Седалищный нерв наручников Модель нейропатической боли у мышей

Резюме

Невропатическая боль является следствием поражения или заболевания, влияющего на систему соматосенсорной. "Манжеты модель" невропатической боли у мышей состоит из имплантации полиэтиленовой манжеты вокруг главной ветви седалищного нерва. Механическая аллодиния проверяется с использованием фон Фрея нитей.

Аннотация

Невропатическая боль возникает как следствие поражения или заболевания, влияющего на систему соматосенсорной. Результаты этого синдрома от неадекватных изменений в поврежденных сенсорных нейронов и вдоль всей ноцицептивной пути внутри центральной нервной системы. Это, как правило хроническим и сложной для лечения. С целью изучения невропатической боли и ее лечения, различные модели были разработаны в грызунов. Эти модели являются производными от известных этиологии, воспроизводя повреждений периферических нервов, центральные травм и метаболические-, инфекционные или химиотерапии, связанных невропатии. Мышиные модели травмы периферического нерва часто нацелены на седалищный нерв, который легко получить доступ и позволяет ноцицептивные тесты на заднюю лапу. Эти модели основаны на сжатие и / или секции. Здесь подробная процедура хирургии для "манжеты модели" нейропатической боли у мышей описан. В этой модели, манжеты из ПЭ-20 полиэтиленовой трубкой стандартизированной длины (2 мм) является в одностороннем порядке яmplanted вокруг главной ветви седалищного нерва. Это индуцирует длительную механическую аллодинии, то есть., Ноцицептивной реакции к нормально не-ноцицептивной стимул, который может быть оценена с использованием фон Фрея нитей. Помимо подробных процедур по хирургии и тестирования, также обсуждаются интерес этой модели для изучения нейропатической механизма боли, для изучения нейропатической боли сенсорные и anxiodepressive аспекты, и для изучения нейропатическими лечения боли.

Введение

Невропатическая боль, как правило, хроническое и возникает как следствие поражения или заболевания, влияющего на систему соматосенсорной. Неадаптивные изменения в поврежденных сенсорных нейронов и вдоль всей ноцицептивной пути в пределах центральной нервной системы участвовать в этом сложном синдрома. Различные модели были разработаны на грызунах для изучения нейропатической боли и ее лечения ^1-3.

На основе известных этиологии, моделей нейропатической боли направлены на имитируя полинейропатии наблюдается при сахарном диабете, травмы периферических нервов, центральных травм, тройничного нерва, в невропатии подряд к химиотерапии, пост-герпетической невралгии, и т.д. Различные модели травмы периферических нервов у грызунов сосредоточиться на седалищный нерв. Эти модели зависит от сжатия и / или части этого нерва. Действительно, седалищный нерв дает относительную легкий хирургии и позволяет для испытаний, основанных на лапу отмены рефлексов. МоДЕЛЬЗ сжатия хронического нервного включают, например: хронический травмы сужения (CCI) ^4,5, седалищный нерв наручников ^6-9, частичное седалищного нерва перевязка (PSL) ^10, спинной перевязки нерва (SNL) ¹¹ или общая малоберцовый нерв перевязки ^12. Модели называются "пощадил повреждения нерва" (SNI) также широко используются. Они состоят из плотной перевязки и аксотомии двух из трех конечных ветвей седалищного нерва, в то время как третья ветвь остается неизменным ^13-15. Различные модели невропатической боли, которые нацелены на седалищный нерв, привести к хронической механической аллодинии (ноцицептивная ответ на нормально не ноцицептивной стимул) на поврежденной задней лапы.

Здесь подробная процедура хирургии для "манжеты модели" нейропатической боли у мышей описан. Она заключается в имплантации полиэтиленовой манжеты вокруг главной ветви седалищного нерва ^6-9. Чтэ использование фон Фрея нитей также описывается. Эти нити позволит оценить механическую аллодинию который является длительный ноцицептивная симптом присутствует в этой модели.

протокол

Протоколы были одобрены "Comite d'Ethique ан MATIERE d'экспериментов Animale де Страсбурге" (CREMEAS).

1. Исходные Измерение Paw Вывод порогов

1. Разрешить мыши, чтобы приучить к объектам животного не менее 10 дней до 2 недель до начала процедуры тестирования.
2. Приучить мышей к фон Фрей тестирования установки и в порядке, фон Фрея, которые описаны в разделе 4.
3. До операции, оценивать пороги механические лапы отмены с фон Фрея нитей, как описано в разделе 4.3. Примечание: Повторите процедуру в отдельные дни до, по крайней мере, три стабильные последовательные значения не будут получены для порогов отдергивания лапы.
4. Назначьте мышей различных экспериментальных групп таким образом, чтобы эти группы не изначально отличаются для порогов отдергивания лапы.

2. Процедура Хирургия для манжеты имплантацияна

1. Взвесьте животное. Примечание: Вес мыши тело должно быть более 20 г в течение процедуры введения манжеты, описанной ниже.
2. Обезболить животное с внутрибрюшинной инъекцией 4 мл / кг смеси кетамина (17 мг / мл) и ксилазина (2,5 мг / мл) в 0,9% NaCl, который обеспечивает около 45 мин анестезии.
3. Проверьте отсутствие лап рефлексов, зажимая в заднюю лапу с помощью пинцета и проверьте отсутствие глазных рефлексов, чтобы убедиться, что животное полностью под наркозом.
4. Бритье правую ногу от колена до бедра с помощью аппарата для бритвы.
5. Применить защитные очки жидкий гель для глаз с ватным тампоном.
6. Место животное на левый бок и положите на правую заднюю конечность на подушечке и поддерживать правую заднюю конечность на подушку с помощью клейкой ленты.
7. Лечить операционное поле хлоргексидином и 70% этанола, используя марлевый тампон или ватным тампоном.
8. Найти бедренную кость указательный и сделатьразрез приблизительно 0,5 см, параллельно бедренной кости и примерно 1,5 мм кпереди от бедренной кости.
9. Отделите мышцы, близкие к бедренной кости с двумя автоклавного палками. Примечания: Никогда не срезайте мышцы. Как правило, мышечные слои отделить легко, без кровотечений и седалищный нерв становится видимым. В случае кровотечения, использовать стерильную ватным тампоном, чтобы поглотить кровь.
10. Вставьте две автоклавного палки ниже седалищного нерва, чтобы выставить свою основную ветку, и увлажняют нерв с помощью стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl).
11. Удерживая предварительно подготовленную стерильную 2 мм секцию разделенного PE-20 полиэтиленовой трубкой (манжеты), 0,38 мм ID / 1,09 мм Диаметр, с помощью заостренного стали палки и бульдожьего зажима.
    1. Вставьте заостренный стальной палкой в ​​манжету, которая приоткроет его.
    2. Использование манжеты боковое отверстие, вставьте бульдог на одном конце манжеты и параллельно манжеты. Поверните бульдог (180 °), так что она будет проводить манжету насторона, противоположная к боковым отверстием. Закройте бульдог и снимите острый стальной палкой. Примечание: Вращение осуществляется для обеспечения проведения-на манжете в оптимизированном позиции для вставки, бульдог зажим также помогает поддерживать манжету частично открыта. Модель и размер бульдог зажима являются критическими для этого этапа процедуры.
12. Есть второй экспериментатор провести две палочки под нерва и осторожно отделить палочки для облегчения доступа к части седалищного нерва, который долго около 4 мм.
13. Вставьте 2 мм манжету вокруг главной ветви седалищного нерва, начиная путем вставки часть манжеты, который дистальнее бульдоге вокруг части нерва, который является ближайшим к бедру.
14. Закройте манжету мягко, оказывая давление на своих двух дистальных сторон с плоскогубцами, не сжимая или изменения формы трубки. Поверните манжету, чтобы она плотно закрыт.
15. Шовный бритая слой кожи остроумиеч хирургические узлы.
16. Место мыши на левый бок в чистом доме клетку. Держите его под инфракрасной лампой, пока мышь не бодрствует.
17. Добавить дополнительную воду и поместите некоторые чау непосредственно в домашнюю клетку.

3. Процедура Хирургия для Sham управления

1. Применить ту же процедуру хирургии, как описано выше, начиная с шага 2.1 к шагу 2.9, а затем следуйте с шагом 2,15 до 2,17. Для управления фиктивных, опустить шаги с 2,10 до 2,14, что единственной заботой вставки манжеты.

4. Фон Фрея Тестирование

1. Поместите мышей в четких индивидуальных ящиков (7 см х 9 см х 7 см) с отверстиями, на возвышенности перфорированную пластину гладкой нержавеющей стали (1 м х 50 см, 5 перфорации мм окружности с 2,5 мм между перфорации границ). Примечание: До 12 мышей можно одновременно протестирован на этой установке. Оперированных животных могут быть проверены на следующий день после операции. Тем не менее, 3 дня восстановления рекомендуется уменьшить после операции гиперчувствительность наблюдается вфиктивных управления.
2. Разрешить животные приучить в течение 15 мин до тестирования.
3. Применение нитей фон Фрея в подошвенную поверхность задней лапы каждой из серии восходящих сил. Примечания: Нити фон Фрей пластиковые волосы калиброванных диаметров. Они имеют длину 5 см и крепятся на ручных аппликаторов. Скорость применения нитей, степень изгиба и продолжительности применения могут влиять на пороговых значений, получаемой с этим тестом ^3. В соответствии с настоящим процедуры у мышей, нити, которые наиболее часто используемые 0,16, 0,4, 0,6, 1, 1,4, 2, 4, 6, 8 и 10 г.
   1. Применить выбранную нить в подошвенную поверхность левой лапы, пока нить не только изгибается. Процедуру повторить 4:57 раза подряд, а затем сделать то же самое для правой лапы. После того, как нить была протестирована на обеих лапах, станет испытанием для следующего животное. Примечания: Избегайте лап боковые границы, которые могут быть более чувствительны. Ожидаемый ответ лапаВывод, вдруг дрогнув или лапа лизать. Рассмотрим реакцию как положительным, если по крайней мере три ожидаемые ответы наблюдаются из пяти испытаний. Данный лапа всегда проверяется три раза, но четвертый и пятый испытания сделано только если 1 или 2 ответа (ы) был (были) наблюдается в течение первых трех тестов. В мышей C57BL/6J, начать заранее хирургии тесты с 1,4 г нити. После операции, начать испытания с 0,4 г нити. Если положительный ответ наблюдается с первой испытанной нити, проверить нить нижнего силу (вместо более) на шаге 4.3.2.
   2. Применить же нити в следующих животных в соответствии с процедурой 4.3.1. После того как все животные испытывают, снова начать на первом животного со следующей нити большей силой. Повторите эту процедуру, пока все мыши не дал положительного ответа. Примечания: Test каждого животного, пока два последовательных нити не дают положительный ответ. Рассмотрим значение грамм нижней нити, которая дала положительный ответ, как лапы остроумияhdrawal порог для этого животного.

Результаты

Данные выражены как среднее ± SEM. Статистический анализ проводили с использованием многофакторной анализа дисперсии (ANOVA) или непарные т-тесты в соответствии с экспериментальной конструкции. Для этих анализов, после ложной и манжеты хирургии группы, а также солевой против медикаментозного лечения считались между группами факторов. При необходимости, повторные анализы измерения использовались для данных время курса. Сравнения пост-специальных проводились с использованием тест Дункана. Статистическая значимость была рассмотрена на р <0,05.

При использовании процедур, описанных выше, манжета имплантации приводит к ипсилатеральной аллодинии, как показано на рисунке 1. Как только мышь приучали к процедуре тестирования, значения порогов отдергивания лапы в тесте фон Фрея остаются стабильными с течением времени и являются не зависит от хирургического вмешательства по себе, как показано на Sham животных. Однако следует иметьотметил, что временный послеоперационный аллодинию обычно можно наблюдать в Шам мышей. Когда такой аллодинию присутствует, ответ лапа вывод возвращает к исходному уровню через несколько дней после операции. У мышей манжеты, ипсилатеральная аллодинию уже присутствует в первые дни после операции и сохраняется в течение более 2 месяцев (см. 9, и на рисунке 1; F8, 344 = 29,5, р <0,001). Манжета-индуцированной аллодиния остается на той же стороне в мышей C57BL/6J, когда оно измерено испытанием фон Фрея, как описано выше, но в других условиях наличие аллодинии на контралатеральной лапы можно наблюдать ^8. Абсолютные значения для базовой линии, как правило, между 4 и 6 г в мышей C57BL/6J, но протокол испытания могут влиять на приведенные данные.

Трициклические антидепрессанты являются одними стационарного лечения первого ряда для нейропатической боли. В этой модели трициклический антидепрессант нортриптилин препарат (5 мг / кг, внутрибрюшинно, дважды в день) гelieves невропатической аллодинию примерно через 2 недели лечения, как показано на рисунке 2 (F7, 91 = 15,3, р <0,001; пост-Hoc: (CuffNor = Шам)> CuffSal при р <0,001 в дни 29 - 34). При этой дозе не острый анальгетик действие антидепрессанта не наблюдается ^16,17. Чтобы имитировать прочного облегчение боли, которая присутствует у пациентов, принимающих такие препараты, мыши могут быть проверены перед утренним введения препарата, а не после. Такая процедура позволяет оценить длительный эффект загрунтованную предыдущими дней лечения. В этом случае, он требует от 1 до 2 недель лечения наблюдать прочного облегчение невропатической аллодинии. Когда лечение прерывается, рецидив, как правило, наблюдается в течение 3-х до 4 дней ^18. Кроме некоторых антидепрессантов, gabapentinoids являются другие первого выбора лечения нейропатической боли. Габапентин имеет острую и переходные обезболивающее действие в этой модели ^16, но он также показывает замедленную и долгота г прочного antiallodynic действие при тестировании животное каждый день перед введением лекарственного средства (фиг. 3, р <0,001). Это действие быстрее, чем с антидепрессантов.

Фигура 1. Механический пороги отдергивания лапы в манжете модели невропатической боли у мышей. Взрослых самцов мышей C57BL/6J приучали к процедуре фон Фрея до достижения стабильной базовой линии не было получено (базовый представлена ​​в точке 0 на графике). Оба лапы были испытаны. Мыши манжеты отображения ипсилатеральную механическую аллодинию как показал на пониженных порогов лапу денег (п = 10 на группу).

tp_upload/51608/51608fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Задержка antiallodynic действие трициклическими антидепрессантами. После двух недель после операции, мыши получали внутрибрюшинную лечение два раза в день (утром и вечером) или с 0,9% NaCl или 5 мг / кг гидрохлорида нортриптилин (N = 5 или 6 на группу ). Тест фон Фрея было сделано перед утренним лечения. С помощью этой процедуры, с задержкой antiallodynic действие нортриптилина наблюдается, что требует около 12 дней лечения.

Рисунок 3. Antiallodynic действие gabapentinoid. После трех недель после операции, мыши получали внутрибрюшинную лечение два раза в день (утром и вечером) или с 0,9% NaCl или 10 мг / кг габапентин (п = 5 в группе). Тест фон Фрея было сделано перед утром леченияМент. С помощью этой процедуры, с задержкой и прочного antiallodynic действия габапентина наблюдается. Данные представлены перед началом лечения и в 6-й день лечения.

Обсуждение

Модель "манжеты" была первоначально разработана в крысах, чтобы получить стандартизированную и воспроизводимое хроническим повреждением сужения с имплантацией нескольких манжеты вокруг седалищного нерва ^6. Затем он был изменен, чтобы имплантировать один манжету ^7,8, хотя некоторые исследовательские группы по-прежнему использовать множественного ввода манжеты ^19-22. Затем он был адаптирован к мышей ^9,23, который открылся возможность использовать трансгенных животных. Манжета, как правило, длиной 2 мм, но другие длины также были использованы в крысах ^22. Трубка полиэтилен зависит от вида: PE-20 у мышей ⁹ и PE-60 ^24,25 или PE-90 ^7,8,26,27 у крыс.

Механическая аллодиния измеряется с волосков фон Фрея. В этом тесте, абсолютные значения для порогов отдергивания лапы может зависеть от поверхности, на которой стоит животное ²⁸ или от длительности нити изгиба ^3, но эти факторы невлияет на обнаружение невропатической аллодинии.

Модель "манжеты" представляет интерес для изучения невротических механизмов боли. Он был использован для изучения морфологических изменений в миелиновых и немиелинизированных волокон ^6,29 и функциональных изменений в сенсорных нейронах, первичных афферентов и нейронов спинного ^{19,21,22,30-35.} Это позволило демонстрация того, что глиальные активации и центральный сдвиг в нейронной аниона градиента участвовать в изменениях в деятельности и в ответах спинномозговых ноцицептивных нейронов и в нейропатической аллодинией ^24,36-38. Влияние рецепторов глутамата ^7,39-41, опиоидных рецепторов ^16,42-45 и никотиновых рецепторов ⁴⁶ был также учился в этой модели.

Другой интерес модели является его реакция на современные методы лечения невропатической боли, то есть., Gabapentinoids и антидепрессанты. Похожие на клинических наблюдениях: gabapentinoids отображать какн острая кратковременное действие болеутоляющее при высокой дозе и с задержкой устойчивый снятия действие, которое наблюдается после нескольких дней лечения, трициклических антидепрессантов и селективного серотонина и норадреналина обратного захвата ингибиторы не имеют острой обезболивающий эффект на соответствующей дозы, но они показывают с задержкой устойчивый освобождении действие, которое требует от 1 до 2 недель лечения и селективное ингибитор обратного захвата серотонина флуоксетин является неэффективным ^16. Модель, таким образом, уместно изучить молекулярный механизм, лежащий в основе этих методов лечения ^{16-18,44,45,47,} которая может раскрыть новые терапевтические цели для тестирования у пациентов ^48-51.

Наконец, модель также позволяет изучение anxiodepressive последствий нейропатической боли. Клинически эти последствия затрагивают около трети пациентов нейропатической боли, но доклинические менее изучены, чем сенсорные аспекты боли. В этой модели, зависит от времени развитие тревожности-как и депрессиейSIVE, как фенотипы присутствует ⁵² и соответствующий механизм Таким образом, можно решить.

Стандартизованные манжеты и процедуры в этой мыши модели невропатической боли приводят к низкой вариабельность для механической аллодинии. Возможность использования генетически модифицированных животных ^{17,18,44-47,52,} продолжительную аллодинию, ответ на клинически используемых процедур и зависит от времени развития anxiodepressive симптомов делают эту модель подходит для изучения различных аспектов и Последствия нейропатической боли и ее лечения, которые уже принесли ценную информацию для этой области исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE-20 polyethylene tubing	Harvard Apparatus	PY2-59-8323	Splitted before surgery
Ketamine	Centravet	IMA004
Xylazine HCl	Sigma	X1251	Freshly prepared before surgery
Ocry-gel	Centravet
Pliers	FST	11003-12	52.5 mm straight
Bulldog clamp	FST	p130 18038-45
Perforated plate	CTTM
von Frey filaments	Bioseb	NC-12775