יישום של קרדית העכביש הבחין-Two<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; לאינטראקצית צמח-מזיקים ללימודים

Summary

פרוטוקולים להכנה יעילה של דגימות אחידות של קרדית עכביש, התפשטות של צמחים ניסיוניים, והערכה של נזק צמח, כפי שנדרש למחקרים של אינטראקציה בין צמחים למזיקים פותחו.

Abstract

קרדית העכביש שני המנומרת, Tetranychus urticae, הוא אוכלי עשב arthropod polyphagous בכל מקום שייזון ממגוון רחב להפליא של מינים, עם יותר מ 150 של ערך כלכלי. זה מזיקים עיקריים של גידולים בחממות, בעיקר בהסולניים ודלועיים (למשל, עגבניות, חצילים, פלפלים, מלפפונים, קישואים) ונוי חממה (למשל, ורדים, חרציות, ציפורנים), גידולי שדה שנתי (כגון תירס, כותנה, סויה, וסלק סוכר), ובתרבויות רב שנתית (אספסת, תותים, ענבים, הדרים, ושזיפים) ^1,2. בנוסף לpolyphagy הקיצוני שהופך אותו למזיק חקלאי חשוב, ט יש urticae נטייה לפתח עמידות למגוון רחב של חומרי הדברה וacaricides המשמשים לשליטתה ^3-7.

ט urticae הוא אורגניזם ניסיוני מצוין, שכן יש מחזור חיים מהיר (7 ימים ב27 ° C)ויכול להישמר בקלות בצפיפות גבוהה במעבדה. שיטות לassay ביטוי גנים (כולל הכלאה באתרו ומכתים נוגדן) וכדי להשבית את הביטוי של גנים אנדוגניים קרדית עכביש באמצעות התערבות RNA פותחו ^8-10. לאחרונה, כל רצף הגנום של ט ' urticae כבר דיווח, יצירת הזדמנות לפתח אוכלי עשב המזיק הזה כאורגניזם מודל עם משאבי גנומי מקבילים שכבר קיימים בחלק ממפעליה מארח (thaliana ארבידופסיס וlycopersicum Solanum העגבניות) ^11. יחד, אורגניזמים מודל אלה יכולים לספק תובנות לתוך בסיסים מולקולריים של אינטראקציות בין צמחים למזיקים.

הנה, שיטה יעילה לאיסוף מהיר וקל של מספר גדול של קרדית נקבה הבוגרת, היישום שלהם על מארח מפעל ניסיוני, וההערכה של נזק הצמח בשל האכלת קרדית עכביש מתוארות. הפרוטוקול המובא enables אוסף מהיר ויעיל של מאות אנשים בכל שלב התפתחותי (ביצים, זחלים, נימפות, זכרים בוגרים, ונשים) שיכול לשמש ליישום ניסיוני שלאחר מכן.

Introduction

אינטראקציה בין צמחים למזיקים היא נושא בעל חשיבות מדעית וכלכלית גדולה. זה מבחינה היסטורית נחקר באמצעות שני צמחי היבול (כגון עגבניות) וצמח המודל, א ' thaliana. בשני המקרים, רגישות של צמח לאוכלי עשב ניתן הייתה למדוד באופן ישיר דרך הערכה של פנוטיפ צמח לאחר התקף אוכלי עשב או בעקיפין באמצעות ההערכה של ביצועי מזיקים.

מדידה ישירה של רגישות צמח נוצלו בעבר למספר מיני חרקים מזיקים באמצעות מגוון של שיטות. לדוגמא, herbivory של זחלי lepidopteran נמדד כהערכה של החלק מרקמות צמח שנצרכו על ידי שתי xylostella Plutella (עש Diamondback) או Trichoplusia ni (Looper כרוב) בעין בלתי מזוינת בעזרת רשת ^12. כמו כן, ישנן שיטות שעושות שימוש בהדמיה דיגיטלית של נזק עלה עם ניתוח תמונת כמותית שלאחר מכן. שיטות כאלה היו בשימוש במחקריו של א ' אינטראקציה thaliana עם Frankliniella occidentalis (תריפס פרחים המערבי) ^13, flava Scaptomyza (דרוזופילה כריית עלים) ^14, וט ni ^15.

מדידות עקיפות של רגישות צמח נמצאות בשימוש נרחב במחקרים של אינטראקציה בין צמחים למזיקים. לדוגמא, רגישות של א ' thaliana לאפרסק Myzus כנימת persicae herbivory נבחנים בדרך כלל באמצעות ניתוח של פוריות מזיקים ותיאור של מורפולוגיה ברוטו של צמח אחרי האינטראקציה ^16,17. עוד אינדיקטור עקיף טיפוסי של א ' רגישות thaliana למזיקים היא הערכת משקל יבשה או רטובה של אוכלי העשב. פרמטר זה משמש בדרך כלל כדי לאפיין תזונה צמחונית של lepidoterans, כגון פיאריס ראפא (לבן קטן), פ xylostella, או ט ני בזחל או גלמים שלהם בשלבי ^15,17.

קרדית עכביש תא התוכן Feeders. נזק הנגרם לקרדית מוכר כאוסף של כתמי chlorotic שטווח צבע לבן חיוורים ירוק. הרגישות של מארח מפעל לherbivory קרדית העכביש הוערכה או בעקיפין בעבר באמצעות הניתוח של ימי ביצועי קרדית עכביש לאחר ^{שריצה-18,19,} או ישירות באמצעות מורפולוגיה ברוטו של שבועות צמחים שלאחר שריצה ¹⁸ או באמצעות הדמיה דיגיטלית של עלים חשופים לקרדית במשך ימים עם ניתוח תמונה אוטומטי לאחר ^19. שיטות אלה היו מפותחות ומשמשות למחקרים של אינטראקציות בין צמחי עגבניות וט urticae, ומשמש בדרך כלל מספר הקטן של קרדית עכביש (5-15 לכל טיפול), שנגבו מאוכלוסיית קרדית המעורבת והונחו על פני העלה בעזרת מברשת זיפים רכה. עם זאת, שיטות אלו אינן מתאימות למחקרים שבם מספר גדול יותר של קרדית צריך להיות מיושם. בנוסף, בעוד שעיבוד ישיר של תמונות עלה בתוכנת ניתוח תמונהכגון Adobe Photoshop (סן חוזה, קליפורניה) או ²⁰ ImageJ יכולה לשמש לניתוח של נזק עגבניות, הפרוטוקולים האלה צריכים שינוי כדי להיות מיושמים על עלים שיש לי רפלקטיביות גדולה יותר של פני השטח או נצבעים באורח קל ויש לי trichomes הבולט מאוד ( למשל, thaliana א ') שמפריעים לבחירה אוטומטית של נקודות chlorotic המציינות נזק צמח. יתר על כן, השלב ההתפתחותי של קרדית עכביש שיכול להיות מנוצל בקלות עם השיטות הקודמות מוגבל לנשים בוגרות והנפוצות ביותר לזיהוי בקלות ומונע ניצול של שלבי התפתחות אחרים.

הצעד הקריטי הראשון לקראת ניתוח תפוקה גבוהה של אינטראקציה קרדית צמחים עכביש הוא להקים פרוטוקולים לשחזור, פשוט וחזקים לאתגר את צמחים עם קרדית עכביש ואמין להעריך את תוצאות אינטראקציה.

בסרטון הזה, שיטה יעילה לאיסוף מהיר וקל של num גדולבער של קרדית נקבה בוגרת, היישום שלהם על מארח ניסיוני צמח, וההערכה של נזק הצמח בשל האכלת קרדית עכביש מתוארים. הפרוטוקול המובא מאפשר איסוף מהיר ויעיל של מאות אנשים בכל שלב התפתחותי (ביצים, זחלים, נימפות, זכרים בוגרים, ונשים) שיכול לשמש ליישום ניסיוני שלאחר מכן. בנוסף, ניתן ליישם פרוטוקולים אלה לכל צמח מארח קרדית, אבל באופן ספציפי הוכיחו במקרה של א ' thaliana.

Protocol

1. תחזוקה של עכביש קרדית האוכלוסייה

הערה: קרדית עכביש שגדל על קליפורניה כליה אדומה שעועית (Phaseolus vulgaris).

1. לגדל צמחי שעועית מזרעים ל2-3 שבועות לפני שריצה.
2. Intermix הצמחים האלה עם צמחים שורצים; קרדית למבוגרים תהיה במהירות ליישב חומר צמחי טרי.
3. הסר צמחי שעועית שורצים ישנים כל 7-10 ימים, והחליף אותם עם צמחים טריים.

2. איסוף למבוגרים נקבה קרדית

1. קרדית אוסף באמצעות שיטת כביסה
   1. לאסוף קרדית, למקם את צמח שעועית טרי במגע עם צמחים נגועים 1 עד 2 ימים לפני הניסוי.
   2. השתמש 20-30 צמחי שעועית טריים לאסוף 1,000 עד 2,000 קרדית נקבה בוגרת.
   3. הכן פתרון של Tween 20 ב0.001% משימוש במים ברז ב RT.
   4. שטוף צמחי שעועית נגועות בפתרון Tween 20, באמצעות 2 עד 3 צמחים בכל פעם.
   5. כל צמח הוא שטף 2-3x לאסוף את כל קרדית מעלים.
   6. צעד להשלים 2.1.4 בתוך 10 דקות, כדי למנוע תמותת קרדית.
2. בידוד של קרדית נקבה הבוגרת על ידי סינון של ההשעיה קרדית דרך מסננות של גודל רשת מוגדרת
   1. הכן את מסננות של גדלי הרשת הבאים: 500 מיקרומטר (כדי להסיר שאריות) ו300 מיקרומטר (לאסוף קרדית למבוגרים נקבה) (איור 1 א).
   2. סנן את ההשעיה דרך מסננת מיקרומטר 500.
   3. Refilter ההשעיה דרך מסננת מיקרומטר 300. קרדית נקבה בוגרת תישמר.
   4. טובלים מסננת 300 מיקרומטר עם קרדית נקבה בוגרת במים ברז נקיים כדי להסיר Tween 20.
   5. מורחים קרדית בשכבה אחת בתחתית המסננת.
   6. השתמש במגבת נייר כדי להסיר את עודפי מים מהרשת והצדדים של המסננת. הערה: זה נעשה משום קרדית צריכה להתייבש במהירות על מנת להתאושש.
   7. הכן את ההרכבה כפי שמוצג באיור 1ב '; זה יאפשר קרדית לנוע בחופשיות, אבל ימנע מהם לברוח.
   8. מניחים את המסננת עם קרדית על גבי המסננת המשמשת כתמיכה.
   9. הקף את המסננת תחתונה עם מים כדי למנוע קרדית מהפיזור. הערה: קרדית תתחיל מתאוששת לאחר כ 5 דקות. לאחר כ 30 דקות, מספר קרדית נעה מספיק כדי להתחיל אוסף (1D איור). קרדית צריכה להיות שנאסף במסגרת 1 שעות, כפי שהם מייצרים משי שיפריע לאוסף.

3. צמח שריצה עם קרדית

הערה: ברגע שקרדית נקבה בוגרת התאוששה, הם יכולים לשמש להתפשטות צמח. ישנן 2 שיטות המשמשות לשורצים צמחים ניסיוניים עם קרדית נקבה בוגרת:) בעזרת מברשת עדינה (סעיף פרוטוקול 3.1) ו ב) באמצעות משאבה או קו ואקום (סעיף פרוטוקול 3.2).

1. קרדית ריצתה באמצעות מברשת
   הערה: התפשטות קרדית עכבישעם מברשת משמשת ליישום של עד 30 קרדית לכל צמח.
   1. השתמש במברשת שיער רכה עגולה אמנות גודל 00 או עדינה.
   2. הרטב את המברשת במים ברז RT.
   3. בעדינות להרים את קרדית מן המסננת בעזרת קצה המברשת ולהעביר אותם למפעל.
2. קרדית ריצה באמצעות משאבה
   הערה: התפשטות צמח עם קרדית שנאסף על ידי קו משאבה / ואקום משמשת כאשר יותר מ 30 קרדית מוחלות. לשיטה זו, ניתן להשתמש במשאבת ואקום לאיסוף רכיבי המיקרואלקטרוניקה או קו ואקום. זה חשוב כדי לשמור על זרימת האוויר הקבוע ושל כוח מספיק (2-4 psi).
   1. צרף קצה פיפטה 1 מיליליטר לצינור המתחבר לקו משאבת ואקום או באמצעות קיצוץ 1.5 מיליליטר צינור צנטריפוגות בתחתית כמתאם בין צינור משאבה / ואקום והעצה.
   2. מניחים פיסת מגבת נייר בין קצה פיפטה והמתאם (צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר). הערה: המטרה של זה היא לקרדית מלכודת בתוך tהוא פיפטה קצה במהלך תהליך השאיפה וגם כדי להפחית את זרימת האוויר (איור 1 ג).
   3. לאסוף קרדית ישירות מהמסננת באמצעות קצה פיפטה.
   4. לחלופין, לאסוף קרדית אחד אחד מעלים נגועים באמצעות stereoscope.
   5. כאשר המספר הנדרש של קרדית כבר נאסף, הסר את קצה פיפטה מהצינור, ולוודא כי פיסת מגבת נייר בחלק האחורי של קצה פיפטה באין מפריע.
   6. לאסוף קרדית על ידי הקשה על קצה פיפטה ומקפץ בקרדית יחד. לאחר מכן, מניח אותם על העלה; בתוך שניות, קרדית תתחיל לפזר על העלה.

4. הקלטה ונזק צמח הערכה

1. נזק צמח הקלטה
   הערה: לקבלת א thaliana, צמח נזק מוערך לאחר 4 ימים של האכלת קרדית. נזק נרשם כשטח פנים הכולל של כתמי chlorotic. למדידת נזק, כל שושנה היא לחתוך וסרוק.פרמטרים סריקה תיארו הם עבור סורק Epson V30 אבל ישמשו כנקודת פתיחה טובה לכל סורק דומה. שמור על פרמטרים סריקה קבועים לכל הניסויים המאפשרים השוואה בין ריצות ניסוי בודדות.
   1. כסה מיטת סורק עם גיליון שקיפות כדי למנוע את זיהום פני השטח סורק עם חומר צמחי.
   2. חותכים כל שושנה ומניחים על משטח הסורק, כך צד adaxial (עליון) של עלים מול מקור אור הסורק ואלמנט ללכוד. לחלופין, אם רוזטות צפופה מדי מכדי ללכוד עלים בודדים בלי חפיפה, לנתח את שושנה לתוך עלים או קבוצות של עלים שאינם חופפים עם מספריים עדינים בודדים לפני הנחת על מיטת הסורק. ניתן לסרוק רוזטות מרובה בו זמנית.
   3. כסה רוזטות או עלים עם פיסת נייר לבן כדי למנוע דבקות וזיהום של מכסה הסורק.
   4. כיסוי לסגור סורק ולבצע סריקה עם הפרמטרים הבאים: רזולוציה: 1,200 dpi; מצב צבע: Adobe RGB; בהירות: +25; סוג קובץ: JPEG באיכות מקסימלית.
   5. שמור לניתוח נזק שלאחר מכן קבצי תמונה.
2. כימות נזק צמח
   הערה: האזור של נזק מחושב באופן ידני באמצעות Photoshop. בשל הבדלים גדולים בצורת עלה ועוצמת הצבע של הסימפטומים כתוצאה מהאכלת קרדית, שיטות אוטומטיות היו לא אמינות. לפיכך, שיטת רשת משמשת כדי להעריך את נזק צמח:
   1. פתח את התמונה של הצמח עם פוטושופ.
   2. יצירת שכבה חדשה, ולאחר מכן שכבת תמונה סרוקה עם רשת של 0.25 מ"מ x 0.25 חטיבות מ"מ (הצג או תצוגה - הצג - גריד, קיצור מקלדת Ctrl + ").
   3. בשכבה מעולפת, לסמן אזורי עלה פגומים באמצעות נקודה (להשתמש "עיפרון הכלי", קיצור מקשי B). השתמש בנקודה אחת לכל ריבוע של הרשת שמתחתיו יש נזק המשתרע על יותר ממחצית מיחידת הרשת. הגודל של הנקודה מוגדר בפיקסלים (כלומר, 52 פיקסלים לנקודה).
   4. כאשר כל הריבועים של הרשת שמראים נזק צמח מכסה לפחות מחצית מיחידת הרשת מסומנים בנקודה, להשתמש בכלי היסטוגרמה (חלון - היסטוגרמה) כדי לקבוע את המספר הכולל של פיקסלים על השכבה. כלי היסטוגרמה מאפשר לאדם למדוד את מספר הפיקסלים. מאז כל נקודה מיוצגת על ידי מספר קבוע וידוע של פיקסלים, כלי היסטוגרמה יהיה למדוד את המספר הכולל של פיקסלים, המייצג את המספר הכולל של נקודות, ובהרחבה, את המספר הכולל של ריבועים מסומנים.
   5. לחשב את מספר "נקודות" מסומנות על ידי שימוש בנוסחה:
      מספר הנקודות = מספר כולל של פיקסלים / מספר פיקסל לנקודה.
   6. לחשב את השטח הכולל של נזק על ידי הכפלת מספר הנקודות מסומנות בתמונה על ידי השטח של ריבוע 1 של הרשת, כנקודה אחת מתאימה למשבצת הראשונה של הרשת.

תוצאות

שימוש 20-30 צמחי שעועית שורצים, אחד יכול לאסוף סביב 2,000 קרדית נקבה בוגרת באמצעות הנפות. הזמן הנדרש לשורץ 10 צמחים עם 20 קרדית לכל צמח הוא כ 15 דקות אם בעזרת מברשת להעביר קרדית. שילובים של שיטות איסוף ויישום מוצגים באיור 2.

פרוטוק...

Discussion

וידאו זה מדגים פרוטוקולים משמשים כדי לבודד ושורצים צמחים עם מספר גדול של קרדית נקבה הבוגרת. למרות שהצגנו בפני פרוטוקול זה באמצעות א thaliana, ניתן להשתמש בו לכל מערכת אינטראקציה קרדית צמחים עכביש וכיום הוא מיושם בהצלחה גם על צמחי עגבניות וגפן (vinifera ויטיס). תשואו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant material:
California red kidney bean	Stokes, Thorold, ON, Canada		2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water			At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance
Other materials and equipment:
Plastic tray
Set of scissors
2 L beakers
Paper towels
Sets of sieves	Manufactured in house		Detailed instructions are available
Thin brush
Pipettes
Pipette tips			0.2 and 1 ml
1.5 ml centrifuge tubes
Air pump			Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope
Scanner	Epson	V30	Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer			Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software	Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA	various	Any version with Histogram tool included.