שיטת צ'יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

Summary

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

Abstract

בשיטות vivo כגון שבב שבב טכניקות מבוססות היטב המשמשות לקביעת מטרות גן הגלובליות לגורמי שעתוק. עם זאת, הם של שימוש מוגבל בחקר שתי מערכות רגולציה מרכיב חיידקים עם תנאי הפעלת uncharacterized. מערכות כאלה להסדיר שעתוק רק כאשר מופעלים בנוכחות אותות ייחודיים. מאז האותות הללו הם לעתים קרובות לא ידועים, חוץ גופית בשיטה microarray מבוססת שבתוארה במאמר זה וידאו יכול לשמש כדי לקבוע מטרות גן ואתרי קישור לרגולטורי תגובה. שיטה מטוהרת-DNA-זיקת שבב זה עשויה לשמש לכל רגולטור מטוהר בכל אורגניזם עם הגנום רצף. הפרוטוקול כרוך מאפשר מטוהר החלבון מתויג להיקשר הדנ"א הגנומי טעון ולאחר מכן טיהור זיקת DNA הנכנס החלבון, ואחריו ניאון תיוג של ה-DNA וכלאה למערך ריצוף מותאם אישית. שקדמו לצעדים שעשויים לשמש כדי לייעל את assay לספציפיהרגולטורים ג גם מתוארים. הפסגות שנוצרו על ידי ניתוח נתוני מערך משמשות כדי לחזות מוטיבים אתר קישור, אשר לאחר מכן הם תוקף באופן ניסיוני. תחזיות המוטיב יכולות לשמש נוספת כדי לקבוע מטרות גן של רגולטורים תגובת orthologous במינים קרובים. אנו מדגימים את תחולתה של שיטה זו על ידי קביעת מטרות הגן ומחייב מוטיבים אתר ובכך לחזות את הפונקציה עבור DVU3023 רגולטור תגובת sigma54 תלוי בחיידק הסביבתי Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Introduction

היכולת של חיידקים לשרוד ולשגשג תלויה באופן קריטי על כמה טוב הם מסוגלים לקלוט ולהגיב להפרעות בסביבתם, וזה בתורו הוא תלוי במערכות העברת אותותיהם. מספר מערכות אזעקת encodes חיידק כבר נקרא "IQ של חיידקים" שלה ויכול להיות אינדיקציה של שתי השתנות של סביבתו ואת יכולתו לחוש אותות מרובים ולכוונן את תגובתה ^1. שתי מערכות רכיב אות התמרה (TCS) הן מערכות האיתות הנפוצות ביותר בשימוש על ידי חיידקים, והם מורכבים מקינאז היסטידין (HK) שחש את האות החיצונית ומעביר באמצעות זירחון לרגולטור תגובת מפעיל (RR) ^2. RRs יכול להיות מגוון של תחומים פלט ומצבים שונים ובכך מפעיל, אבל התגובה הנפוצה ביותר היא תקנת תעתיק באמצעות DNA מחייב תחום ^1. האותות חשו ופונקציות המקבילה vasלא רוב TCSs אינו ידוע.

למרות in vivo שיטות כגון שבב שבב משמשות באופן שיגרתי לקביעת אתרי קישור הגנומי של שעתוק גורמי ^3, הם יכולים לשמש רק לRRs שתי מערכת מרכיב חיידקים אם התנאים להפעלה או אותות ידועים. לעתים קרובות הרמזים הסביבתיים המפעילים TCS הם יותר קשים לקבוע ממטרות הגן שלהם. במבחנה microarray assay המבוסס המתואר כאן ניתן להשתמש ביעילות ובמהירות כדי לקבוע את מטרות הגן ולחזות פונקציות של TCSs. assay זה מנצל את העובדה שניתן phosphorylated RRs וכך הופעל במבחנה באמצעות תורמי מולקולה קטנים כמו פוספט אצטיל ^4.

בשיטה זו, בשם DAP-שבבים עבור ה-DNA זיקה מטוהר שבב (איור 1), גן RR של עניין הוא משובט עם התג שלו בE. coli, וטהר לאחר מכן חלבון מתויג מותר דוnd לטעון הדנ"א הגנומי. ה-DNA חייב החלבון מועשר לאחר מכן על ידי זיקה לטיהור, ה-DNA המועשר וקלט הם מוגברות, שכותרתו fluorescently, אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף כי הוא עשה מותאם אישית לאורגניזם של עניין (איור 1). ניסויי microarray כפופים לחפצים, ולכן צעדים נוספים מועסקים כדי לייעל את assay. צעד אחד כזה הוא לנסות ולקבוע יעד אחד לRR תחת מחקר באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA) (ראה זרימת עבודה באיור 2). לאחר מכן, בעקבות מחייב הדנ"א הגנומי וצעדי DAP, ה-DNA חייב החלבון והקלט נבדקים על ידי qPCR כדי לראות אם היעד החיובי הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון ביחס לשבריר הקלט, ובכך אישרה תנאים אופטימליים מחייב עבור RR (איור 2). לאחר הכלאת מערך, הנתונים מנותחים למצוא פסגות של אות בעוצמה גבוהה המעידות על לוקוסים הגנומי שבו שעות החלבוןמודעה קשורה. פונקציות יכולות להיות חזויה עבור RR מבוסס על מטרות הגן שהושגו. הלוקוסים הגנומי היעד משמשים כדי לחזות מוטיבים אתר מחייב, אשר לאחר מכן בניסוי תוקף באמצעות EMSAs (איור 2). התחזיות פונקציונליות ומטרות גן לRR יכולים אז להיות מורחבות למינים קשורות באופן הדוק המקודדים RRs orthologous ידי סריקת הגנום אלה למוטיבים המחייבים דומים (איור 2). שיטת DAP-השבב יכולה לספק שפע של מידע לTCS בהם בעבר לא היה כלום. גם השיטה יכולה לשמש לכל רגולטור תעתיק אם החלבון יכול להיות מטוהרת וניתן לקבוע תנאים המחייבים DNA, ולכל אורגניזם של עניין עם רצף הגנום זמין.

איור 1. מטוהר-DNA-זיקת השבב (DAP-אסטרטגית שבב) ^7. גן RR מהאורגניזם של עניין הוא משובט עם התג שלו carboxy-מסוף לE. זן ביטוי coli. חלבון שלו מתויג מטוהר מופעל על ידי זירחון עם פוספט אצטיל, ומעורבב עם הדנ"א הגנומי טעון. Aliquot של התגובה מחייבת נשמר כDNA קלט, ואילו השאר הוא נתון לטיהור זיקה באמצעות שרף Ni-נ.ת. ע. הקלט ואת ה-DNA הנכנס RR הוא הגנום כולו מוגבר, ושכותרתו עם Cy3 וCy5, בהתאמה. ה-DNA שכותרתו היא אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף, אשר לאחר מכן נותח על מנת לקבוע מטרות הגן. איור שונה והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons ^מ7.

איור 2. סיכום של זרימת עבודה. לכל מטוהר protei מתויגn, להתחיל על ידי קביעת יעד באמצעות EMSA. אפשר לחלבון לקשור הדנ"א הגנומי ולאחר מכן ה-DNA זיקה לטהר (DAP) והגנום כולו להגביר את ה-DNA והקלט המועשר (WGA). אם יעד גן ידוע, השתמש qPCR כדי להבטיח כי היעד הידוע הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון. אם לא ניתן לקבוע יעד, להמשיך ישירות לתיוג ה-DNA וכלת מערך. אם העשרה על ידי qPCR לא יכולה להיות שנצפתה, ולאחר מכן לחזור על החלבון מחייב-gDNA וצעדי DAP-WGA המשתמשים בכמויות חלבון שונות. השתמש בניתוח מערך למצוא פסגות ולמפות אותם כדי למקד את הגנים. השתמש באזורים במעלה הזרם של גנים המטרה לחזות מוטיבים אתר קישור. לאמת את המוטיבים בניסוי באמצעות EMSAs. השתמש במוטיב לסרוק את הגנום של מינים קרובים קידוד orthologs של RR תחת מחקר, ולחזות גנים ממוקדים במינים אלה גם כן. בהתבסס על מטרות הגן השיגו, התפקוד הפיזיולוגי של RR וorthologs ניתן לחזות. איור שונה והודפס מחדש באמצעות ג יצירתייםommons רישיון ^מ7.

Protocol

הערה: הפרוטוקול להלן מותאם לקביעת מטרות גן של DVU3023 RR מחיידק Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. זה יכול להיות מותאם לכל רגולטור תעתיק אחר של עניין.

1. Clone ולטהר RR

1. לשבט את גן RR, במיוחד DVU3023, מד vulgaris Hildenborough לתוך וקטור ביטוי חיידקי Escherichia כך שהגן הוא C-סופני מתויג וביטוי הוא תחת השליטה של אמרגן T7.
   הערה: שיטות שיבוט כמה עשויות לשמש והוא נקבע על ידי החוקר. עשויים לשמש גם תגי זיקה חלופי.
2. להפוך את הביטוי לבנות לתוך E. coli BL21 (DE3) מתח ביטוי.
3. תתבגר 1 ליטר של זן ביטוי BL21 ב 37 ° C. בשלב אמצע יומן, להוסיף IPTG ל0.5 מ"מ לגרום ביטוי חלבון. המשך צמיחה בטמפרטורת חדר למשך 24 שעות.
4. תאי צנטריפוגה ב XG 5,000 ל10 מייליםn ב 4 ° C. תאי resuspend במאגר תמוגה (פוספט נתרן 20 מ"מ, pH 7.4 500 mM NaCl, imidazole 40 מ"מ, 1 מ"ג / מיליליטר ליזוזים, 1x Benzonase nuclease). תאי Lyse באמצעות עיתונות צרפתית ב 4 ° C.
5. lysate צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. לסנן באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
6. שטוף עמודת Ni Sepharose 1 מיליליטר במכשיר FPLC באמצעות 10 מיליליטר של חיץ לשטוף (פוספט נתרן 20 מ"מ, pH 7.4 500 mM NaCl, 40 imidazole מ"מ).
7. טען lysate על הטור. לשטוף טור עם 20 מיליליטר של חיץ לשטוף.
8. Elute DVU3023 באמצעות שיפוע של 0-100% חיץ elution (פוספט 20 מ"מ נתרן, pH 7.4 500 mM NaCl, 500 מ"מ imidazole).
9. טען שברי eluted על עמודת desalting, ולשטוף עם חיץ desalting (pH 20 מ"מ נתרן פוספט 7.4, 100 מ"מ NaCl).
10. מדגם חלבון צנטריפוגה במסנן גבוה מולקולרי משקל הפסקת צנטריפוגות כדי לרכז את החלבון. הוספת DTT ל0.1 מ"מ וגליצרול 50% וחלבון חנות ב -20 ° C.
    הערה: שיטות טיהור צריכים להיות מותאמות באופן אינדיבידואלי לכל חלבון הנחקר.

2. לקבוע יעד גן לRR באמצעות Shift Electrophoretic ניידות Assay (EMSA)

1. PCR להגביר 400 מעלה זרם אזור נ"ב של DVU3025 גן יעד מועמד, באמצעות ד ה-DNA וולגריס Hildenborough הגנומי כתבנית, ויחל ללא תווית קדימה ו5'-שכותרתו ביוטין פריימר ההפוכה.
   הערה: טיפים לבחירת גן יעד מועמד: לעתים קרובות RRs לאגד האזורים במעלה הזרם של הגן / אופרון שלהם, או שהם עשויים לווסת את הגנים מקודדים proximally. אם יש RR orthologs במינים אחרים, לחפש גנים, כי הם נשמרים בשכונה. שיטות חלופית כוללות גנים מועמדים בבחירה המבוססים על תחזיות regulon (למשל, RegPrecise ^5), או יזמים sigma54 תלוי ניבוי ⁶ לRRs כי הם עצמם sigma54 תלויים.
2. הפעל את המוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1%, לגזור 400 במוצר בגודל p, ולטהר את ה-DNA באמצעות מיצוי ג'ל לנקות את הערכה.
3. מערבבים את חלבון DVU3023 (0.5 pmol) עם מצע של ה-DNA biotinylated 100 fmol ב10 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ DTT, גליצרול 25% ומיקרוגרם / פולי מיליליטר 1 dI.dC (לא ספציפי DNA מתחרה) בהיקף כולל של 20 μl. גם להגדיר תגובה ללא כל חלבון כביקורת. דגירה התגובות בטמפרטורת חדר על הספסל במשך 20 דקות.
4. שים לב: אלה הם תנאים סטנדרטיים המפורטים ומרכיבי תגובה אחרים ניתן להוסיף בהתאם לRR של עניין. אם ההפעלה היא רצויה, להוסיף פוספט אצטיל 50 מ"מ לתגובה (לעתים קרובות RRs יהיה לאגד DNA במבחנה ללא הפעלה).
5. טרום להפעיל 6% ג'ל טרומי מיני polyacrylamide-0.5x TBE במאגר TBE 0.5x ל30 דקות 100 V. הוסף 5 μl של חיץ טעינת 5x (bromophenol 0.1% הכחולים, 0.1% cyanol קסילן, גליצרול 30% ב1x TBE) לתגובות מחייבות ו18 μl העומס של התגובות על gאל. לרוץ לשעה 2 100 V.
   הערה: על מנת למנוע התחממות יתר, מה שעלול להוביל להתפוררותו של קומפלקסי החלבונים ה-DNA, למלא את תא החיץ החיצוני במערכת אלקטרופורזה עם ריצת חיץ כזה שרוב ג'ל מבודד במאגר. לחלופין, ג'ל ניתן להפעיל ב 4 ° C.
6. חותכים קרום ניילון מחויב לגודל של ג'ל ולהשרות אותו בTBE 0.5x לפחות עשר דקות. להסיר את הג'ל מהקלטת. לחתוך כל רכסים את הג'ל וכריך ג'ל וקרום בין שני ניירות סינון עבים ספוגים בTBE 0.5x, ומניח בתוך מנגנון סופג חצי יבש ולרוץ ב20 V ל30 דקות.
7. מניחים את הקרום בתוך מכשיר crosslinker אור UV מסחרי ולהגדיר את הזמן עד 3 דקות.
   הערה: הקרום עשוי כעת להיות מאוחסן יבש בטמפרטורת חדר במשך כמה ימים לפני שתמשיך לשלב הבא.
8. השתמש בערכת זיהוי chemiluminescent זמינה מסחרי שמעסיקה peroxida צנון streptavidin סוסיםהמצומד se לפתח את הכתם לפי הוראות יצרן.
9. תמונת הכתם באמצעות מחשב שמחובר למצלמת CCD המאובזר ולחפש שינוי בניידות מצע DNA בנוכחות RR, אשר מציין כי RR נקשר ה-DNA שנבדק.
   הערה: הספציפיות של המשמרת-DNA החלבון, ניתן לבדוק על ידי הכללה בתגובה עודפת של ה-DNA מתחרה ללא תווית, שאמורה למנוע או להקטין את המשמרת ראתה.

3. ודא יעד העשרה לאחר חלבון דנ"א הגנומי העקידה

1. תגובה מחייבת חלבון דנ"א גנומי
   1. הדנ"א הגנומי גזירה לגודל ממוצע של 500 נ"ב ידי sonicating 100 הדנ"א הגנומי μl (בריכוזים 100-200 ng / μl) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge באמצעות microtip עם 9 פולסים משרעת נמוכים של 1 שניות, עם 2 שניות בפער בין כל אחד.
      הערה: אם ה-DNA משפריץ לצדדים של הצינור, ספין למטה את התוכן לאחר כל 3 פעימות. התנאים המדויקים בשימושישתנה עם מכשיר sonicator בשימוש. שברי DNA טעון עשויים לנוע בין 100-1000 נ"ב, אבל הגודל הממוצע צריך להיות בתוך 400-600 נ"ב. יותר מדי גז עלול לגרום לאתרי קישור בשלמות פחות, וגם יותר מדי או מעט מדי גז ישפיע על הכנת ספרייה במהלך שלבי הגברה הגנום כולו במורד הזרם.
   2. מערבבים 2-3 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי הטעון עם חלבון RR (0.5 pmol של DVU3023) ב10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 1 מ"מ DTT, 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl _2, גליצרול 25%, ו50 מ"מ פוספט אצטיל. דגירה תגובות ב25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ההעברה 10 μl של התגובה הזו לצינור 1.5 מיליליטר ותווית כמו DNA קלט.
      הערה: פוספט אצטיל מתווסף כדי להפעיל את החלבון על ידי זירחון במבחנה. זירחון מגרה DNA המחייב, אבל RRs רבים מחייב גם DNA במבחנה ללא הפעלה ^7. כמות החלבון שנוספה לתגובה תהיה תלויה בפעילות של הכנת החלבון. EMSA ניתן להשתמש כדי לבחורimize סכום זה.
2. זיקה לטהר את ה-DNA חייב החלבון
   1. הוסף 30 μl של שרף agarose Ni-נ.ת. ע לצינור 0.6 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה בדקות 1 100 XG כדי לאסוף את השרף בתחתית, ולהסיר את supernatant. הוספה של חיץ לשטוף (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl _2, 50 מ"מ KCl, גליצרול 25%) 100 μl, קפיצי הצינור לערבב, ו צנטריפוגות ב 2 דקות 100 XG. הסר supernatant.
   2. הוסף את 90 μl הנותר של התגובה מחייב את שרף Ni-נ.ת. ע שטף ודגירה שבייקרה רוטרי 30 דקות.
   3. צנטריפוגה ב 2 דקות 100 XG, ולהסיר את supernatant (DNA הכרוך). הוספה של חיץ לשטוף 100 μl, קפיצי הצינור לערבב את תוכן, ו צנטריפוגות ב 2 דקות 100 XG. הסר supernatant. חזור על השלב לשטוף פעמיים נוספות.
   4. הוסף 35 μl של חיץ elution (pH חיץ פוספט נתרן 20 8 מ"מ, 500 mM NaCl, 500 מ"מ imidazole) לשרף ומערבבים על ידי vortexing. דגירה על הספסל ב RT למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 2 דקות 100 XG. מעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר ותווית כחלק-DNA קשור חלבון.
   5. גם להוסיף 35 μl של חיץ elution ל-DNA הקלט.
   6. לטהר את הקלט ושברי דנ"א הנכנס חלבון באמצעות ערכת טיהור PCR.
3. הגנום כולו להגביר את הקלט ואת דגימות ה-DNA חייב חלבון.
   1. הוסף 10 μl של הקלט וה-DNA חייב חלבון על מנת להפריד בין צינורות PCR. הוספת μl 1 של חיץ 10x פיצול, 2 μl של חיץ ספריית הכנה, ו1 μl של פתרון ספריית ייצוב מדגם זה. מערבבים היטב על ידי vortexing. חום בthermocycler ב-C ° 95 למשך 2 דקות, ומקרר על קרח.
      הערה: הסכום ההתחלתי של ה-DNA צריך להיות לפחות 10 ng כדי למנוע החדרת הטיה הגברה.
   2. הוסף 1 μl של ספריית הכנת אנזימים, לערבב ידי pipetting ו דגירה בCycler תרמית על 16 מעלות C/20 דקות, 24 ° C/20 דקות, 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, 75 ° C / 5 דקות, ויחזיק ב 4 ° C.
   3. על צינור אחד, להוסיף 47.5 μl מים, 7.5 μl של 10x תערובת הורים הגברה, ו5 μl של פולימראז. מערבבים היטב וחום על 95 מעלות דקות C / 3, ואחריו 20 מחזורים של 94 מעלות שניות C/15, 65 ° דקות C / 5. החזק תגובות ב 4 ° C.
   4. לטהר את דגימות ה-DNA המוגבר באמצעות ערכת טיהור PCR ולמדוד את ריכוז ה-DNA spectrophotometrically.
4. ודא העשרת היעד ב-DNA הנכנס החלבון באמצעות qPCR
   1. פריימרים qPCR העיצוב כדי להגביר 200 נ"ב באזור במעלה הזרם של גן המטרה לאמת-EMSA (DVU3025) באמצעות כל תוכנת עיצוב פריימר זמינה באופן חופשי.
   2. הגדרת תגובות qPCR שלושה עותקים עבור כל תבנית ה-DNA בכל קבוצת פריימר. הכן תערובת אב כל קבוצת פריימר. תערובת ההורים 1x מכילה 10 μl תמהיל 2x Sybr הירוק qPCR, 0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד ומים לסך של 18 μl. 18 μl aliquot של מיקס מאסטר לכל טוב של צלחת PCR 96 היטב.
   3. Dilutדואר מוגבר וקלט מטוהרים ודגימות ה-DNA קשור לחלבון 5 ng / μl עם מים ולהשתמש בו כתבנית ה-DNA. הוסף 2 μl של תבנית ה-DNA לבארות.
   4. חותם את הצלחת עם סרט איטום qPCR אולטרה ברור, ספין למטה צלחת בצנטריפוגה ב XG 200/1 דקות. מניחים צלחת במכונה qPCR זמן אמת. מחזור כדלקמן באמצעות התוכנה הנלווית qPCR: 95 ° C / 1 דקות, ו40 מחזורים של 95 מעלות C/10 שניות, 59 ° C/15 שניות, ו70 ° C/35 שניות.
   5. גם להגדיר תגובות qPCR שלושה העתקים עם פריימרים כדי להגביר אזורים במעלה הזרם של גנים שאינם קשורים (בקרה שלילית).
   6. חישוב ΔC _T על ידי הפחתת ערך _T C של ה-DNA הנכנס חלבון מזה של ה-DNA הקלט. חישוב העשרת קיפול של גן המטרה בדנ"א הנכנס חלבון כמו 2 ^ΔC _T.
      הערה: אם באזור במעלה הזרם היעד הועשר ב-DNA הנכנס לעומת חלבון ה-DNA הקלט, זה מצביע על כך שהתגובות מחייבות וטיהור זיקה היו successful. המשך לשלב 4. אם העשרת האזור במעלה הזרם היעד לא נצפתה, חזור על התגובות מחייבות (שלב 3.1) עם כמות החלבון שונה.

4. סימון ה-DNA וכלת מערך

1. ה-DNA קלט תווית עם DNA Cy3 והמועשר עם Cy5
   OTE: צבעי Cy3 וCy5 הם רגישים לאור ויש להקפיד לשמור על חשיפה לאור למינימום.
   1. DNA מיקרוגרם מערבבים 1 עם 40 μl Cy3/Cy5-labeled 9 מרס ולהתאים את עוצמת קול ל80 μl עם מים.
   2. חום לפגל על ​​98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך (בthermocycler). צינה מהירה על קרח במשך 2 דקות.
   3. הוסף 2 פולימראז μl Klenow (3'-5'-Exo ^-, 50,000 U / ml), 5 dNTPs מ"מ, ו -8 מים μl לכל תגובה, ומערבב היטב, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בחושך (ב thermocycler).
   4. להוסיף EDTA ל50 מ"מ כדי לעצור את התגובה ופתרון NaCl ל0.5 מ '
   5. העברת דגימות ל1.5 צינורות מיליליטר המשךaining 0.9 נפח isopropanol, דגירה בחושך במשך 10 דקות, ו צנטריפוגות ב XG 12,000 עבור 10 דקות. גלולה צריכה להיות ורוד עבור ה-DNA שכותרתו Cy3 וכחול עבור ה-DNA שכותרתו Cy5.
   6. לשטוף עם גלולה 80% אתנול (500 μl) ו צנטריפוגות ב XG 12,000 למשך 2 דקות. כדורי אוויר יבשים ל5-10 דקות בחושך.
      הערה: פלטות עשויות להיות מאוחסנות ב -20 ° C.
   7. גלולה גלולה ב25 מים μl. למדוד את ריכוז ה-DNA spectrophotometrically.
   8. בריכה ביחד 6 מיקרוגרם כל אחת של ה-DNA שכותרתו Cy5 Cy3-ויבש 1.5 צינור מיליליטר וואקום בצנטריפוגה על אש נמוכה בחושך (לכסות את המכסה צנטריפוגות אם הוא שקוף).
      הערה: פלטות עשויות להיות מאוחסנות ב -20 ° C עד מוכן להכלאה.
2. הכלאה microarray
   1. הפעל את מערכת ההכלאה על 3-4 שעה לפני שימוש ולהגדיר את הטמפרטורה ל 42 ° C.
   2. הכן תערובת אב פתרון הכלאה כזאת, כי פתרון 1x מכיל 11.8 μl 2x Hybridiחיץ zation, 4.7 μl הכלאה רכיב, ו0.5 אוליגו יישור μl.
   3. Resuspend את כדורים במים 5 μl. הוסף 13 μl זה תמהיל למדגם. מערבולת 15 שניות, דגירה על 95 מעלות צלזיוס באמבט יבש למשך 5 דקות. שמור דגימות על 42 מעלות צלזיוס במערכת ההכלאה עד מוכן להעמסה.
   4. הכן את ההרכבה שקופית מיקסר microarray, על פי הפרוטוקול של היצרן.
   5. הנח את מכלול מיקסר שקופיות בתוך מערכת ההכלאה. טען 16 μl של מדגם ליציאת המילוי, לאטום את היציאות עם סרט דבק, להפוך ערבוב במערכת, ולהכליא ל16-20 שעות ב42 ° C.
   6. הכן את המאגרים לשטוף 1x אני (250 מיליליטר), השני (50 מיליליטר) ו-III (50 מיליליטר) על ידי דילול 10x המאגרים הזמינים מסחרי במים, ולכל אחד מוסיף DTT עד 1 מ"מ. הצפת חמה אני 42 ° C.
   7. חלק את מיקסר השקופית לתוך כלי פירוק, ומקום בתוך צלחת המכילה מאגר חם I. פיל המיקסר את, ואילו במרץ shaking כלי הפירוק ביד.
   8. מניחים את השקופית לתוך מיכל עם 50 מיליליטר של חיץ לשטוף אני ולנער במרץ למשך 2 דקות ביד.
   9. העברת שקופיות למכל שני עם חיץ 50 מיליליטר לשטוף השני ולנער במרץ דקות 1 ביד.
   10. העברת שקופיות לתוך מיכל שלישי עם 50 מיליליטר חיץ לשטוף שלישי, ולנער במרץ ל15 שניות ביד.
   11. מהר למחוק את הקצוות של השקופית על מגבת נייר, ומניח במדף שקופיות. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 2 דקות לייבוש השקף. הנח בתוך מקרה שקופיות, לעטוף אותו בנייר כסף, ולאחסן בתא ייבוש.
3. סריקת המערך
   1. מניחים את השקף בתוך סורק microarray על פי ההוראות של המכשיר.
   2. השתמש בתוכנת סורק כדי לקבוע את אורכי הגל כ532 ננומטר = Cy3 ו635 ננומטר = Cy5, והרווחים מכפיל הראשוניים בין 350 ו400.
   3. תצוגה מקדימה של השקופיות כדי לאתר את המערך בשקופית. בחר את אזור שהמערך לסריקה.
   4. סרוק את המערך ולהתאים את ההגדרות מכפיל כך שתכונות המערך הן בעיקר צהובות. היסטוגרמה צריכה להראות עקומות האדומות וירוקות על גבי זו או קרובה זה לזה ככל האפשר. העקומות צריכה להסתיים מעל 10 ^-5 הספירה המנורמלת ברוויה.
   5. להציל את שני 532 ו635 תמונות ננומטר בנפרד.
4. ניתוח נתוני מערך
   1. לייבא את התמונות לתוך תוכנת ניתוח מערך. שימוש בתוכנה, ליצור שני דוחות זוג (. זוג) לכל מערך (לתמונות Cy3 וCy5). יצירת קבצי יחס מדורגים יומן ₂ באמצעות קבצי הזוג. השתמש ביומן ₂ קבצי יחס לחפש פסגות באמצעות חלון הזזה של 500 נ"ב. מפת לוקוסי השיא לאזורים במעלה הזרם של מטרות גן.
   2. בדוק אם המטרה החיובית (נקבע באמצעות EMSA ואושר על ידי qPCR, DVU3025 בדוגמא זו) מופיעה בתוך הפסגות העליונה.
      הערה: אם המטרה החיובית היא לא בין הלהיטים העליונים, זה אפשרי, כי RR תחת consiיש deration כמה מטרות גן ולשכפל DAP-שבבים יכול להתנהל ופסגות משותפות לכל משכפל יכולות לשמש כדי ליצור רשימת יעד.

5. חיזוי מוטיב אתר הקישור ואימות

1. אחזר רצפים לאזורים במעלה הזרם (400 נ"ב) למטרות גן העליונים שכנוצר על ידי ניתוח DAP-שבב. החל MEME על רצפים אלה באמצעות חיידקים מקוונים (meme.nbcr.net) לחזות מוטיבים.
   הערה: Enhancer מחייבים חלבונים כגון רגולטורים sigma54 תלויים ניתן לאגד כמה מאה זוגות בסיסים במעלה הזרם של אתר ההתחלה. לרגולטורי תעתיק אחרים, אזור קצר יותר כגון 200 נ"ב במעלה הזרם יהיה מספיק.
2. עליון עיצוב וoligomers גדיל DNA התחתון המכיל את מוטיב אתר הקישור חזה מוקף 10 בסיסים בשני קצותיו. הזמן את הגדיל העליון 5 'biotinylated.
3. מערבבים את oligos הגדיל העליון ותחתון ביחס 1:1.5 ב10 מ"מ טריס HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, ו50 מ"מ NaCl בבסך הכל נפח תגובה של 20 μl בצינורות ה-PCR. חום ל-C ° 95 למשך 5 דקות בCycler תרמית, ואחריו קירור איטי ל25 ° C. לדלל פי עשרה ולהשתמש בו כמצע dsDNA סוג בר לEMSA.
4. הכן את מצעים שונה באמצעות אותם השלבים כאמור לעיל, אבל oligomers העיצוב לשאת 4-6 החלפות בבסיסי שימור של המוטיב המחייב.
5. הגדרת תגובות מחייבות עם RR והסוג בר או מצעים שונה ולבחון באמצעות EMSA כמתואר בשלב 2.
6. הערה: המוטיב ניבא הוא תוקף אם RR נקשר מצע הסוג בר, אבל לא שונה אחד.

6. שימור של מוטיב במיני חיידקים קשורים אחרים

1. בחר הגנום של עניין המכיל orthologs של DVU3023. השג לגנומים מאתר צמח השדה קבצי רצף וביאור.
2. השתמש בשפת תכנות כמו Perl לכתוב תסריטים שישתמשו רצפי מוטיב ממטרות DAP-השבב לבנות posמטריצה ​​המשוקללת ition ולהשתמש במטריצה ​​להבקיע מוטיבים דומים קיימים בגנומים רצף אחרים.

תוצאות

השיטה הנ"ל יושמה כדי לקבוע את מטרות הגן הגלובליות של RRs בסולפט מודל הפחתת חיידק Desulfovibrio vulgaris ⁷ Hildenborough. יש אורגניזם זה מספר גדול של TCSs מיוצג על ידי מעל 70 RRs, המעיד על המגוון הרחב של אותות אפשריים שהוא חש ומגיב ל. בvivo מנתח על הפונקציות של מערכות אזעקה אלה ?...

Discussion

שיטת DAP-השבב שתוארה כאן הייתה הצלחה בשימוש כדי לקבוע את מטרות הגן במשך כמה RRs בDesulfovibrio vulgaris ⁷ Hildenborough של איזה מהם מוצג כאן כתוצאה נציג. לDVU3023 RR, בחירת יעד גן מועמד הייתה פשוטה. DVU3025 ממוקם מייד במורד הזרם של גן RR, וגני RR והיעד הם נשמרים בכמה מיני Desulfovibrio, ובנוס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28704
Biotin-labeled oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	N/A
6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	EC63652BOX	Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane	EMD Millipore, Billerica, MA, USA	INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3967
UV crosslinker Model XL-1000	Fisher Scientific	11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)	Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA	89880
Ni-NTA agarose resin	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA		For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX	Quanta biosciences	95055-500	Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR	Axygen
96 well clear low profile PCR microplate	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	4376600	Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28104	Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers	Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA	N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo-	New England Biolabs, Ipswich, MA	M0212M
Hybridization system	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A	This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,
Custom printed microarrays and mixers	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
GenePix 4200A microarray scanner	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA		This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A