דגם השת עצב איזוק של כאב נוירופתי בעכברים

Summary

כאב נוירופטי הוא תוצאה של פגיעה או מחלה המשפיעה על מערכת החושית. "מודל השרוול" בכאב עצבי בעכברים מורכב מההשתלה של שרוול פוליאתילן סביב הסניף הראשי של העצב השת. אלודיניה מכאנית נבדקה באמצעות חוטי פון פריי.

Abstract

כאב נוירופטי נובע כתוצאה מנגע או מחלה הפוגעת במערכת החושית. תוצאות תסמונת זו משינויי הסתגלותי בעצב סנסורי פצוע ולאורך מסלול nociceptive השלם בתוך מערכת העצבים המרכזית. זה בדרך כלל כרוני ומאתגר לטיפול. על מנת ללמוד בכאב נוירופתי והטיפולים שלה, מודלים שונים פותחו במכרסמים. מודלים אלה נובעים מבעלות אטיולוגיה ידועה, ובכך מתרבים פציעות היקפי עצבים, פציעות מרכזיות, וחילוף חומרים, נוירופתיה זיהומיות או הקשורות לכימותרפיה. מודלים עכבריים של פגיעה עצבית היקפית לעתים קרובות למקד את גיד הנשה אשר קל לגישה ומאפשר בדיקות nociceptive בכף הרגל האחורית. מודלים אלה מסתמכים על דחיסה ו / או סעיף. הנה, את הליך הניתוח מפורט עבור "מודל השרוול" בכאב עצבי בעכברים הוא תאר. במודל זה, שרוול של צינורות פוליאתילן PE-20 באורך סטנדרטי (2 מ"מ) הוא באופן חד צדדי implanted סביב הסניף הראשי של העצב השת. זה גורם אלודיניה מכאנית לטווח ארוך, כלומר., תגובת nociceptive לגירוי בדרך כלל אינו nociceptive שיכול להיות מוערך על ידי שימוש בחוטי פון פריי. חוץ מהניתוחים ובדיקות מפורטים, העניין של מודל זה לחקר מנגנון עצבי של כאב, לחקר כאב נוירופתי היבטים חושיים וanxiodepressive, ולמחקר של טיפולים בכאב נוירופתי גם דן.

Introduction

כאב נוירופטי הוא בדרך כלל כרוני, והוא נוצר כתוצאה מפגיעה או מחלה הפוגעת במערכת החושית. שינויי הסתגלותי בעצב סנסורי פצוע ולאורך מסלול nociceptive השלם בתוך מערכת העצבים המרכזית להשתתף בתסמונת מורכבת זו. מודלים שונים פותחו במכרסמים לחקר כאב נוירופתי והטיפולים שלה ^1-3.

בהתבסס על בעלות אטיולוגיה ידועה, המודלים של מטרת כאב נוירופתי במחקו polyneuropathy נצפה בסוכרת, הפציעות לעצבים היקפיים, הפציעות המרכזיות, העצב המשולש, נוירופתיה רצופה לכימותרפיה, עצבי פוסט herpetic, וכו 'מודלים שונים של פגיעה עצבית היקפית במכרסמים להתמקד בעצב השת. מודלים אלה תלויים בדחיסה ו / או במקטע של עצב זה. ואכן, העצב השת מאפשר ניתוח קל יחסית ומאפשר לבדיקות המבוססות על רפלקסים נסיגת כפה. מוdels של דחיסת עצב כרונית כולל לדוגמא: פציעה הכרונית התכווצות (CCI) ^4,5, עצב השת אוזקים ^6-9, קשירה החלקית השת עצב (PSL) ^10, קשירת השדרה העצב (SNL) ^11, או נפוצה קשירת עצב peroneal ^12. מודלים המכונים "פגיעה חסכה עצבים" (SNI) גם נמצאים בשימוש נרחב. הם מורכבים מקשירה וaxotomy של שתיים מתוך שלושה סניפי המסוף של העצב השת הדוקים, ואילו הסניף השלישי נותר בשלמותה ^13-15. המודלים השונים של כאב נוירופתי, הממקדים את העצב השת, לגרום לאלודיניה מכאנית כרונית (תגובת nociceptive לבדרך כלל גירוי שאינו nociceptive) על כף הרגל האחורית הפצועה.

הנה, את הליך הניתוח מפורט עבור "מודל השרוול" בכאב עצבי בעכברים הוא תאר. זה מורכב בהשתלה של שרוול פוליאתילן סביב הסניף הראשי של העצב השת ^6-9. השימוש בדואר של סיבי פון פריי מתוארים גם. סיבים אלה מאפשרים הערכת אלודיניה מכאנית אשר היא סימפטום nociceptive לאורך זמן הווה במודל זה.

Protocol

פרוטוקולים שאושרו על ידי "Comité d'en éthique matière d'הניסויים animale דה שטרסבורג" (CREMEAS).

1. Baseline מדידה של Paw נסיגת ספים

1. לאפשר לעכברים להרגיל למתקנים של בעלי החיים ל10 ימים לפחות 2 שבועות לפני ביצוע הליכי הבדיקה.
2. להרגיל את העכברים להגדרת בדיקות פון פריי ולהליך פון פריי המתוארות בסעיף 4.
3. לפני הניתוח, להעריך את סף נסיגת כפה המכני עם חוטי פון פריי כפי שתואר בסעיף 4.3. הערה: חזור על התהליך בימים נפרדים לפחות עד שלושה ערכים ברציפות יציבים מתקבלים לסף נסיגת כפה.
4. הקצה את העכברים לקבוצות ניסוי השונים, כך שקבוצות אלה אינן בתחילה שונים לסף נסיגת כפה.

2. הליך ניתוח לקאף Implantatiעל

1. לשקול את בעלי החיים. הערה: משקל גוף עכבר צריך להיות מעל 20 גרם להליך החדרת שרוול המתואר להלן.
2. להרדים את החיה עם זריקת intraperitoneal של 4 מיליליטר / קילוגרם של תערובת של קטמין (17 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (2.5 מ"ג / מיליליטר) ב0.9% NaCl, המספק -45 דקות של הרדמה.
3. בדוק את היעדר רפלקסים כפה על ידי צביטת כף אחורית עם פינצטה ולבדוק את היעדר רפלקסים העין לוודא כי בעלי החיים הוא בהרדמה מלאה.
4. לגלח את רגל ימין מהברך למפרק הירך באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
5. החל ג'ל נוזלי העין מגן לעיניים עם מקל אוזניים.
6. מניחים את החיה על צידו השמאלי ולמקם את הגפיים אחוריות ממש על כרית קטנה ולשמור על הגפיים אחוריות זכות לכרית עם דבק.
7. לחטא את שדה הניתוח עם כלורהקסידין ו70% אתנול באמצעות תחבושת או מקל אוזניים.
8. מצא את עצם הירך באמצעות האצבע ולעשותחתך של כ 0.5 סנטימטר, במקביל לעצם הירך וכ 1.5 מ"מ הקדמי לעצם הירך.
9. הפרד את השרירים קרובים לעצם הירך עם שני מקלות autoclaved. הערות: אין לחתוך את השריר. בדרך כלל, את שכבות השרירים להפריד בקלות וללא דימום וגיד הנשה הוא לאחר מכן נראה לעין. במקרה של דימום, יש להשתמש במקל אוזני סטרילי כדי לספוג את הדם.
10. הכנס שני מקלות autoclaved מתחת לעצב השת לחשוף הסניף הראשי שלה, וללחלח את העצבים עם תמיסה סטרילית פיזיולוגית (0.9% NaCl).
11. החזק את סעיף 2 מ"מ סטרילי מוכן מראש של צינורות פיצול 20-PE פוליאתילן (שרוול), מזהה 0.38 מ"מ / מ"מ OD 1.09, בעזרת פלדת מקל מחודד ומהדק בולדוג.
    1. הכנס את פלדת המקל המחודד לשרוול, שיהיה מעט לפתוח אותו.
    2. באמצעות הפתיחה לרוחב השרוול, הכנס את בולדוג בקצה אחד של השרוול ומקביל לשרוול. סובב את בולדוג (180 מעלות) כך שהוא יקיים את השרוול על ידיצד שהוא ההפך לפתיחה לרוחב. סגור את בולדוג ולהסיר פלדת המקל המחודד. הערה: הסיבוב נעשה כדי לאפשר מחזיק בשרוול בעמדה מותאמת להחדרה, מהדק בולדוג גם עוזר לשמור על השרוול בחלקו פתוח. הדגם והגודל של מהדק בולדוג הם קריטיים עבור שלב זה של ההליך.
12. יש לי הנסיין שני להחזיק את שני מקלות בעצב ובעדינות להפריד את המקלות כדי להקל על הגישה לקטע של עצב השת שאורכו כ -4 מ"מ.
13. הכנס את שרוול 2 מ"מ סביב הסניף הראשי של העצב השת, החל על ידי הוספת חלק מהשרוול, כי הוא דיסטלי לבולדוג סביב החלק של העצב שהוא הפרוקסימלי לירך.
14. סגור את השרוול בעדינות על ידי הפעלת לחץ על שני צדדים הדיסטלי שלה עם צבת, ללא סחיטה או שינוי הצורה של הצינור. הפעל את השרוול כדי לוודא שהוא סגור בצורה נכונה.
15. תפרת את שנינות שכבת עור המגולחתקשרים כירורגית שעות.
16. מניחים את העכבר בצד השמאלי שלה בכלוב בבית נקי. שמור אותו תחת מנורת החום עד שהעכבר הוא ער.
17. מוסיף מים נוספים ולהציב כמה אוכל ישירות בכלוב בבית.

3. הליך ניתוח לבקרת Sham

1. להחיל את אותו הליך הניתוח כפי שתואר לעיל מהשלב 2.1 לשלב 2.9, ולאחר מכן פעל בצעדים 2.15-2.17. לבקרות אחיזת עיניים, להשמיט את הצעדים 2.10-2.14 כי רק דאגה החדרת השרוול.

4. פון פריי בדיקה

1. מקם את העכברים בקופסות ברורות בודדות (7 ס"מ X 9 ס"מ X 7 ס"מ) עם חורים, על צלחת מחוררת גבוהה של נירוסטה חלקה (MX 1 50 סנטימטר, 5 נקבי מעגל מ"מ עם 2.5 מ"מ בין גבולות ניקוב). הערה: עד 12 עכברים ניתן לבדוק במקביל על זה הגדרה. ניתן לבדוק בעלי חיים המופעלים ביום שלאחר הניתוח. עם זאת, 3 ימים של התאוששות מומלצים לצמצם את רגישות יתר לאחר הניתוח נצפה בבקרות אחיזת עיניים.
2. לאפשר לבעלים החיים כדי להרגיל ל15 דקות לפני הבדיקה.
3. להחיל את חוטי פון פריי אל פני השטח הפלנטרי של כל כף רגל אחורית בסדרה של כוחות עולים. הערות: חוטי פון פריי הם שערות פלסטיק בקטרים ​​מכוילים. הם ארוכים 5 ס"מ והם קבועים באפליקטורים החזיק ביד. המהירות של יישום נימה, את מידת כיפוף ואת משך הזמן של היישום יכולה להשפיע על ערכי הסף שמתקבלים בבדיקה זו ^3. בהליך הנוכחי בעכברים, החוטים המשמשים לרוב הם 0.16, 0.4, 0.6, 1, 1.4, 2, 4, 6, 8, ו10 גרם.
   1. להחיל את נימה שנבחרה אל פני השטח הפלנטרי של כף רגל השמאל עד לנימה פשוט מתכופפת. לחזור על התהליך שלושה עד חמש פעמים ברציפות, ולאחר מכן לעשות את אותו הדבר לכפה הימנית. ברגע שהנימה נבדקה בשני כפות, לבדוק את החיה הבאה. הערות: יש להימנע מגבולות לרוחב כף שיכולה להיות רגישים יותר. התגובה הצפויה היא כפהנסיגה, רתיעה פתאומית או ליקוק כפות. קחו למשל את התגובה כחיובית אם לפחות שלוש תגובות צפויות הם נצפו מתוך חמישה ניסויים. כפה נתון תמיד נבדקה שלוש פעמים, אבל את התגובה הרביעית והחמישיים הניסויים נעשים רק אם 1 או 2 (ים) הייתה (היו) שנצפה במהלך שלושת המבחנים הראשונים. בעכברי C57BL/6J, להתחיל בדיקות טרום ניתוח עם נימה 1.4 גרם. לאחר ניתוח, להתחיל את הבדיקות עם נימה 0.4 גרם. אם תשובה חיובית הוא ציין עם נימה בדקה הראשונה, לבדוק את החוט בכוח נמוך יותר (במקום גדול יותר) בכל צעד של 4.3.2.
   2. להחיל את אותו חוט לבעלי החיים הבאים על פי הנוהל 4.3.1. ברגע שכל בעלי החיים שנבדקו, להתחיל שוב על החיה הראשונה עם נימה הבאה של כוח גדול יותר. חזור על התהליך עד שכל העכברים לתת תשובה חיובית. הערות: מבחן כל חיה עד שני חוטים ברציפות לתת תשובה חיובית. קחו למשל את ערך גרם של חוט הלהט הנמוך שנתן תשובה חיובית כשנינות כפהסף hdrawal לחיה הזו.

תוצאות

הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ניתוח רב גורם של שונות (ANOVA) או מבחני t מזווגים בהתאם לעיצוב ניסיוני. לניתוחים אלו, קבוצות ניתוח הדמה וחפת וכן תמיסת מלח לעומת טיפולים תרופתיים נחשבו כגורמים בין הקבוצות. בעת צורך, ניתוחים חוזרים ונשנים מידה שימשו לנתונים כמובן זמן. השוואות post hoc-בוצעו באמצעות מבחן דאנקן. מובהקות סטטיסטיים נחשבת בעמ '<0.05.

בעת השימוש בהליכים המתוארים לעיל, תוצאות השתלת השרוול באלודיניה ipsilateral כפי שמודגמים באיור 1. ברגע שהעכבר רגיל להליך הבדיקה, ערכי סף נסיגת כפה במבחן פון פריי יישארו יציבים לאורך זמן והם אינו מושפע מההליך הכירורגי כשלעצמה, כפי שמודגם בבעלי חיים שאם. זה צריך עם זאת להיותיצוין, כי אלודיניה לאחר ניתוח חולף בדרך כלל ניתן שנצפתה בעכברים שאם. כאשר אלודיניה זה נוכח, תגובת נסיגת הכפה חוזרת לבסיס לאחר כמה ימים לאחר ניתוח. בעכברי חפת, אלודיניה ipsilateral הוא כבר נמצא בניתוח שלאחר הימים הראשונים ונשמרה במשך יותר מ 2 חודשים (ראו 9, ואיור 1; F8, 344 = 29.5, p <0.001). אלודיניה-Induced השרוול נשארה ipsilateral בעכברי C57BL/6J כאשר הוא נמדד על ידי בדיקת פון פריי כפי שתואר לעיל, אבל בתנאים אחרים נוכחות של אלודיניה על הכף הנגדית יכולה להיות גם ציינה ^8. הערכים מוחלטים לנקודת התחלה הם בדרך כלל בין 4 ל 6 גרם בעכברי C57BL/6J, אבל פרוטוקול הבדיקה עשוי להשפיע על ערכים אלה.

תרופות נוגדות דיכאון טריציקליות הם בין טיפולי קו הראשון קליניים לכאב נוירופתי. במודל זה, r nortriptyline התרופה נוגד דיכאון טריציקליות (5 מ"ג / קילוגרם, intraperitoneal, פעמיים ביום)elieves אלודיניה נוירופתי לאחר כ -2 שבועות של טיפול, כפי שמודגם באיור 2 (F7, 91 = 15.3, p <0.001; שלאחר מעשה: (CuffNor = Sham)> CuffSal בp <0.001 בימים 29-34). במינון זה, שום פעולת משכך כאבים חריפה של תרופות נוגדות דיכאון הוא ציין ^16,17. כדי לחקות את ההקלה בכאב המתמשכת שקיימות בחולים שנטל תרופות מסוג זה, ניתן לבדוק את העכברים לפני מתן התרופה בבוקר ולא אחרי. הליך כזה מאפשר הערכה של השפעה לטווח ארוך על ידי דרוכה ימים קודמים של טיפול. במקרה זה, זה דורש 1 עד 2 שבועות של טיפול כדי לבחון הקלה מתמשכת של אלודיניה נוירופתי. כאשר הטיפול נקטע, הישנות נשמרת בדרך כלל בתוך 3 עד 4 ימים ^18. לצד כמה תרופות נוגדות דיכאון, gabapentinoids הם הטיפולים ראשון הברירה האחרות לכאב נוירופתי. יש gabapentin פעולת משכך כאבים אקוטית וחולפת במודל זה ^16, אבל זה גם מציג לון מתעכב ו פעולת antiallodynic כאשר בודק את בעלי החיים בכל יום לפני מתן התרופה (p <0.001 איור 3) שנמשך-g. פעולה זו היא מהירה יותר מאשר בתרופות נוגדות דיכאון.

ספי נסיגת כפת איור 1. מכאני במודל השרוול בכאב עצבי בעכברים. עכברי C57BL/6J זכר מבוגרים היו מורגלים להליך פון פריי עד בסיס יציב הושג (הבסיס מיוצג בשלב 0 בגרף). שני כפות נבדקו. עכברי קאף להציג אלודיניה מכאנית ipsilateral כהראה על ידי הספים הורידו נסיגת כפה (n = 10 לכל קבוצה).

"/> Tp_upload/51608/51608fig2.jpg
פעולת antiallodynic איור 2. מושהה של תרופות נוגדות דיכאון טריציקליות. אחרי שבועיים שלאחר ניתוח, עכברים קיבלו טיפול intraperitoneal פעמיים ביום (בוקר וערב) עם או NaCl 0.9% או 5 מ"ג / hydrochloride nortriptyline קילוגרם (n = 5 או 6 לכל קבוצה ). מבחן פון פריי נעשה לפני הטיפול בבוקר. עם הליך זה, פעולת antiallodynic מאוחרת של nortriptyline הוא ציין, שדורש סביב 12 ימים של טיפול.

איור 3. פעולת Antiallodynic של gabapentinoid. אחרי שלושה שבועות שלאחר ניתוח, עכברים קיבלו טיפול intraperitoneal פעמיים ביום (בוקר וערב) עם או NaCl 0.9% או 10 מ"ג / קילוגרם gabapentin (n = 5 לכל קבוצה). מבחן פון פריי נעשה לפני פינוק בוקרment. עם הליך זה, פעולת antiallodynic מתעכבת ומתמשכת של gabapentin הוא ציין. הנתונים מוצגים לפני תחילת הטיפולים וביום ה -6 של טיפולים.

Discussion

המודל "השרוול" פותח בתחילה בחולדות כדי להשיג פגיעת התכווצות כרונית סטנדרטית ולשעתק עם ההשתלה של אזיקים רבים ברחבי העצב השת ^6. לאחר מכן הוא עבר שינוי כדי להשתיל שרוול אחד ^7,8, למרות שחלק מקבוצות המחקר עדיין להשתמש בהכנסת שרוול מספר ^19-22. לאחר מכן הוא הותאם לעכברי ^9,23, שפתחו את האפשרות להשתמש בבעלי חיים מהונדסים. השרוול הוא בדרך כלל ארוך 2 מ"מ, אך אורכים אחרים יש גם שימשו בחולדות ^22. צינורות פוליאתילן תלויים במינים: PE-20 בעכברים ^9, ו-PE-60 ^24,25 או PE-90 ^7,8,26,27 בחולדות.

אלודיניה מכאנית נמדדת עם שערות פון פריי. בבדיקה זו, הערכים מוחלטים לערכי סף נסיגת כפה עשויים להיות תלויים במשטח שעליו עומד בעלי החיים ²⁸ או על משך הזמן של נימה כיפוף ^3, אך גורמים אלה לאלהשפיע על זיהוי של אלודיניה נוירופתי.

מודל "השרוול" הוא עניין למחקר של מנגנוני כאב נוירופתי. זה היה בשימוש ללמוד שינויים מורפולוגיים בסיבי myelinated וunmyelinated ^6,29, ושינויים תפקודיים בעצב סנסורי, afferents הראשונית ותאי עצב בעמוד השדרה ^{19,21,22,30-35.} זה אפשר הפגנה כי הפעלת גליה ושינוי מרכזי בשיפוע אניון העצבי להשתתף בשינויים בפעילות ובתגובות של נוירונים nociceptive השדרה ובאלודיניה נוירופתי ^24,36-38. ההשפעה של קולטני גלוטמט ^7,39-41, של קולטנים אופיואידים ^16,42-45 ושל קולטנים ניקוטינית ⁴⁶ הייתה גם למדה במודל זה.

עניין נוסף של המודל הוא את תגובתה לטיפולים השוטפים בכאב עצבי, כלומר., gabapentinoids ותרופות נוגדות דיכאון. בדומה לתצפיות קליניות: gabapentinoids להציג שניn פעולה אקוטית לטווח קצרה במשככי כאבים במינון גבוה ועכב ספגה פעולה להקלה שהוא ציין לאחר כמה ימים של טיפול, תרופות טריציקליות וספיגה חוזרת של סרוטונין ונוראדרנלין יש מעכבים שום אפקט משכך כאבים חריפים במינון רלוונטי אבל הם מציגים עכבו נגרמו להקלה פעולה שדורשת 1 עד 2 שבועות של טיפול, ופלואוקסטין מעכבי הספיגה החוזרת של סרוטונין אינה יעילה ^16. המודל הוא אפוא ראוי ללמוד את המנגנון המולקולרי שבבסיס טיפולים אלה ^{16-18,44,45,47,} אשר עשויים לחשוף את המטרות טיפוליות חדשות לבדיקה בחולים ^48-51.

לבסוף, המודל גם מאפשר הלימוד של השלכות anxiodepressive בכאב עצבי. מבחינה קלינית, תוצאות אלה משפיעות על כשליש מחולי כאב נוירופתי אך preclinically פחות למדו מההיבטים חושיים של כאב. במודל זה, התפתחות כמו חרדה והדיכאון תלוי זמןפנוטיפים כמו sive-נוכח ⁵² והמנגנון הקשור ובכך ניתן לטפל.

האזיקים תקניים ונהלים במודל של עכברים זה בכאב עצבי לגרום השתנות interindividual נמוכות לאלודיניה מכאנית. האפשרות להשתמש בבעלי חיים מהונדסים גנטי ^{17,18,44-47,52,} אלודיניה לטווח הארוכה, התגובה לטיפולים בשימוש קלינית ואת הפיתוח של סימפטומים anxiodepressive תלוי הזמן להפוך את המודל הזה מתאים ללימוד ההיבטים השונים ו השלכות של כאב נוירופתי והטיפולים שלה, שכבר הביאו מידע רב ערך בתחום זה של מחקר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE-20 polyethylene tubing	Harvard Apparatus	PY2-59-8323	Splitted before surgery
Ketamine	Centravet	IMA004
Xylazine HCl	Sigma	X1251	Freshly prepared before surgery
Ocry-gel	Centravet
Pliers	FST	11003-12	52.5 mm straight
Bulldog clamp	FST	p130 18038-45
Perforated plate	CTTM
von Frey filaments	Bioseb	NC-12775