,4, מדיה ^2,3, יעד גרסאות ⁵ שותפים, היתוך ^6-13, שיתוף ביטוי עם מלווי ^14,15, cytoplasmic או רכיבי ביטוי ^16-18, וחיץ טיהור periplasmic ^3. על ידי יישום גישות תפוקה גבוהות, משתנה רבים או מטרות רבות ניתן לבדוק במקביל עם רמה גבוהה של יעילות, תוך הגבלת וריאציה אצווה כדי אצווה. מניסיוננו, את האסטרטגיה גם נותנת שחזור טוב על סולם למעלה תוך שימוש באותה התרבות (טמפרטורה, תקשורת, אוורור, וכו ') ותנאי טיהור (אותו רזיn, מאגרים, וכו '). פלטפורמות תפוקה גבוהה כמה היו בשימוש בעשור האחרון לזהות תנאים לביטוי חלבון מסיס, כלומר באמצעות פרמטרים שונים כגון שותפי היתוך, זני ביטוי או טמפרטורה ^19-23.

לאחרונה השתמשנו בגישת הקרנת התפוקה הגבוהה שלנו לביטוי של חלבוני דיסולפיד עשיר מסיסים ^11. החלבונים שנבחרו היו לא רק ממקורות ארסיים, אך כללו גם מעכבי אנזים דיסולפיד עשיר ממגוון רחב של מינים, כולל צמחים, חזירים, פרות ובני אדם. הניסוי השווה את ההשפעות של 12 שותפי היתוך שונים ושלושה זני ביטוי שונים על המסיסות והקיפול של חלבוני 28 מרושת דיסולפיד. אנחנו הוכיחו כי באמצעות DsbC כשותף היתוך לייצור בBL21 המתח (DE3) pLysS outproduced בהרבה (בשתי תשואה ומספר החלבונים מסיסים שהושגו) בכל שילוב אחר של מתח והיתוך נבדק ^11.תוצאות של ניסוי זה היווה את הבסיס להתאמת הצינור המקורי שלנו בכלל תפוקה גבוהה (אשר שימש להקרנת הביטוי למגוון רחב של חלבונים) ^22,24 לאחד מתאים יותר לביטוי של מטרות דיסולפיד עשיר. חלבוני דיסולפיד עשיר מהארס של בעלי החיים הם בעלי עניין מיוחד. ארס הוא תערובת מורכבת של פפטידים וחלבונים ביו, עם ערך פוטנציאלי פרמקולוגית וטיפולי. עם זאת, ביטוי של דיסולפיד חלבונים המכיל אג"ח הוא לא טריוויאלי. חלבונים אלה מכילים בדרך כלל בין 6:59 אג"ח דיסולפיד, והוא חייב להיות מחומצן עם דפוסי דיסולפיד-המליטה הנכונות על מנת להיות פעיל. נכון לעכשיו, הפלטפורמה נמצאת בשימוש להקרנת הביטוי של מספר גדול של חלבונים מן החי ארס דיסולפיד עשיר כחלק מFP7 האירופי VENOMICS הפרויקט (www.venomics.eu) והשוואות פרוטוקולים חדשים לביטוי תפוקה הגבוהה של אלפי מטרות . הנה, שיטה אוטומטיתמסופק להקרנת תפוקה גבוהה בקנה מידה קטנה ביטוי וטיהור (ראה איור 1) יחול על דיסולפיד עשיר בחלבוני ארס בבעלי חיים. האסטרטגיה לדיסולפיד פפטידים וחלבונים עשירים מנצלת התג שלו לטיהור ושותף היתוך חיזור פעיל, DsbC, יצירת שילובי HIS-DsbC cleavable לחלבוני היעד (ראה איור 2).

למרות ההתמקדות של הפרוטוקולים במסמך זה אוטומציה באמצעות אלקטרופורזה רובוט וHTP טיפול נוזלית, שיטות אלה הן גם מתאימות לגישה ידנית תפוקה גבוהה, כלומר, גם במעבדות עם התקנה בסיסית יכולות לנצל את הפרוטוקולים ללא תנאי כלשהו לציוד יקר . פרוטוקולים ידניים לשינוי לטיהור וניתוח (לא ספציפי לחלבוני דיסולפיד עשיר) כבר פורסמו במקומות אחרים ²⁴ ולא יחזרו על עצמו כאן. התפוקה של ההליך הידני (משיבוט ביטוי, המיוצרת על ידי recombiשיבוט לאומי ^25, לניתוח של רמות חלבון המסיסים) הוא 96 (באמצעות זיהוי-SDS) או 384 (4 x 96; באמצעות כתם נקודה ו- SDS ²⁶⁾ תרבויות בשבוע (ראה איור 1). זה יכול להיות מוגבר אם מבוצע באופן חצי אוטומטי (באמצעות רובוט טיפול נוזלי וכתם נקודת ²⁶ או אלקטרופורזה HTP, כמו עם מערכת Caliper GXII LabChip ²² לניתוח תוצאות) של עד 1,152 x 12 96) תרבויות (במקביל בשבוע אחד, כפי שתואר במסמך זה. Culturing מתבצע בבאר עמוקה 24 פורמט (DW24), כך שחממות רועדות רגילות יכולות לשמש בניגוד לתרבויות גדלו בבאר עמוקה 96 פורמט (DW96), שמצריך השימוש בחממות מסלולית קצרות רועדות במהירות גבוהה לאוורור מספיק (רועד ב 800 סל"ד). השימוש במדיה אוטומטי אינדוקציה ²⁷ גם מפשט את הביטוי, ומבטל את צעד האינדוקציה הידני. גם כאשר מעבדות כבר להשתמש בביטוי ופורה מוגדרים מראשתנאי fication, אלה יכולים להיות מועברים ישירות למערכת HTP זה פשוט כדי לשפר את היעילות. סכמטית מפורטת של צינור הקרנת תפוקה הגבוה עבור חלבוני דיסולפיד עשיר מסופקת באיור 3. הפרמטרים בצנרת נבחרו מבוססים על ניסויים נרחבים הקרנת ^{11, 22,} אשר אפשרו לנו לבחור את התנאים השימושיים ביותר לייצור חלבון.

אפיון יכול להתבצע על חלבונים מתויגים המטוהרים ישירות מביטויים בקנה מידה קטנה במחקרי פיילוט שבו עשרות מיקרוגרם של מדגם הוא, או למספיק מבחני פונקציונליים רגישים ומבחנים מחייבים (לדוגמא, מערכות מהדק תיקון HTP נפח נמוך ^28). אותו הדבר יכול גם להתבצע על המטרות לא מתויגות לאחר מחשוף, סיפק את התג ופרוטאז יוסרו (למשל, על ידי HPLC שלב ההפוך). בקרת איכות גם יכולה להתבצע על ידי ספקטרומטריית מסה (כדי לאשר את הגודל הצפוי וחמצון stאכלתי) או שיטות chromatographic (כדי לאשר את טוהר או הטרוגניות) ^29. לפעמים לתייג מחשוף הוא מיותר או אפילו לא רצוי (במיוחד לחלבונים מסיסים היטב ^30,31), ולכן במחשוף פרוטוקול זה הוא אופציונלי. בכל מקרה, בכל המבנים יש אתר TEV פרוטאז מחשוף (ENLYFQ / [G] ³²⁾ ישירות קדמו לגן המטרה לייצר חלבון מקורי לאחר המחשוף (ראה איור 2 ודיון). אם מחשוף של תג ההיתוך הוא רצוי, מחשוף, ניתן לבדוק (בשבריר elution או 'בעמודה') בקנה המידה הקטנה לניתוח יעילות, לייעל את התנאים במידת צורך ולקבל אומדנים אמינים של תשואות לניסויים בקנה מידה-up שלאחר מכן.

ישנן שתי אפשרויות לנפח של חרוזים המשמשים במהלך טיהור הזיקה, בהתאם למטרות ולציפיות של הניסוי. כדי להיות מסוגל ללכוד כמה שיותר חלבון ככל האפשר (כדי לטהר למבחני טייס או טרשת נפוצה, או לextrapolאכלתי לתשואות סולם למעלה) יש להשתמש בנפח סופי של μl 200 של שרף, המאפשר זיהוי של חלבון מסיס בטווח של 1-100 תרבות מ"ג / ליטר לפני הרוויה של המערכת (ראה פרוטוקול (א) בסעיף 8.1) . עם זאת, אם המטרה של הניסוי היא זיהוי של כמויות נמוכות של חלבונים מסיסים אז נפח סופי של μl 50 של השרף מתאים, המאפשר זיהוי של חלבון מסיס בטווח של 0.1-25 תרבות מ"ג / ליטר (ראה פרוטוקול (B ) בסעיף 8.2).

ייצור ניתן לשנותם עד, אם נדרש, כדי להשיג כמויות מיליגרם של יעדים מטוהרים למחקרים מבניים ותפקודיים נוספים באמצעות התנאים שזוהו לביטוי מסיס. הפרטים של פרוטוקולי סולם למעלה משמשים בAFMB כבר דנו במקום אחר ^22,24.

פרטים נוספים רלוונטיים להגדרת הניסוי, השלבים קריטיים בפרוטוקול, שינויים ובעיות ירי ומגבלות של הטכניקה מסופקים בדיסקussion. אנא קרא את הדיון לפני תחילת הניסויים.

לאורך הפרוטוקולים אנו מצפים שיעור הצלחה של 90% בכל שלב (לדוגמא, לפחות 90% מהתרבויות חייבים לגדול בכל שלב נתון). אם שיעור ההצלחה של כל צעד בניסוי יורד מתחת 90% הדגימות מבוטלות והניסוי חוזר על עצמו לאוסף המלא של מבנים. עם זאת, שיעור הצלחה זו אינו חל על מספר המבנים המבטאים את החלבונים מסיסים כאו את חלקם של מבנים שדבק ביעילות 100%, כפי שזה יהיה תלוי מאוד בחלבונים שנבדקו.

הפרטים הספציפיים להגדרה של שולחן העבודה הרובוט ניתנים לכל פרוטוקול (ראו גם איור 4), אולם הם יכולים להיות מותאמים כנדרש ללהגדיר קופצים שולחן עבודה חלופית. חומרת הרובוט (טקאן) מורכבת מזרוע 96 רבת ערוצים (MCA96), מניפולטור רובוטית (רומא) וראש טיפול נוזל 8 ערוצים (LiHa). ניתן גם לבצע את כל צעדי ניצול MCA96 באמצעות LiHa אם MCA96 אינו זמין, אך הם ייקחו עוד כי LiHa יצטרך להישטף בין שלבים. בזמן שהרובוט הוא מבחינה טכנית אינו סביבת סטרילית, ההכללה של אנטיביוטיקה בדרך כלל מבטיחה שאין בעיות עם זיהום או עקרות.

Protocol

חלק א ': טרנספורמציה וביטוי מבחן

נהלים במדריך לשיבוט ²² והפיכה לטיהור הם דנו במקום אחר ^24. פרוטוקול השינוי יכול להתבצע באופן מלא על הרובוט ²⁶ אבל זה בדרך כלל זמן רב יותר יעיל לעשות את זה באופן ידני. לכן הפרוטוקולים יתחילו בזאת מהרכבה של precultures הביטוי והציפוי של השינוי מההפיכה בהלם החום מתערבב נעשה באופן ידני. לפרטים נוספים על נהלי שיבוט ושינוי ידניים לראות את אזכור הרלוונטי ^22,24.

1. Precultures וציפוי

1. הכן את שולחן העבודה הרובוט (ראה איור 4 לתפקידים):
   1. שים שוקת 300 מיליליטר מכילה 150 מיליליטר מרק LB סטרילי (בתוספת אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) / Chloramphenicol (34 מיקרוגרם / מיליליטר), או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת) במיקום 8.
   2. שים DW סטרילי96 בעמדה 11. שימו 24 גם אגר LB מוכן מראש 4x צלחות (Amp / CAM) בתרבית רקמה (המכיל 2 אגר מיליליטר בכל טוב) עם המכסים שלהם על בעמדות 14-17.
   3. שים את צלחת השינוי (המכילה את השינוי 96 מתערבב לאחר heatshock) במיקום 13. זה ישמש לחסן precultures הנוזלי וצלחות אגר LB. שים את קופסא הטיפים פיפטה μl 200 סטרילי בעמדה 18.
2. באמצעות זרוע 96 רבת ערוצים (MCA96) ו200 הטיפים μl, לשאוב 200 μl של מרק LB (מיקום 8), ולוותר לDW96 בעמדה 11. חזור על פעולה עד שיש נפח סופי של 1 מיליליטר מרק LB בכל טוב של DW96. זה יהפוך preculture הנוזלי.
3. באמצעות מניפולטור רובוטית (רומא), להסיר את המכסה של הצלחת אגר LB 24 גם הראשונה ולמקם אותו במקום אחר (למשל במנשא מלון) עד לציפוי הוא סיים לצלחת ש.
4. שימוש בנוזל 8 ערוצי טיפול בראש (LiHa), לערבב ואז לשאוב 50 μl של tהעמודה הראשונה הוא תמהיל שינוי בעמדה 13. כרך זה של תערובת שינוי הוא פשוט מספיק כדי לכסות את LB-אגר כן.
5. עם 4 הערוצים הראשונים, לוותר על הטור הראשון של הצלחת אגר LB הראשון 24 גם בעמדה 14 (כפי שמוצג באיור 5).
6. עם 4 ערוצים שעבר, לוותר על הטור השני של הצלחת אגר LB 24 גם הראשונה.
7. לשטוף את כל הטיפים ביסודיות לאחר שספק.
8. המשך בתהליך זה עד שכל השינויים היו מצופים על הצלחת הראשונה בעמדה 14, העברה מ96 - ל24 גם באמצעות ערכה הניתנת באיור 5.
9. ברגע את הצלחת הראשונה הושלמה, השתמש ברומא כדי להחליף את המכסה ולהסיר את המכסה מן הצלחת הבאה בעמדה 15. להמשיך להשתמש בערכת ציפוי ל3 הצלחות הבאות.
10. ברגע שהציפוי הוא סיים, להגדיר את Te-Shake ל1,200 סל"ד ולנער את כל צלחות דקות 1 יש חלוקה הומוגנית של תמהיל טרנספורמציה.
11. שימוש MCA96 וטיפי פיפטה המקוריים, לערבב ואז לשאוב 60 μl של התמהיל שנותר שינוי (עמדת 13) ולוותר לDW96 מכיל מרק LB בעמדה 11.
12. לאטום precultures DW96 עם סרט דבק לנשימה כדי לאפשר אוורור התרבות.
13. מקום בחממה 37 C ° רועד במהירות מרבי O / N (200/800 סל"ד בהתאם ייקר מסלולית).
14. הצלחות אגר LB צריכה להיות ממוקמות במנדף עם המכסים שלהם כבויות עד יבש (10 דקות). ואז הם ממוקמים הפוכים בחממה צלחת 37 מעלות צלזיוס עד לבוקר שלמחרת.
15. למחרת, preculture משמש לחסן ביטוי המבחן במדיום אוטומטי אינדוקציה ולהכנה של מניות גליצרול. שים את הצלחות אגר במקרר, כגיבוי. אם יש צורך, החל מהצלחות אגר או מניות גליצרול, ביטוי המבחן יכול להיות מחדש על ידי inoculating preculture LB טרי ישירות.

2. הכנת DW24 ZYP-5052 צלחות

הערה: הליך זה לוקח כ 5 דקות כדי להשלים עבור כל קבוצה של צלחות 4x DW24.

1. איפור 500 מיליליטר בינוני אוטומטי אינדוקציה ZYP-5052 עבור כל לשכפל 96 תרבויות (בינוני 464 מיליליטר ZY, 250 μl 2 M MgSO _4, 10 מיליליטר 50x 5052, NPS 20x 25 מיליליטר, על מנת ש-- המתכונים לכל רכיב הם בטבלה 1) בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.
2. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
   1. שים שני 300 מיליליטר שקתות, ובכל אחד ~ 250 בינוני מיליליטר בעמדה 5 ו -6. שימו ארבע צלחות DW24 סטרילי בעמדות 14-17. שים 200 טיפים μl בעמדה 18.
3. שימוש MCA96 ו200 טיפים μl, לשאוב 200 μl של ZYP-5052 מעמדה 5 ולוותר לתוך צלחת DW24 הראשונה בעמדה 14. האם זה בסך הכל 5 פעמים (4 טיפים יהיה לוותר לתוך באר אחד בפעם אחת עבור סכום כולל של 4 מיליליטר). חזור על פעולה עבור 3 צלחות DW24 x שנותרו בעמדות 15-17, switצ'ינג לZYP-5052 בעמדה 6 לשתי DW24 הצלחות עברו.

3. הרכבת חיסון וצמיחה של תרבויות ביטוי המבחן

הערה: הרכבת חיסון לוקחת כ 10 דקות כדי להשלים עבור כל קבוצה של צלחות 4x DW24, וצמיחה ממשיכה O / נ

1. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
   1. שים את צלחת DW96 מכילה precultures (משלב 1.15) במיקום 11. שים ארבע DW24 צלחות המכילות בינוני ZYP-5052 (משלב 2.3) בעמדות 14-17.
2. שימוש לשאוב LiHa של preculture 100 μl מתפקיד 11 לחסן תרבויות ביטוי מבחן (1/40 דילול) באמצעות ערכה הניתנת באיור 5. לשטוף את ראש LiHa יסודיות בתחנת השטיפה בין כל עמודה של precultures 96 היטב.
3. לאטום את צלחות DW24 עם סרט לנשימה ולדגור על 37 ° C עם רעד (200/400 סל"ד) למשך 4 שעות. זה הזמן של שלב הצמיחה שבמהלכו glucosדואר מבינוני מעדיף להיות מדולדל ^27.
4. מנמיך את הטמפרטורה ל 17 ° C. אחרי שעה 4 ודלדול של גלוקוז, לקטוז יתחיל להיות חילוף חומרים, מה שמוביל לאינדוקציה של ביטוי, מתן תנאי גידול האופטימלי לBL21 (DE3) pLysS או רוזטה 2 (DE3) pLysS, בעבודה זו ^22. השאר את התאים לבטא O / נ השתמש preculture שנותר כדי להפוך את מניות גליצרול.

4. הכנת מניות גליצרול

הערה: מניות גליצרול צריכים להיעשות בtriplicates להיות מאוחסנים במקומות שונים במקרה של תקלה במקפיא.

1. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
   1. שים צלחות microtiter בעמדה 5 עד 7 כדי לשכן את מניות גליצרול. שים שוקת מיליליטר 300 מלאות 50 מיליליטר של גליצרול 100% בעמדה 8. שים DW96 מכיל 800 μl של preculture (לאחר שלב 3.2) היטב כל אחד בעמדה 11. שים 200 טיפים μl בעמדת 18.
2. שימוש slo מהירות שאיפה וניפוק w, השתמש MCA96 ו200 טיפים μl להוסיף גליצרול לDW96 מכיל precultures.
   1. לשאוב 200 μl של גליצרול (מתפקיד 8).
   2. לוותר 150 μl (בעמדה 11) ראשון, ואז לעצור ל20 שניות כדי לאפשר גליצרול שנותר כדי להגיע לחלק התחתון של הקצה. לוותר 50 μl הנותר.
3. שימוש באותה הטיפים, לערבב התרבות וגליצרול בDW96 בעמדה 11 עד שהם מעורבים באופן יסודי. הריכוז הסופי של גליצרול הוא 20%. לשאוב 140 μl מDW96 ולוותר לצלחת microtiter הראשונה בעמדה 5.
4. חזור על שלב 4.3 לכל צלחת שנותרה microtiter (עמדות 6 ו -7).
5. לאטום כל צלחת microtiter עם דבק פלסטיק ולאחסן ב -80 ° C. מחק את התרבות שנותרה בDW96, decontaminating עם סוכן מיקרוביאלית לפני הסילוק.

5. הערכת הצמיחה של התרבויות

ילדה = "jove_content"> הערה: זה בדרך כלל אין צורך להעריך את שיעור הצמיחה הסופי כOD הסופי ₆₀₀ היא בדרך כלל זהה עבור רוב התרבויות (סביב 12 בתנאים אלה), עם זאת כל תרבויות שלא גדלות יש לציין.

1. קח 50 μl של כל תרבות (משלב 3.4) ולוותר לתוך צלחת עם תחתית שטוחה, ברורה microtiter מכילה 150 μl של מדיום.
2. מדוד את OD _600, תוך לקיחה בחשבון את הדילול פי 4. אם יש שלא גדלו יפה מאוד, שים לב זה לסופו.

6. קציר התאים

הערה: הליך זה לוקח כ 45 דקות כדי להשלים.

1. צנטריפוגה צלחות 4x DW24 (משלב 3.4) ב3,000 XG עבור 10 דקות לאחר מכן לבטל את supernatant לתוך מיכל פסולת המכיל סוכן מיקרוביאלית. הקש על הצלחות, הפוך, על גבי נייר סופג כדי להסיר כל מדיום עודף.
2. בינתיים, להכין לתמס 100 מיליליטרחיץ (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH 10 מ"מ imidazole 8, או חיץ מועדף אחר) המכיל ליזוזים (ריכוז סופי 0.25 מ"ג / מיליליטר).
3. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
   1. שים את מאגר תמוגה בשוקת מיליליטר 300 בעמדה 5. שים DW96 נקי במיקום 11. שים 4 צלחות x DW24 המכילות את כדורי התא (משלב 6.1) בתפקידי 14-17. שים 200 טיפים μl בעמדת 18.
4. שימוש MCA96 ו200 טיפים μl, לשאוב 125 μl של חיץ תמוגה מעמדה 5 ולוותר לכל צלחת DW24 (עמדות 14-17). חזור על פעולה. הערה: 4 טיפים יהיו לוותר לתוך באר אחד בפעם אחת עבור נפח סופי של 1 מיליליטר בכל טוב של צלחות DW24.
5. נער את הצלחות בעמדות 14-17 באמצעות טה-Shake (1,000 סל"ד) במשך 15 דקות לresuspend את כדורים.
6. ברגע שהכדורים הם resuspended, השתמש ב4 הערוצים הראשונים של LiHa לשאוב 550 μl מדגימות 1 עד 4 (העמודה הראשונה של DW24 הראשון, בעמדת 14), ולאחר מכן באמצעות l4 ערוצי AST של לשאוב LiHa 550 μl של דגימות 5 עד 8 (העמודה השנייה של DW24 הראשון). לוותר לשורה הראשונה של DW96 בעמדת 11.
7. חזור על שלב 6.6, כך שכל ההשעיה התא מועבר לDW96.
8. אחרי כל סט של דגימות לשטוף את הטיפים LiHa בתחנת השטיפה.
9. חזור על שלבים 6.6-6.8 עבור כל עמודה בכל צלחת DW24 (עמדות 15-17) באמצעות ערכה הניתנת באיור 5. חותם עם סרט פלסטיק.
10. לניקוי באותו היום או הקפאה לטווח קצר, בחנות ב-80 ° C למינימום של 1 שעות, לאחסן בדרך אחרת ב -20 ° C.

חלק ב ': טיהור וניתוח

7. הנייד תמוגה

הערה: הליך זה לוקח בערך 60 דקות כדי להשלים.

1. להפשיר את ההשעיות קפואות תא (משלב 6.10) באמבט מים (ב RT או 37 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות ו resuspend בחממה הרועדת עבורdditional 10 דקות. התרבויות צריכה להיות צמיגות.
2. קח 500 μl של מניית DNase ולערבב אותו עם 1 מיליליטר של MgSO ₄ מניות. ידני עם פיפטה 8 ערוצים או עם הרובוט LiHa, לוותר 15 μl לבאר כל DW96, לתת ריכוז סופי של 10 / מיליליטר מיקרוגרם של DNase ו20 מ"מ MgSO _4.
3. Re-לאטום את הצלחת עם סרט פלסטי ולנער במשך דקות 15 נוספות. בשלב זה צריכה להיות התרבויות שאינן צמיגות. בדוק היטב (על ידי בדיקה ויזואלית), כי כל התרבויות הן כבר לא צמיגות. הערה: זה הוא קריטי, אם תרבויות מסוימות עדיין צמיגות (לדוגמא, אם DNase נשכח בטעות או לא חילק כראוי בכמה בארות), המסנן לסתום, יצירת לחץ לא אחיד על הדגימות והצפה או סתימה כוללת של צלחת מסנן יכולה לקרות במהלך הטיהור.
4. לקבלת דוגמיות-SDS של כל lysate התא, לשאוב 10 μl של lysate ולוותר לצלחת 96 היטב PCR המכילה10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4x ו20 μl מים. לפגל במשך 3 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולהקפיא עד לניתוח (חלק סה"כ). אם מערכת אלקטרופורזה HTP זמינה, ניתן לנתח הדגימות על זה במקום בעקבות הפרוטוקול המומלץ של היצרן להכנת מדגם. לפרטים נוספים בדבר ניתוח של הדגימות ראו סעיף 10.

8. Ni הזיקה טיהור

הערה: מהירות שאיפה איטית צריכה לשמש עבור pipetting כל השעיות השרף, כמו המתלים הם די עבים. שרף ייבוש יתר יגרום לירידה ביכולת מחייבת. לטיהור, ריכוזי imidazole צוינו חלים על שרף זיקת ניקל. אם יונים חלופיים (למשל, קובלט) נמצאים בשימוש, ולאחר מכן בריכוזים צריכים להיות בהתאם.

1. - טיהור Ni זיקה לגילוי בטווח של 1-100 מ"ג / ליטר (סופי שרף נפח = 200 μl)
   הערה: Tהליך טיהורו לוקח בערך 1.5 שעות כדי להשלים, כלומר עד 4 יכולים להתבצע ביום אחד.
   1. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
      1. שים 300 מיליליטר שקתות המכילות חיץ מחייב (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH imidazole 10 8 מ"מ), לשטוף חיץ (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH imidazole 50 8 מ"מ) וחיץ elution (50 מ"מ טריס, 300 מ"מ NaCl, 250 מ"מ pH imidazole 8) בתפקידים 6 עד 8, בהתאמה.
      2. השאר שוקת מיליליטר ריקה 300 בעמדה 5 לslurry השרף. בעמדה 9 ו10 מחזיקי צלחת מכר. בעמדה 10 לשים DW96 עם בלוק SPE וצלחת מסנן / מקלט (20 מיקרומטר) על העליונה.
      3. שים DW96 מכיל lysate (משלב 7.3) במיקום 14. בעמדה 18 ו19 לשים 200 טיפים רחבים μl שעמם ו200 טיפים μl, בהתאמה. לשים את שתי צלחות DW96 חילוף לשטיפה וelution בבית מלון. הערה: הם גם יכולים לשים באתר חלופי על שולחן העבודה אם מלון אינו זמין.
   2. הכן 105מיליליטר של תרחיף שרף 33% equilibrated (שרף מיליליטר 35 + 70 מיליליטר חיץ המחייב). מוסיף את ההשעיה השרף לשוקת בעמדה 5 מייד לפני תחילת ההליך.
   3. שימוש MCA96 ו200 טיפים רחבים μl שעמם (עמדה 18), לערבב את התרחיף של השרף בעמדה 5 ביסודיות לפני נשיפה ומחלק 200 μl של תרחיף שרף לתוך DW96 מכיל lysate בעמדה 14. חזור פעמיים, כך ש600 μl של תרחיף שרף נוספה lysate, ערבוב ההשעיה השרף לפני כל שאיפה.
   4. לבצע צעד ערבוב 10 דקות באמצעות MCA96 בעמדה 14 כדי לאפשר לכריכה וכדי למנוע את השרף מpelleting.
   5. לשאוב מתפקיד 14 ולוותר 800 μl (ב200 μl הרבה) על גבי צלחת המסנן בעמדה 9, ערבוב לפני כל שאיפה אחרת השרף יישמר בתחתית DW96.
   6. הפעל את הוואקום בעמדה 10 כ 90 שניות כדי לסנן lysate דרך הצלחת לתוךDW96 לאסוף את הזרימה דרך, נזהר שלא לייבש את השרף. הפעל את הוואקום.
   7. חזור על השלבים 8.1.5 ו 8.1.6, כך שכל של השרף הוא לאחר מכן בצלחת המסנן.
   8. באמצעות זרוע רומא להזיז את בלוק SPE מחזיקה את צלחת המסנן מהתפקיד 10 למצב 9, כך שהשלב לשטוף הבא הולך ישירות לפסולת ולהעביר את DW96 המכיל את הזרימה דרך בעמדה 10 לאתר אחר (לדוגמא, למלון מנשא) ועד לסוף ההליך.
   9. עם סט חדש של 200 טיפים μl (בעמדה 19), לשטוף את השרף (במיקום 9) עם סך של 800 μl של חיץ מחייב (מעמדת 6), ולהחיל את הוואקום בעמדה 9 עד החיץ עבר דרך . חזור על פעולה פעם נוספת.
   10. השתמש בזרוע רומא למקום DW96 טרי בעמדה 10 לאסוף לשטוף imidazole 50 מ"מ ולהזיז את בלוק SPE וצלחת מסנן בחזרה על גבי (עמדה 10).
   11. הוספת 800 μl של חיץ לשטוף מתפקיד 7 על עמדת 10, להפוך אתואקום בעד החיץ עבר דרך. לעבור את הוואקום.
   12. עם רומא, להסיר את חסימת SPE וצלחת מסנן למצב 9 וDW96 מכיל את המדגם לשטוף במלון, ולשמור אותו בצד עד לסיום ההליך.
   13. לשטוף את השרף עם עוד 800 μl של חיץ לשטוף (מתפקיד 7 על עמדת 9), להחיל את הוואקום עד לחיץ עבר דרך. חזור על פעולה פעם נוספת.
   14. השתמש ברומא למקום DW96 טרי בעמדה 10 ולמקם את בלוק SPE וצלחת מסנן בחזרה על גבי לאסוף elution.
   15. להוסיף סך של 500 μl של חיץ elution (מתפקיד 8 על עמדת 9) ו דגירה באתרו במשך 3 דקות. הפעל את הוואקום עד שכל החיץ עבר דרך.
   16. אופציונאלי: למאוד לבטא חלבונים, elution שני יכול להתבצע לתוך DW96 טרי כמו בשלבים 8.1.14 ו8.1.15.
   17. לקחת דגימות של זרימה דרך, לשטוף וelution / s עבור SDS-PAGE או אלקטרופורזה HTP.
       1. לקבלת דוגמיות-SDS של הזרימה דרך, לוותר 10 μl לתוך צלחת 96 היטב PCR מכילה 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4X ו20 μl מים. לקבלת דוגמיות-SDS של השטיפה וelution / s לוותר 30 μl לתוך צלחות PCR מכילות 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4x. לפגל במשך 3 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולהקפיא עד לניתוח.
       2. לקבלת דוגמיות אלקטרופורזה HTP, בצע את הוראות היצרן. לפרטים נוספים בדבר ניתוח של הדגימות ראו סעיף 10.
2. B - טיהור Ni זיקה לגילוי בטווח של .1-25 מ"ג / ליטר (סופי שרף נפח = 50 μl)
   הערה: הליך טיהור זה לוקח בערך 30 דקות כדי להשלים, כלומר עד 12 יכולים להתבצע ביום אחד.
   1. הכן את שולחן העבודה הרובוט:
      1. שים 300 מיליליטר שקתות המכילות חיץ מחייב (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH imidazole 10 8 מ"מ), לשטוף חיץ (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH imidazole 50 8 מ"מ)וחיץ elution (50 מ"מ טריס, 300 mM NaCl, pH imidazole 250 8 מ"מ) בעמדות 6 עד 8, בהתאמה.
      2. השאר שוקת מיליליטר ריקה 300 בעמדה 5 לslurry השרף. בעמדה 9 ו10 מחזיקי צלחת מכר. בעמדה 10 לשים DW96 עם בלוק SPE וצלחת מסנן / מקלט (20 מיקרומטר) על העליונה.
      3. שים DW96 מכיל lysate (משלב 7.3) במיקום 14. בעמדה 18 ו19 לשים 200 μl טיפים רחבים שעמם ו200 טיפים μl, בהתאמה. שים את צלחת microtiter 96 היטב חילוף לelution בבית מלון. הערה: זה יכול להיות גם לשים באתר חלופי על שולחן העבודה אם מלון אינו זמין.
   2. הכן 50 מיליליטר של תרחיף equilibrated 25% שרף (12.5 מיליליטר שרף + 37.5 מיליליטר חיץ מחייב). מוסיף את ההשעיה השרף לשוקת בעמדה 5 מייד לפני תחילת ההליך.
   3. שימוש MCA96 ו200 טיפים רחבים μl שעמם (עמדה 18), לערבב את התרחיף של השרף בעמדה 5 ביסודיות לפני הנשיפה וdispensing 200 μl של תרחיף שרף לתוך DW96 מכיל lysate בעמדה 14.
   4. לדגור על RT עם הרעד באמצעות טה-Shake ב 1400 סל"ד 10 דקות, כדי לאפשר מחייב.
   5. לשאוב מתפקיד 14 ולוותר μl המלא 1,200 (ב200 μl הרבה) באמצעות הטיפים רחבים שעמם (עמדת 18) על גבי צלחת המסנן בעמדה 10. מערבבים לפני כל שאיפה אחרת השרף יישמר בתחתית DW96.
   6. הפעל את הוואקום בעמדה 10 כ 30 שניות כדי לסנן lysate דרך הצלחת לתוך DW96 לאסוף את הזרימה דרך, נזהר שלא לייבש את השרף. הפעל את הוואקום.
   7. באמצעות זרוע רומא, הזז את בלוק SPE מחזיק את צלחת המסנן מהתפקיד 10 למצב 9, כך שהשלב לשטוף הבא הולך ישירות לפסולת ולהעביר את DW96 המכיל את הזרימה דרך בעמדה 10 לאתר אחר (לדוגמא, ל מלון מוביל) ועד לסוף ההליך.
   8. עם 200 μטיפים ליטר (בעמדה 19), לשטוף את השרף (במיקום 9) עם סך של 800 μl של חיץ מחייב (מעמדה 6), ולהחיל את הוואקום בעמדה 9 עד החיץ עבר דרך. חזור על פעולה.
   9. השתמש בזרוע רומא למקום DW96 הטרי בעמדה 10 לאסוף לשטוף imidazole 50 מ"מ ולהזיז את בלוק SPE וצלחת מסנן בחזרה על גבי (עמדה 10).
   10. הוסף 150 μl של חיץ לשטוף מתפקיד 7 על עמדת 10, להפוך את הוואקום עד החיץ עבר דרך. לעבור את הוואקום.
   11. עם ROMA להסיר את חסימת SPE וצלחת מסנן למצב 9 וDW96 מכיל את המדגם לשטוף במלון, ולשמור אותו בצד עד לסיום ההליך.
   12. לשטוף את השרף עם עוד 800 μl של חיץ לשטוף (מתפקיד 7 על עמדת 9), להחיל את הוואקום עד לחיץ עבר דרך. חזור על פעולה.
   13. השתמש ברומא למקום microplate בעמדה 9 ולמקם את בלוק SPE וצלחת מסנן בחזרה על גבי לאסוף הelution דואר.
   14. הוספת 190 μl של חיץ elution (מתפקיד 8 על עמדת 9) ו דגירה באתרו במשך 3 דקות. להחיל את הוואקום עד שכל החיץ עבר דרך.
   15. לקחת דגימות של הזרימה דרך, לשטוף וelution לSDS-PAGE או אלקטרופורזה HTP.
       1. לקבלת דוגמיות-SDS של הזרימה דרך, לוותר 10 μl לתוך צלחת 96 היטב PCR מכילה 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4X ו20 μl מים. לקבלת דוגמיות-SDS של השטיפה וelution / s לוותר 30 μl לתוך צלחות PCR מכילות 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4x. לפגל במשך 3 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולהקפיא עד לניתוח.
       2. לקבלת דוגמיות אלקטרופורזה HTP, בצע את הוראות היצרן. לפרטים נוספים בדבר ניתוח של הדגימות ראו סעיף 10.

9. תג מחשוף (אופציונאלי)

1. הוסף את פרוטאז TEV (2 מ"ג / מיליליטר) לחלבון eluted (משלב 8.1.15 (ו -8.1.16) או צעד 8.2.14) על יחס של 1/10 (V / V).
2. לדגור על RT (או 4 מעלות צלזיוס למשך חלבונים רגישים לטמפרטורה) O / N עם רעד עדין.
3. בסופו של המחשוף לוותר 30 μl לתוך צלחת PCR מכילה 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4x או בצעו את ההוראות של היצרן עבור דגימות אלקטרופורזה HTP.
4. סנן את התערובת שנותרה מחשוף (משלב 9.2) דרך 0.22 מיקרומטר צלחת מסנן 96 היטב ולאסוף את זרימה דרך מסיסה בDW96 ידי החלת הוואקום. ניתן לעשות זאת באחד מאתרי הוואקום (לדוגמא, עמדת 10) על רובוט הטיפול הנוזלי, כמו לצעדי elution בסעיפי 8.1 ו8.2. זו מסירה את כל חלבון שזרז במחשוף.
5. לאחר סינון, לוותר 30 μl לתוך צלחת PCR מכילה 10 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE 4x או להכין כדגימות אלקטרופורזה HTP. זה מאפשר ההשוואה של החלבון לפני המחשוף, התערובת לאחר מחשוף והסולחלבון UBLE שנותר לאחר מחשוף ונותן אינדיקציות טובות של התוצאות הצפויות בניסויים בקנה מידה-up שלאחר מכן. לפרטים נוספים בדבר ניתוח של הדגימות ראו סעיף 10.

10. ניתוח התוצאות

1. זהה את המבנים לבטא חלבון מסיס על ידי ניתוח דגימות טיהור ב- SDS, מערכת אלקטרופורזה HTP כתם נקודה או כגון LabChip Caliper.
   1. ניתוח דגימות elution הראשון לזהות מבני ייצור חלבון מסיס. ברוב המקרים רק דגימות elution מנותחות אם מבנים מסיסים מזוהים, כדי לצמצם את המשך הזמן על הניתוח.
   2. אם החלבון הוא לא בelution, הפעל את דגימות השטיפה וזרימה דרך כדי לראות אם זה בא לידי ביטוי ולא להיקשר כראוי לשרף.
   3. למבנים שבם אין חלבון מסיס ניתן לאתרם לרוץ כל lysate התא כדי לראות אם החלבון בא לידי ביטוי.
      הערה: מגבלה אחת כאן היא שאם protein של עניין לא להציג רמות ביטוי רקע אמורות לעיל, ייתכן שלא ניתן לראות את החלבון ועלול להוביל לתוצאה שלילית שגויה. יש לציין שזה תמיד אפשרי עבור חלבונים להיצמד ולזרז על שרף זיקה וזה יכול להוביל לתוצאה שלילית שגויה, או תת הערכה של התשואה באמצעות הפרוטוקול המומלץ (אירוע נדיר בעבודה זו). במקרה שהחלבון משקעים על elution (גלולה לבנה היא נראית לעין כמה דקות / שעות אחרי elution) מומלץ לשנות את הרכב המאגר (לדוגמא, ריכוז מלח) ו / או לבצע assay fluorimetry פער הסריקה כדי לייעל את מאגרים. מדגם קטן של השרף יכול גם להיות מושעה בחיץ מדגם SDS-PAGE ומבושל כדי לזהות אם חלבון הוא להיות נשמר על השרף.
   4. אם החלבון לא בא לידי ביטוי, אך לא התאים לגדול, לפתח אסטרטגית ביטוי חדשה, או אם OD ₆₀₀ לא היה גבוה מספיק לצמוח מחדש ולנתח מחדש את התרבות. >
   5. אם דגימות מחשוף הן להיות מנותחות, הם צריכים להיות מנותחים באופן Side-by-צד, כך שכל מבנה יכול להיות מוצג לפני המחשוף לאחר מחשוף בנתיבים סמוכים, כדי לפשט את הניתוח.
2. אלא אם כן בשיטה שנותנת כימות ישיר של ריכוז elution, כימות צריכה להתבצע על דגימות חיוביות על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר (A280).
   1. מדוד את A280, לוקח את הכחדת שיתוף יעיל של החלבון בחשבון ושימוש במאגר elution כריק, על מנת לספק אומדן של תשואת חלבון על מנת לזהות את המבנים המסיסים להביע הגבוהים ביותר.
   2. להשוואה אמינה ביותר של תשואות מסיסים, מומלץ לנרמל את התשואות על ידי הצפיפות של התרבות (באמצעות מדידת ₆₀₀ OD), שצולמה בסעיף 5. אם כל התרבויות גדלו לכ אותה הצפיפות, הנורמליזציה אינה נדרש.

דואר "> 11. בקרת האיכות

1. ניתן לנתח דגימות ישירות מelution או מדגם מחשוף ידי ספקטרומטריית נוזל כרומטוגרפיה מסה (LC / MS).
2. לחלופין, desalt הראשון (כדי להסיר imidazole וכל מלחי חיץ שעשויה להיות נוכח) באמצעות פיפטה טיפים ZipTip או שיטות כרומטוגרפיה נוזלית, ולאחר מכן לנתח את השימוש (MALDI-TOF) desorption הלייזר בסיוע מטריקס / יינון הזמן של טיסה או יינון electrospray ( ESI) ספקטרומטריית מסה.
3. ניתן לבצע מחקרים תפקודיים בקנה מידה קטנה כדי לבדוק אם הפונקציה של החלבון היא כצפוי. אם כמויות גדולות יותר נדרשות לתפקוד, תרבות סולם למעלה יכולה להתבצע והפונקציה נבדקה מהתרבות הגדולה יותר ברגע שמדינה בגודל והחמצון אושרו בקנה המידה הקטנה.

תוצאות

נציג תוצאות מוצגות באיור 6 להקרנת הביטוי של חלבוני 96 דיסולפיד עשיר מצינור VENOMICS. החלבונים מסודרים על ידי מספר הולך וגדל של אגרות חוב דיסולפיד אז הגדלת מספר השאריות. פפטידים באו לידי ביטוי בציטופלסמה עם התג שלו ושותף היתוך DsbC. בעת שימוש בתנאי התרבות המומלצת, OD ₆₀₀ של 12 מושגת בדרך כלל. פפטידים היו מטוהרים באמצעות פרוטוקול 8.2-B עם נפח סופי של μl 50 של שרף זיקת ניקל, כך מרבי ~ חלבון היתוך 25 מ"ג / ליטר של ניתן היה לזהות בניסוי זה.

איור 6 א מראה את תוצאת אלקטרופורזה ממערכת הניקוד הבוסס על ניפוח להניב בתרבות מ"ג / ליטר של חלבון היתוך מערכת Caliper LabChip (מראה היתוך לפני המחשוף) ו( ברמות של 0.1-2 תרבות מ"ג / ליטר, 2 עד 10 תרבות מ"ג / ליטר, 10-25 מ"ג / תרבות L ולא לא זוהה.) שים לב שתג DsbC ביקע בדרך כלל פועל בסביבות 32 kDa, ולא 27 kDa כצפוי. באופן דומה, התכה DsbC גם להתרוצץ 5 kDa גבוהים מהצפוי. להרבה מטרות שאנו לא רק רואים את ההיתוך שלם (רצועה עליונה), אלא גם שותף ההיתוך לבד (להקה נמוכה יותר). עבור חלק ממטרות אלה אופטימיזציה תנאי התרבות יכולה לשפר את היחס של ההיתוך ללא פגע (רצועה עליונה) בהשוואה לDsbC לבד המאפשר גידול של התשואה הסופית. הניקוד מתבסס רק על הרמה של היתוך ללא פגע. רק 16 מתוך 96 חלבונים לא ניתן היו לזהות ברמת ההיתוך. זה מתאים לרמת הצלחה כוללת של 83%. של 80 חלבונים שניתן היה לזהות, 45 של אלה התגלו ברמות גבוהות יותר מ -2 תרבות מ"ג / ליטר (56%). בהתאם ליעד ואיחוי, תשואות חלבון הן בדרך כלל בטווח של 2-100 תרבות מ"ג / ליטר (אם כי בדוגמא זו באמצעות הפרוטוקול 8.2 B מקסימום ~ חלבון היתוך 25 מ"ג / ליטר של ניתן לאתר).

t "> ניתוח של ההצלחה על ידי מספר קשרי דיסולפיד הנוכחיים (המוצג באיור 6) מראה הצלחה סבירה לכל המספרים של אגרות חוב דיסולפיד נבדקו (בין 1 ל -7), עם רמת ההצלחה הנמוכה ביותר במשך 66% עבור מטרות המכילות 6 דיסולפיד אגרות חוב. ניתוח ההתפלגות של הצלחה ביטוי המבוסס על נקודה ומספר השאריות (שמוצג באיור 6C) איזואלקטרית מראה שום נטייה מסוימת לטכניקה, עם שני מטרות וביעדים שלא התגלו פזורים בעלילה הביעו בהצלחה.

איור 6 ד 'מציג דוגמא של תוצאות ספקטרומטריית מסה המתקבלות מספקטרומטריית electrospray ההמונית יינון (ESI-MS) למטרה אחת, לפני ואחרי ההפחתה של המדגם עם DTT. בדרך כלל, ניתוח ספקטרומטריית כגון ממצה המוני לא הייתי צריכה להתבצע (מדגם מופחת לא צריך להיות מנותח), לעומת זאת לעניין demonstratio יסודיn שהראינו גם תוצאות. היעד המוצג הוא חלבון ארס דיסולפיד עשיר 5.7 kDa עם 4 קשרי דיסולפיד. הקשת בצד השמאל מראה את התוצאות לחלבון לפני הפחתה עם DTT, כפי שהייתה לאחר מחשוף וdesalting ללא התערבות נוספת. הקשת בצד ימין מציגה את החלבון לאחר הפחתה עם DTT ואחרי desalting כדי להסיר כל DTT עודף. היונים המתאימים להמונים הניסיוניים מסומנים בחיצים על הספקטרום והייעוד לכל יון מוצג בירוק. המוני ההורה הניסיוניים שמחושבים ליונים אלה (לחלבון לפני ההפחתה (-DTT) ולאחר ההפחתה (+ DTT)) מוצגים בטבלה. ההמונים (5709.6 דה למדגם לפני הפחתה ו5717.6 דה למדגם המופחת) תערוכת הבדל מסה של 8 דא. הבדל מסה של 2 דה תואם את הנוכחות של אג"ח דיסולפיד חמצון 1, ולכן הבדל מסה של 8 דה ומעיד על הקיום של 4 אגרות חוב דיסולפיד (כצפוי) בהמדגם שאינו מופחת.

איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הקרנת ביטוי תפוקה הגבוהה. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיבדק על ידי אדם אחד 96-384 תנאים בשבוע אחד בשיטות ידניות, או עד 1,152 תנאים עם הציוד חצי האוטומטי שתואר. פלסמידים ביטוי נבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה כך שמטרות רבות יכולות להיות תת משובטות-בבת אחת. תנאי ביטוי ברגע מסיסים זוהו ומחשוף שבוצע, אם רוצה, את החלבון ניתן להמשיך לבקרת איכות כדי לבדוק את החמצון וטוהר, microassays ו / או ייצור בקנה מידה גדולה.

איור 2. סכמטי לשיבוט recombinational אוניברסלי ולבנות עיצוב. משיבוטי כניסת היעד, וקטורי ביטוי מרובים יכולים להיות תת שובטו בניסוי יחיד באופן תפוקה גבוה (עד 6 x 96 שיבוטים כניסה בשבוע). החלבון הביע מקודד תג שלו לטיהור זיקת ניקל. DsbC (חסר רצף אות periplasmic לביטוי cytoplasmic) שותף היתוך משמש להגברת מסיסות ו / או קיפול סיוע וחמצון נכון של חלבון המטרה. שים לב שרצף קידוד היעד צריך להכיל אתר פרוטאז TEV N-מסוף (ENLYFQ) אם מחשוף תג הוא רצוי. הבלעה בפינה השמאלית העליונה מראה את הייצור של השיבוטים הכניסה באמצעות וקטור תורם ורצפי היעד, שניתן להשיג על ידי PCR או סינתזת גן. יכולים גם להיות מושגת שיבוטים כניסה מאוספי שיבוט כניסה מסחריות. מערכות שיבוט recombinational מרובות זמינות, עם זאת אנו מנצלים syste Gatewayמ ', כפי שמוצג בסכמטית.

איור 3. צינור הקרנת תפוקה גבוהה למטרות דיסולפיד עשיר מרובות. מטרות בתחילה הביעו כהתכה שלו-DsbC בציטופלסמה של BL21 (DE3) pLysS E. coli ב37/17 ° C באמצעות מדיום אוטומטי אינדוקציה (ZYP-5052). טיהור מבוצעת על שרף ניקל ואחרי זיהוי של מבנים מסיסים ידי אלקטרופורזה HTP (או עם כתם /-SDS נקודה). אם בסיבוב הראשון של הקרנת ביטוי הוא לא מוצלח, תנאי תרבות אלטרנטיביים ניסו. אם מבנים לייצר חלבונים מסיסים בתשואות גבוהות מספיק, microassays ובקרת איכות יכולה להתבצע, ואם נדרש, ניתן רדף ייצור בקנה מידה גדולה. למטרות שבו תשואות מסיסים הן לא מספיק גבוהות, הקרנת ביטוי יכולה להמשיך עם stra האלטרנטיביתוספות וטמפרטורות אז שותפי היתוך אחר וביטוי periplasmic. צעדים אופציונליים מסומנים על ידי תיבות מקווקוות.

איור 4. התקנת רובוט שולחן עבודה עבור פלטפורמת HTP. הפריסה של שולחן העבודה הרובוט שלנו נוזל טיפול מוצגת, אם כי יכול לשמש גם שולחנות עבודה חלופיים בתנאים שיש אתרים שווי ערך זמינים. ההתקנה מורכבת מתחנת שטיפה (WS) ל( ראש 8 ערוצי הטיפול נוזלי (LiHa)), שתי נושאות microplate עם 4 עמדות כל אחד (MP4, עמדות 1-4 ו5-8), תחנת חלל עם 2 עמדות (Te-Vacs, מיקומים 9 ו10), נושאת microplate עם 3 עמדות (MP3, ממקמת 11-13), שני שייקרים לצלחת עם 2 עמדות כל אחד (Te-השייקרים, ממקם 14-15 ו16-17) וספק לטיפים חד פעמי עם 3 עמדות (דיתי, ממקם 18-20). בנוסףמחדש הם שני ספקי מלונות לצלחות גם עמוקות ואחד לmicroplates (לא מוצג). החומרה המותקנת ברובוט הטיפול הנוזלי היא זרוע 96 רבת ערוצים (MCA96) לשימוש עם טיפים חד פעמי, ראש 8 ערוצי טיפול נוזלי (LiHa) עם טיפים קבועים ומניפולטור רובוטית (רומא) שזז צלחות / ציוד מסביב על שולחן העבודה. המספור של העמדות מכונה לאורך כל הפרוטוקול.

איור 5. סכמטי להעברה מצלחת 96 היטב אחת לארבע 24 גם צלחות.

איור 6. נציג תוצאות מוצגות על מסך הביטוי של 96 פרו ארס דיסולפיד עשירteins. החלבונים באו לידי ביטוי כהתכה שלו-DsbC בציטופלסמה ומטוהר באמצעות 50 μl של שרף ניקל (פרוטוקול 8.2-B).) תוצאות ביטוי הקרנה, מראה ג'ל הווירטואלי ורחוק לתשואת הביטוי. לעומת זאת בג'ל הווירטואלי הותאם נתיב לנתיב, כדי לפצות על להקות קלושות מאוד או אינטנסיבית. שימו לב כי עבור חלק ממטרות שניתן לראות שתי להקות, הלהקה העליונה מקבילה לחלבון ההיתוך שלם והרצועה התחתונה מתאימה לתג ההיתוך לבד. ב ') חלקם של חלבונים המתבטאים בכל רמת ביטוי בהשוואה למספר של איגרות חוב דיסולפיד ב החלבון. המספר האמיתי של חלבונים בכל קבוצה הוא יכסה על גרף. C) ההפצה של רמות ביטוי המבוסס על נקודה איזואלקטרית (PI) ומספר השאריות. ד ') דוגמא לתוצאות ספקטרומטריית מסה לארס דיסולפיד עשיר 5.7 kDa חלבון עם 4 קשרי דיסולפיד. הספקטרום עלבצד השמאל מציג את החלבון לפני הפחתה עם DTT והקשת בצד ימין מציג את החלבון מופחת עם DTT ולאחר מכן desalted. היונים המתאימים להמונים הניסיוניים מסומנים בחיצים וההקצאות שלהם מוצגות בצבע ירוק. ההמונים הניסיוניים לחלבון לפני ההפחתה ולאחר ההפחתה מוצגים בטבלה ולהציג את הבדל מסה של 8 דא, מתאים לנוכחות של חלבון חמצון לפני תוספת של צמצום סוכן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

רכיב	מתכון	הערה
ZY	~ 928 מיליליטר 10 גרם tryptone תמצית שמרים 5 גרם 925 מיליליטר מים	מערבבים ולאחר מכן חיטוי לעקר.
2 M MgSO 4	100 מיליליטר 49.3 גרם MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 מיליליטר מים	מערבבים עד שהיא נמסה אז חיטוי לעקר.
50x 5052	L 1 250 גליצרול גרם 730 מיליליטר מים 25 גרם גלוקוז 100 גרם α-קטוז	להוסיף ברצף, מערבבים על אש עד שכל מומס אז חיטוי לעקר.
20x NPS	L 1 900 מיליליטר מים 66 גרם (NH 4) 2 SO 4 136 KH גרם 2 PO 4 142 גרם Na 2 HPO 4	להוסיף ברצף ומערבבים עד שכל מומס אז חיטוי לעקר.

טבלת 1. מתכון לרכיבים של מדיום ZYP-5052.

Discussion

אין פרוטוקול אוניברסלי יחיד לביטוי של חלבונים מסיסים, מקופלים, פונקציונליים. להיות עלות והזמן יעיל, רוב המעבדות או מתקני גרעין חלבון עבודה עם מטרות מרובות ולכן משתמשים בביטוי חלבון גבוה תפוקת הקרנה למצוא את השילוב הטוב ביותר "הגנרית" של משתנים כדי לקבל חלבון פעיל מסיס עבור רוב המטרות. אנו זיהינו DsbC כמו להיות שותף היתוך בדרך כלל ישים עבור הביטוי מסיס של פפטידים דיסולפיד עשיר בחלבונים ^ו11. באמצעות התכה DsbC ושיטות תפוקה גבוהה, תוך שבוע הביטוי מסיס של מטרות מרובות ניתן לצפות ¹¹ ולאחר מכן משתנים נוספים, כגון אלה שנדונו בהקדמה, יכולים להיות מוקרנים בסיבובים שלאחר מכן על אותם היעדים שדורשים אופטימיזציה נוספת. הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה מכוונים לביטוי של חלבוני דיסולפיד עשיר ופפטידים. עם זאת, עבור משתמשים המעוניינים expחלבונים שאינם מרושתים Ress באופן תפוקה גבוה, הפרוטוקולים המתאימים כבר פורסמו בעבר, וניתן למצוא במקומות אחרים ^22,24.

הגדרת התפוקה הגבוהה היא אידיאלית עבור מספר היישומים, כולל ההקרנה של מספר רב של חלבונים שונים לביטוי מסיס או ההקרנה של מספר רב של מבני ביטוי (כוללים תגי היתוך שונים) לכמה גנים המטרה באותו הזמן ( או ביטוי מרובה בונה למטרה אחת) על מנת לשפר את אחוזי ההצלחה. גם הפלטפורמה יכולה לשמש להשוואות ואימות של פרוטוקולים חדשים על מספר רב של מטרות. יישומים אחרים כוללים הקרנה של גרסאות ליעד קשה בודד, למשל, כל orthologs או בני אותה המשפחה, או כדי לבדוק את ההצלחה של ייצור פנל של מוטציות של מטרה אחת בניסוי אחד. פרוטוקול זה גם נעשה שימוש בשילוב עם וקטורי שיתוף ביטוי (שנינות h אחד מתויג חלבון בלבד) כדי לאפשר המשיכה למטה ואפיון ראשוני של קומפלקסי חלבונים ואחרי ניתוח biophysical מעמיק יותר כדי לאשר את היווצרות מורכבת הנכונה והרכב ^33. כמות החלבון מטוהרת היא לפעמים מתאימה למייקרו מבחני (בדיקות פונקציונליות, חלבון-DNA ³⁴ או מבחני אינטראקציה בין חלבונים). ישנם מספר יתרונות לאסטרטגית הקרנת ביטוי תפוקה הגבוהה: (i) את היכולת לבחון מספר רב של מטרות, או מספר רב של משתנים בניסוי אחד, (ii) וריאציה אצווה כדי אצווה מוגבלת, (iii) פשטות וקלות לעבוד בקנה מידה קטנה יותר באמצעות בארות עמוקות, (iv) מדרגיות ושחזור בקנה מידה גדולה יותר, (v) את הפוטנציאל לאוטומציה, ופשטות (vi) של מעקב וטיפול (אין תיוג של צינורות בודדים, פחות טעויות הציגו בעת שימוש בתבנית הצלחת מאשר עם הטיפול בצינורות בודדים בערבוב או החלפה של שיבוטים).

class = "jove_content"> למרות שלא דנו בסעיף בפרוטוקול, יש כמה שיקולים חשובים להכנת הניסוי שיידון בקצרה להלן. לדיון מעמיק יותר אנא ראה הפרסום הקודם שלנו ^24. ליעילות מקסימלית, זה מועיל יש מערכת מתאימה לשיבוט תפוקה גבוהה, כדי לפשט משנה השיבוט של מספר רב של מטרות. בשלב הראשוני של פרויקט VENOMICS, אנו מנצלים את מערכת תכליתי Gateway רקומבינציה ²⁵ המאפשרת subcloning בכל וקטור יעד בקצב של מאות שיבוטים בשבוע. ניתן למצוא בפרוטוקולים לשיבוט רקומבינציה Gateway באתר Invitrogen. חלופות אחרות לשיבוט תפוקה גבוהה כוללות שיבוט קשירה עצמאית (LIC) ^35,36 וללא הגבלה (RF) שיבוט ^37. ישנן דרכים רבות כדי להשיג את גנים המטרה לביטוי, ובכלל זה על ידי PCR מהתבנית ה-DNA, מאוספי שיבוט כניסה או כמוגנים סינטטיים, המהווה את האסטרטגיה שנבחרה לפרויקט VENOMICS. ניתן להזמין בגנים סינטטיים עם אתרי רקומבינציה בכל קצה של סינתזת הגן והגן מאפשרת אופטימיזציה של קודון קל של רצף גן המטרה (להוציא קודונים החיידק נדירים). זו מומלצת אך לא הכרחי. למטרות ללא קודון אופטימיזציה המכילות מספר גבוה של קודונים נדירים, רוזטה 2 (DE3) pLysS (אשר נושא tRNAs לקודונים נדירים שלא באים לידי ביטוי מאוד בE. coli) עשויים להיות מתאים יותר מBL21 (DE3) pLysS. אמנם יש זנים זמינים המגבילות את ההפחתה של אגרות חוב דיסולפיד בסביבה בדרך כלל הפחתה של ציטופלסמה, בידיים שלנו הם לא היו מוצלחים כמו ה הרגילה coli זני ^11.

טיהור זיקת קנה מידה אנליטית מבוצעת מתרבויות ביטוי מבחן על מנת לשחזר את חלבוני היתוך המסיסים ולכמת תשואות. ניתן לקבל נתונים כמותיים על הדואר תשואות מסיסים של חלבוני היתוך הביעו בטווח של 0.1-100 מ"ג / ליטר של התרבות. אם יעד הוא לא מסיס, טמפרטורות חלופיות ביטוי ואינדוקציה, זנים או תקשורת יכולות להיבדק לפני שותפי היתוך שונים רדפו. לביטוי מסיס של חלבוני דיסולפיד עשיר, אנחנו מדורגים בעבר את ההשפעה של שותפי היתוך כ>> GST DsbC> DsbA MBP> TRX> התג שלו לביטוי cytoplasmic ^11. ביטוי periplasmic אפשרות נוספת שעשויות לסייע לקיפול המוצלח של מטרות דיסולפיד עשיר. Periplasm היא סביבת הפחתה פחות מ ציטופלסמה ומכיל מלווים חיזור שימושיים כדי לסייע דיסולפיד מליטה. חלבוני DsbC, DsbA, וMBP בדרך כלל מקומיים לperiplasm ידי רצפי אות periplasmic שלהם. זה מספק ההזדמנות לנצל תגים אלו לכוון את מטרות דיסולפיד עשיר למרחב periplasmic על מנת לסייע מתקפל. למטרות סוררות, הצעד הבא יהיה purify היעד מתויג-HIS מסיס מגופי הכללה, solubilize ולקפל (זה מחוץ להיקף של פרוטוקול זה ולא יידון כאן ^{3 9).} זה יכול להיות פשוט למדי למטרות עם רק אחד או שניים אג"ח דיסולפיד, אבל הופך להיות קשה יותר ויותר ככל שמספר עליות איגרות חוב דיסולפיד. לחלופין, ובמיוחד לחלבונים ופפטידים עם ארבעה או יותר קשרי דיסולפיד, זה עשוי להיות מועיל כדי לנסות מערכות ייצור מורכבות יותר כמו שמרים, חרק או ביטוי של יונקים.

עם התקדמות במזעור ואוטומציה, טכנולוגיות אלקטרופיזיולוגיה HTP מעבדה על שבב ²⁸ תהיינה ללא ספק הדרך של העתיד לניתוחים פונקציונליים. אנו חוזים כי לרוב מטרות (אולי הפרט למחקרים מבניים) זה יהיה לשלול את הצורך בתרבויות בקנה מידה גדולה. תרבויות בקנה מידה קטנות לא רק להיות שימושיות עבור הקרנת תנאי ביטוי, אלא גם להיות מסוגל לספק סוףficient הסכומים של מדגם עבור מבחני פונקציונליים מוקטנים אלה. היכולת לייצר מטרות מרובות במקביל בכמויות מספיקות לאפיון פונקציונלי תפחית את העלויות של culturing ושימוש בסוג של פלטפורמות אלה, ביטוי ואפיון של חלבונים רקומביננטי יהיה יותר עלות וזמן יעיל.

הפרוטוקולים במסמך יושמו לביטוי של פפטידים דיסולפיד עשיר וחלבונים בשלב הראשוני של פרויקט FP7 האירופי VENOMICS. ארס הוא מקור מצוין של פפטידים ביו, כי לעתים קרובות יש להם פוטנציאל תרופתי מעניין. עם זאת, הייצור שלהם הוא מאתגר בשל הדפוסים המורכבים שלהם דיסולפיד-המליטה וגודל קטן. שימוש בפלטפורמות תפוקה גבוהה כמו זו שתוארה במסמך זה, פרויקט VENOMICS שואף לייצר ספרייה של 10,000 פפטידים ארס רומן לשחזר את הגיוון שנצפה בטבע. ספרייה זו תנוצל לאפיון של דיסולפיד-rפפטידים ich עם תרופתי פוטנציאלי או יישומים טיפוליים במטרה לפתח תרופות חדשות. הפלטפורמה נמצאת בשימוש בהשוואות ולאימות של פרוטוקולים חדשים לשימוש בפרויקט VENOMICS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot	Tecan Group Ltd.		Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates	Greiner Bio-One	652270	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium			Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks			Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity	Greiner Bio-One	780270	Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors			For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells			Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film	Greiner Bio-One	676050
PCR machine with 96-well plate block			For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates	Greiner Bio-One	662165	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar			Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips	Tecan Group Ltd.	30 038 617	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw	Infors	AJ103	Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate			For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol			For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips	Tecan Group Ltd.	30 038 616	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads	Qiagen	19570	http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl	Orapi Group		Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium			See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity	Whatman	7701-5102	Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate	Greiner Bio-One	655101	For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer			Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates			Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme			50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade	Merck	IX0005-1	A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer			50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)	Misonix Inc.		Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase			2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4)			2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer
Binding buffer			50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer			50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer			50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity	Macherey-Nagel	740686.4	http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips	Tecan Group Ltd.	30 050 348	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin	GE Healthcare	17-5318-02	For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease			Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate	Millipore	MSGV N22 10	Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment			Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes			For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips	Millipore		Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.