Der Ischiasnerv cuffing Modell von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen

Zusammenfassung

Neuropathische Schmerzen sind die Folge einer Verletzung oder Erkrankung des somatosensorischen Systems. Die "Manschette Modell" von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen besteht aus der Implantation einer Polyethylen Manschette um den Hauptzweig des Ischiasnervs. Mechanische Allodynie wird mit Hilfe von Frey Filamente getestet.

Zusammenfassung

Neuropathischem Schmerz entsteht als Folge einer Verletzung oder einer Erkrankung des somatosensorischen Systems. Dieses Syndrom ist unpassenden Änderungen in verletzten sensorischen Neuronen und nozizeptiven entlang des gesamten Weges innerhalb des zentralen Nervensystems. Es ist in der Regel chronisch und schwierig zu behandeln. Um neuropathischen Schmerzen und ihre Behandlungen zu untersuchen, wurden verschiedene Modelle in Nagetieren entwickelt. Diese Modelle stammen aus bekannten Ursachen, so reproduzieren peripheren Nervenverletzungen, Zentral Verletzungen und Stoffwechsel-, Infektions-oder Chemotherapie bedingten Neuropathien. Murine Modelle von peripheren Nervenverletzungen oft Ziel der Ischiasnerv, die leicht zugänglich ist und ermöglicht nozizeptiven Tests an der Hinterpfote. Diese Modelle beruhen auf einer Kompression und / oder einem Abschnitt. Hier die detaillierte Chirurgie Verfahren für die "Manschette Modell" von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen beschrieben. In diesem Modell ist eine Manschette aus PE-20-Polyethylenschlauch standardisierter Länge (mm 2) einseitig irund um den Hauptzweig des Ischiasnervs mplanted. Es induziert einen lang anhaltenden mechanischen Allodynie, dh. Eine nozizeptive Reaktion auf einen normalerweise nicht-nozizeptiven Reiz, der durch die Verwendung von Frey Filamenten ausgewertet werden kann. Neben der detaillierten Operation und Testverfahren sind das Interesse dieses Modell für die Untersuchung von neuropathischem Schmerz Mechanismus für die Untersuchung von neuropathischen Schmerzen und Sinnes anxiodepressive Aspekte und für die Untersuchung von neuropathischen Schmerzbehandlungen diskutiert.

Einleitung

Neuropathischem Schmerz meist chronisch und entsteht als Folge einer Verletzung oder einer Erkrankung des somatosensorischen Systems. Maladaptive Änderungen in verletzten sensorischen Neuronen und nozizeptiven entlang der gesamten Bahn innerhalb des zentralen Nervensystems beteiligt in diesem Komplex Syndrom. Verschiedene Modelle wurden bei Nagetieren für das Studium von neuropathischen Schmerzen und ihre Behandlungen ^1-3 entwickelt.

Basierend auf bekannten Ursachen, die Modelle von neuropathischen Schmerzen zielen auf Nachahmung der in der Diabetes beobachtet Polyneuropathie, die Verletzungen der peripheren Nerven, die zentralen Verletzungen, die Trigeminusneuralgie, die Neuropathien in Folge der Chemotherapie, der Post-Zoster-Neuralgie, etc. Verschiedene Modelle der peripheren Nervenverletzungen bei Nagetieren konzentrieren sich auf den Ischiasnerv. Diese Modelle sind abhängig von einer Druck-und / oder ein Abschnitt dieser Nerv. Tatsächlich bietet der Ischiasnerv relativ einfache Operation und ermöglicht Tests, die auf Pfotenrückzugsreflexe. Die models der chronischen Nervenkompression gehören beispielsweise: die chronische Verengung Verletzungen (CCI) ^4,5, den Ischiasnerv cuffing ^6-9, die teilweise Ischiasnerv Ligation (PSL) ^10, die Spinalnerven-Ligation (SNL) ^11, oder die gemeinsame peronaeus ¹² Ligation. Models als "verschont Nervenverletzung" (SNI) bezeichnet werden, auch weit verbreitet. Sie bestehen aus einem festen Ligation und Axotomie von zwei der drei Endäste des Ischias-Nervs, während der dritte Zweig intakt bleibt ^13-15. Die verschiedenen Modelle von neuropathischen Schmerzen, die den Ischiasnerv zielen, führen zu einer chronischen mechanischen Allodynie (a nozizeptiven Reaktion auf eine normalerweise nicht-nozizeptiven Reiz) auf den verletzten Hinterpfote.

Hier die detaillierte Chirurgie Verfahren für die "Manschette Modell" von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen beschrieben. Es besteht in der Implantation eines Polyethylen-Manschette um den Hauptzweig des Ischiasnervs ^6-9. The Verwendung von Frey Filamente wird ebenfalls beschrieben. Diese Filamente erlauben die Beurteilung der mechanischen Allodynie, die eine lang anhaltende nozizeptiven Symptom bei diesem Modell vorhanden ist.

Protokoll

Protokolle wurden von der "comité d'éthique en matière d'Expérimentation animale de Strasbourg" (CREMEAS) genehmigt worden.

1. Baseline-Messung von Paw Widerrufsrecht Schwellenwerte

1. Lassen Sie die Maus an die Tieranlagen für mindestens 10 Tage vor Beginn der Testverfahren zu gewöhnen bis 2 Wochen.
2. Gewöhnen die Mäuse an den von-Frey-Test Set-up und an die, die in Abschnitt 4 beschrieben sind, von-Frey-Verfahren.
3. Vor der Operation, bewerten die mechanischen Pfotenrückzugsschwellen mit von-Frey-Filamenten, wie im Abschnitt 4.3 beschrieben. Hinweis: Wiederholen Sie den Vorgang an unterschiedlichen Tagen, bis mindestens drei aufeinanderfolgende Werte stabil sind Pfotenrückzugsschwellen erhalten.
4. Ordnen der Mäuse zu den verschiedenen Versuchsgruppen so, dass diese Gruppen nicht zunächst Pfotenrückzugsschwellen unterscheiden.

2. Chirurgie Verfahren für Cuff Implantatiauf

1. Wiegen Sie das Tier. Hinweis: Mouse Körpergewicht über 20 g für die unten beschriebene Manschette Einsetzen Verfahren.
2. Betäuben dem Tier eine intraperitoneale Injektion von 4 ml / kg einer Mischung aus Ketamin (17 mg / ml) und Xylazin (2,5 mg / ml) in 0,9% NaCl, die etwa 45 min von Anästhesie bietet.
3. Prüfen Sie die Abwesenheit von Pfote Reflexe durch Kneifen eine Hinterpfote mit einer Pinzette und überprüfen Sie die Abwesenheit von Augenreflexe, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt wird.
4. Rasieren Sie das rechte Bein vom Knie bis zur Hüfte mit einem elektrischen Rasierer.
5. Bewerben Schutz Auge flüssiges Gel für die Augen mit einem Wattestäbchen.
6. Legen Sie das Tier an seiner linken Seite und legen Sie den rechten Hinterschenkel in einem kleinen Kissen und Aufrechterhaltung der rechte Hinterschenkel, um das Kissen mit Klebeband.
7. Desinfizieren Sie den Bereich Chirurgie mit Chlorhexidin und 70% Ethanol mit Gaze oder Wattestäbchen.
8. Finden Sie die Oberschenkelknochen mit dem Zeigefinger und machen eineEinschnitt von ungefähr 0,5 cm, parallel zur Ober-und ca. 1,5 mm anterior zum Femur.
9. Trennen Sie die Muskeln in der Nähe des Oberschenkelknochens mit zwei autoklaviertem Sticks. Hinweise: Niemals die Muskeln. Normalerweise trennen sich die Muskelschichten einfach und ohne Blutungen und der Ischiasnerv ist dann sichtbar. Im Falle von Blutungen, eine sterile Wattestäbchen, um das Blut aufzufangen.
10. Legen Sie zwei autoklaviert-Sticks unter dem Ischiasnerv, seine Hauptniederlassung aussetzen, und Hydrat der Nerv mit einer sterilen physiologischen Lösung (0,9% NaCl).
11. Halten Sie die vorbereitete sterile 2 mm Abschnitt von Split PE-20-Polyethylenschlauch (Manschette), 0,38 mm ID / OD 1,09 mm, mit Hilfe eines spitzen Stahl-Stick und eine Bulldogge Klemme.
    1. Legen Sie die spitzen Stahl-Stick in die Manschette, die leicht zu öffnen wird.
    2. Mit der Manschette seitliche Öffnung, legen Sie die Bulldogge an einem Ende der Manschette und parallel zu der Manschette. Drehen Sie die Bulldogge (180 °), so dass es die Manschette durch die haltenSeite, die entgegengesetzt zu der seitlichen Öffnung ist. Schließen Sie die Bulldogge und entfernen Sie den spitzen Stahl-Stick. Hinweis: Die Rotation wird durchgeführt, um zu ermöglichen, hält auf der Manschette in einer optimierten Position zum Einsetzen wird die Klemmbull hilft auch, um die Manschette teilweise geöffnet zu halten. Das Modell und die Größe der Klammer bull kritisch sind für diesen Schritt des Verfahrens.
12. Eine zweite Versuchs halten die zwei Stöcke unter den Nerv und vorsichtig trennen die Stöcke, die den Zugang zu einem Teil der Ischiasnerv, der um 4 mm lang ist zu erleichtern.
13. Legen Sie die 2 mm Manschette um den Hauptzweig des Ischiasnervs ab, indem Sie den Teil der Manschette, die distal der Bulldogge um den Teil des Nerven, die proximal der Hüfte ist.
14. Schließen der Manschette leicht durch Ausüben von Druck auf die beiden distalen Seiten mit einer Zange ohne Quetschen oder Änderung der Form des Rohres. Drehen Sie die Manschette um sicherzustellen, dass sie richtig geschlossen ist.
15. Naht der rasierten Hautschicht Witzh chirurgischen Knoten.
16. Platzieren Sie die Maus auf der linken Seite in einem sauberen Käfig. Halten Sie es unter der Wärmelampe, bis die Maus wach ist.
17. Fügen Sie Zusatz Wasser und legen Sie etwas Futter direkt im Käfig.

3. Chirurgie Verfahren für die Sham-Kontrollen

1. Wenden Sie dieselbe Operation Verfahren wie oben zu Schritt 2,9, dann folgen mit Stufen 2,15-2,17 beschrieben ab Schritt 2.1. Für Scheinkontrollen, lassen Sie die Schritte von 2,10 bis 2,14, die einzige Sorge, die Manschette Insertion.

4. Von-Frey-Testing

1. Legen Sie die Mäuse in klaren Einzelboxen (7 cm x 9 cm x 7 cm) mit Löchern, auf einem erhöhten Lochplatte aus glattem Edelstahl (1 mx 50 cm, 5 mm Perforationen Kreis mit 2,5 mm Perforation zwischen Grenzen). Hinweis: Bis zu 12 Mäuse können gleichzeitig auf diesem Set-up getestet werden. Operierten Tiere können den Tag nach der Operation getestet werden. Allerdings sind 3 Tage Erholung empfohlen, die Überempfindlichkeit nach der Operation beobachtet verringernSchein-Kontrollen.
2. Lassen Sie die Tiere für 15 Minuten vor der Prüfung zu gewöhnen.
3. Wenden Sie die von Frey Filamente auf der Fußsohle jeder Hinterpfote in einer Reihe von aufsteigenden Kräfte. Hinweise: Die von Frey Filamente sind aus Kunststoff Haare von kalibrierten Durchmessern. Sie sind 5 cm lang und sind an Hand-Applikatoren fixiert. Die Geschwindigkeit des Faden Anwendung kann das Ausmaß der Biegung und der Dauer der Anwendung der Schwellenwerte, die mit diesem Test ³ erhaltenen beeinflussen. Bei dem vorliegenden Verfahren in Mäusen, die Filamente, die die am häufigsten verwendet werden, sind 0,16, 0,4, 0,6, 1, 1,4, 2, 4, 6, 8 und 10 g.
   1. Tragen Sie die gewählte Filament auf die Fußsohle des linken Pfote, bis der Faden gerade biegt. Wiederholen Sie den Vorgang drei vor fünf Mal hintereinander, und dann das gleiche zu tun, um die rechte Pfote. Sobald der Faden auf beiden Pfoten getestet, testen Sie die nächste Tier. Hinweise: Vermeiden Pfote Seitenränder, die empfindlicher sein. Die erwartete Antwort ist eine PfoteRückzug, plötzliche Zucken oder Pfote leckt. Betrachten wir die Antwort als positiv, wenn mindestens drei erwarteten Antworten von fünf Studien beobachtet. Eine gegebene Pfote immer drei Mal getestet, aber die vierte und die fünfte Studien durchgeführt werden, wenn nur 1 oder 2 Antwort (en) war (en) in den ersten drei Tests beobachtet. In C57BL/6J-Mäusen, starten Sie die Tests vor der Operation mit dem 1,4 g Filaments. Nach der Operation beginnen die Tests mit dem 0,4 g Filaments. Wenn eine positive Antwort mit der ersten getestet Faden beobachtet sich, ein Filament geringere Kraft (statt mehr) in Schritt 4.3.2.
   2. Die gleiche Faden zu den nächsten Tieren nach dem Verfahren 4.3.1. Sobald alle Tiere getestet werden, starten wieder auf dem ersten Tier mit dem nächsten Faden der größeren Kraft. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Mäuse eine positive Antwort. Hinweise: Test jedes Tier bis zwei aufeinander folgende Filamente eine positive Antwort. Betrachten Sie das Gramm Wert der unteren Faden, die eine positive Antwort als die Pfote Witz gabhdrawal Schwellenwert für dieses Tier.

Ergebnisse

Die Daten sind angegeben als Mittelwert ± SEM. Statistische Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung von Multi-Faktor-Varianzanalyse (ANOVA) oder ungepaarten t-Tests in Übereinstimmung mit dem experimentellen Design. Für diese Analysen wurden die Sham und Cuff Chirurgie Gruppen sowie die Kochsalzlösung gegen medikamentöse Behandlungen wie zwischen den Gruppen Faktoren berücksichtigt. Gegebenenfalls wurden wiederholt Maßnahme Analysen für die Zeitverlaufsdaten verwendet. Die Post-hoc-Vergleiche wurden mit dem Duncan-Test. Statistische Signifikanz wurde bei p <0,05 betrachtet.

Bei Verwendung der Verfahren, die oben beschrieben sind, die Manschette Implantation führt zu einer ipsilateralen Allodynie wie in Fig. 1 dargestellt. Sobald die Maus an den Testverfahren gewöhnt sind, die Werte für Pfotenrückzugsschwellen in der Von-Frey-Test stabil über die Zeit und nicht von der Operation an sich betroffen, wie in Sham Tieren dargestellt. Es sollte jedoch seindarauf hingewiesen, dass eine vorübergehende postoperative Allodynie können in der Regel in Sham-Mäusen beobachtet werden. Wenn solche Allodynie vorhanden ist, gibt die Pfotenrückzugs Reaktion auf die Grundlinie nach ein paar Tagen nach der Operation. In Cuff Mäusen ist die ipsilaterale Allodynie bereits vorhanden ist am ersten Tag nach der Operation und ist für mehr als 2 Monate gehalten (siehe 9 und 1; F8, 344 = 29,5, p <0,001). Die Manschette Allodynie bleibt ipsilaterale in C57BL/6J Mäusen, wenn es von dem von-Frey-Test wie oben beschrieben bestimmt, aber unter anderen Bedingungen eine Gegenwart Allodynie auf der kontralateralen Pfote können ebenfalls beobachtet werden ^8. Die absoluten Werte für die Baseline sind in der Regel zwischen 4 und 6 g in C57BL/6J-Mäusen, aber die Testprotokoll kann diese Werte beeinflussen.

Trizyklische Antidepressiva gehören klinische First-Line-Behandlung von neuropathischen Schmerzen. In diesem Modell, das trizyklische Antidepressivum Nortriptylin (5 mg / kg, intraperitoneale, zweimal täglich) relieves neuropathischen Allodynie nach ca. 2 Wochen der Behandlung, wie in Fig. 2 dargestellt ist (F7, 91 = 15,3, p <0,001; post-hoc: (CuffNor = Sham)> CuffSal bei p <0,001 an den Tagen 29 bis 34). Bei dieser Dosis keine akute analgetische Wirkung des Antidepressivums beobachtet ^16,17. Um die anhaltende Schmerzlinderung, die bei Patienten, die solche Medikamente vorhanden ist, zu imitieren, können die Mäuse vor der Morgen Verabreichung des Arzneimittels nicht erst nach geprüft werden. Ein solches Verfahren ermöglicht eine Bewertung der Langzeitwirkung von früheren Tagen der Behandlung grundiert. In diesem Fall erfordert es 1 bis 2 Wochen nach der Behandlung eine dauerhafte Linderung des neuropathischen Allodynie beobachten. Wenn die Behandlung unterbrochen wird, wird ein Rückfall in der Regel innerhalb von 3 bis 4 Tage ¹⁸ beobachtet. Neben einigen Antidepressiva, gabapentinoids sind die anderen der ersten Wahl für die Behandlung neuropathischer Schmerzen. Gabapentin hat eine akute und vorübergehende analgetische Wirkung in diesem Modell ^16, aber es zeigt auch eine verzögerte und lon g anhalt antiallodynische Wirkung beim Testen des Tieres pro Tag vor der Verabreichung des Arzneimittels (3, p <0,001). Diese Aktion ist schneller als mit Antidepressiva.

Abbildung 1. Mechanische Pfotenrückzugsschwellen in der Manschette Modell von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen. Erwachsene männliche C57BL/6J Mäuse wurden an den von-Frey-Verfahren gewöhnt, bis eine stabile Basislinie erhalten (die Basislinie am Punkt 0 auf der Grafik dargestellt). Beide Pfoten wurden getestet. Die Manschette Mäuse zeigen ipsilateralen mechanischer Allodynie als durch die abgesenkten Pfotenrückzugsschwellen (n = 10 pro Gruppe) zeigte.

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Abbildung 2. Verzögerte antiallodynische Wirkung von trizyklischen Antidepressiva. Nach zwei Wochen nach der Operation erhielten die Mäuse intraperitoneale Behandlung zweimal täglich (morgens und abends) entweder mit 0,9% NaCl oder 5 mg / kg Nortriptylin-Hydrochlorid (n = 5 oder 6 pro Gruppe ). Die von Frey-Test wurde vor der Morgen Behandlung getan. Mit diesem Verfahren wird eine verzögerte antiallodynische Wirkung von Nortriptylin beobachtet, die etwa 12 Tagen Behandlung erfordert.

Abbildung 3. Antiallodynische Wirkung einer gabapentinoid. Nach drei Wochen nach der Operation erhielten die Mäuse intraperitoneale Behandlung zweimal täglich (morgens und abends) entweder mit 0,9% NaCl oder 10 mg / kg Gabapentin (n = 5 pro Gruppe). Die von Frey-Test wurde vor der Morgen Genuss getanment. Mit diesem Verfahren wird eine verzögerte und anhaltende antiallodynische Wirkung von Gabapentin beobachtet. Daten werden vor Beginn der Behandlung und am 6. Tag der Behandlung dargestellt.

Diskussion

Die "Manschette"-Modell wurde zunächst in Ratten entwickelt, um eine standardisierte und reproduzierbare chronische Verengung Verletzungen mit der Implantation mehrere Manschetten um den Ischiasnerv ⁶ zu erhalten. Es wurde dann modifiziert, um eine einzige Manschette ^7,8 implantieren, auch wenn einige Forschungsgruppen noch mit mehreren Manschetten Einsetzen ^19-22. Es wurde dann auf ^9,23 Mäusen, die die Möglichkeit, transgene Tiere verwenden geöffnet angepasst. Die Manschette ist in der Regel 2 mm lang, aber andere Längen sind auch in ²² Ratten eingesetzt. Der Polyethylenschlauch ist von der Art: PE-20 in Mäusen, ⁹ und PE-60 oder PE ^{24,25 7,8,26,27-90} bei Ratten.

Die mechanische Allodynie ist mit von Frey Haare gemessen. In diesem Test können die absoluten Werte für Pfotenrückzugsschwellen auf der Oberfläche, auf der das Tier steht ²⁸ oder von der Dauer der Fadenbiege ³ abhängen, aber diese Faktoren nichtauf die Detektion des neuropathischen Allodynie.

Die "Manschette"-Modell ist von Interesse für das Studium der neuropathischen Schmerzmechanismen. Es wurde verwendet, um morphologische Veränderungen in markhaltigen und marklosen Fasern ^6,29 und funktionelle Veränderungen in sensorischen Neuronen, Primärafferens und Rücken Neuronen ^{19,21,22,30-35} studieren. Demonstration, dass es erlaubt Glia-Aktivierung und eine zentrale Schalt in neuronalen Anion Gradienten in Veränderungen in der Aktivität und in den Reaktionen der spinalen nozizeptiven Neuronen und Allodynie bei neuropathischen ^24,36-38 teilnehmen. Der Einfluss von Glutamat-Rezeptoren ^7,39-41, der Opioid-Rezeptoren ^16,42-45 und Nikotinrezeptoren ⁴⁶ wurde auch in diesem Modell untersucht.

Ein weiteres Interesse des Modells ist seine Reaktion auf die aktuellen Behandlungen von neuropathischen Schmerzen, dh., Gabapentinoids und Antidepressiva. Ähnlich wie bei klinischen Beobachtungen: gabapentinoids anzuzeigen sowohl einen akuten kurzer Dauer analgetische Wirkung bei hoher Dosis und eine verzögerte nachhaltige Linderung der Aktion, die nach ein paar Tagen der Behandlung, trizyklische Antidepressiva und selektive Serotonin-und Noradrenalin-Wiederaufnahme-Hemmer haben keine akute schmerzstillende Wirkung bei relevanten Dosis beobachtet wird, aber sie zeigen eine anhaltende Linderung verzögert Aktion, die 1 bis 2 Wochen der Behandlung und der selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin erfordert, ist unwirksam ^16. Das Modell ist daher angemessen, den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus dieser Behandlungen ^{16-18,44,45,47,} die neue therapeutische Ziele offenbaren kann bei Patienten ^48-51 testen zu studieren.

Schließlich kann das Modell auch die Untersuchung der anxiodepressive Folgen von neuropathischem Schmerz. Klinisch beeinflussen diese Folgen etwa ein Drittel der Patienten, neuropathische Schmerzen, sind aber weniger präklinisch untersucht als die sensorischen Aspekte des Schmerzes. In diesem Modell wird eine zeitabhängige Entwicklung von Angstzuständen und Depressionen artigensive-like Phänotypen vorhanden ist ⁵² und die damit verbundene Mechanismus kann so angesprochen werden.

Die standardisierten Bündchen und Verfahren in diesem Mausmodell von neuropathischen Schmerzen führen zu niedrigen interindividuelle Variabilität für die mechanische Allodynie. Die Möglichkeit, gentechnisch veränderte Tiere ^{17,18,44-47,52,} die lang anhaltende Allodynie zu verwenden, die Antwort auf die klinisch verwendeten Behandlungen und die zeitabhängige Entwicklung der anxiodepressive Symptome machen dieses Modell für die entsprechende Untersuchung der verschiedenen Aspekte und Folgen von neuropathischen Schmerzen und ihre Behandlungen, die bereits wertvolle Informationen zu diesem Forschungsgebiet gebracht haben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE-20 polyethylene tubing	Harvard Apparatus	PY2-59-8323	Splitted before surgery
Ketamine	Centravet	IMA004
Xylazine HCl	Sigma	X1251	Freshly prepared before surgery
Ocry-gel	Centravet
Pliers	FST	11003-12	52.5 mm straight
Bulldog clamp	FST	p130 18038-45
Perforated plate	CTTM
von Frey filaments	Bioseb	NC-12775