İki-benekli örümcek kenesi Uygulama<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Bitki-belâ Etkileşim Çalışmaları

Özet

Örümcek akarları, deney bitkilerin istilası ve bitki hasar değerlendirme homojen numune etkili hazırlanması için protokoller, bitki-zararlı etkileşim çalışmaları için gerekli olan geliştirilmiştir.

Özet

Iki benekli örümcek, Tetranychus urticae, ekonomik değeri 150'den fazla olan türlerin derece geniş bir dizi, beslenen bir yerde polifag Eklembacaklıların otobur olduğunu. Bu, özellikle Solanaceae ve Cucurbitaceae mısır, pamuk gibi (örneğin, domates, patlıcan, biber, salatalık, kabak) ve sera süs bitkileri (örneğin, gül, krizantem, karanfil), yıllık tarla bitkileri (içinde, sera bitkileri önemli bir zararlı olduğunu soya, şeker pancarı), ve çok yıllık kültürler (yonca, çilek, üzüm, narenciye, ve erik) ^1,2. Önemli bir tarımsal böcek, T. yapan uç polyphagy ek olarak, urticae, kontrolü ^3-7 için kullanılan insektisit ve akarisit geniş bir yelpazeye karşı direnç geliştirmek için bir eğilim vardır.

T. urticae o (27 ° C'de 7 gün) hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olarak, mükemmel bir deneysel organizmadırve kolay bir şekilde, laboratuarda, yüksek yoğunlukta muhafaza edilebilir. (In situ hibridizasyon ve antikor lekelemesi de dahil) gen ekspresyonunu analiz etmek için ve RNA girişimi kullanılarak örümcek kenesi, endojen genlerin ekspresyonunu etkisiz hale getirmek için yöntemler ^8-10 geliştirilmiştir. Son zamanlarda, T. bütün genom sekansı, urticae zaten konukçu bitkiler (Arabidopsis thaliana ve domates Solanum lycopersicum) ¹¹ bazı mevcut eşdeğer genomik kaynaklara sahip bir model organizma olarak bu haşere otobur geliştirmek için bir fırsat yaratma, rapor edilmiştir. Birlikte, bu model organizmalar bitki-böcek etkileşimleri moleküler üsleri içgörüler sağlayabilir.

Burada, hızlı ve kolay bir yetişkin dişi kene, çok sayıda toplama, deneysel bitki ev sahibi üzerindeki uygulama ve nedeniyle örümcek akarı beslenme için bitki hasar değerlendirmesi için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Tr sunulan protokoldaha sonra deney uygulama için kullanılabilecek herhangi bir gelişim aşamasında (yumurta, larva, kurtçuklar, yetişkin erkek ve kadın) bireyler yüzlerce hızlı ve etkin bir toplama ables.

Giriş

Bitki-böcek etkileşimi büyük bilimsel ve ekonomik öneme sahip bir konudur. Bu tarihsel (örneğin domates gibi) hem de bitki ve bitki modeli, A. kullanılarak incelendi thaliana. Her iki durumda da, otobur için bitki duyarlılık otobur saldırı sonrasında ya da dolaylı zararlı performans değerlendirmesi yoluyla doğrudan bitki fenotip değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilir.

Bitki duyarlılık doğrudan ölçümleri çeşitli yöntemler kullanılarak böcek pest türlerin bir dizi için daha önce kullanılmıştır. Örneğin, lepidopteran larvaların herbivory bir ızgara ¹² yardımıyla, çıplak göz ile Plutella xylostella (diamondback moth) veya Trichoplusia ni (Lahana kurdu) tarafından tüketilen ya da bitki dokusunun bir bölümünün bir tahmin olarak ölçülür. Ayrıca, daha sonra kantitatif görüntü analizi ile yaprak hasarı dijital görüntüleme kullanan yöntem vardır. Bu yöntemler kullanılmıştırA. çalışmaları Frankliniella occidentalis (batı çiçek bitleri) ^13, Scaptomyza flava (yaprak-madencilik Drosophila) ¹⁴ ve T. ile thaliana'nın etkileşim ni ^15.

Bitki duyarlılık dolaylı ölçümleri yaygın bitki-böcek etkileşimi çalışmalarında kullanılmaktadır. A. Örnek olarak, duyarlılık herbivory persicae yaprak biti Myzus şeftali thaliana'nın genellikle haşere doğurgan ve etkileşim ^16,17 sonra bitkinin brüt morfolojisi açıklaması analizi ile değerlendirilir. A. başka tipik dolaylı gösterge Bir haşereye thalianadan duyarlılık otçulun kuru veya ıslak ağırlık değerlendirmedir. Bu parametre genellikle böyle Pieris rapae (küçük beyaz), P. gibi lepidoterans arasında herbivory, karakterize etmek için kullanılır xylostella, veya T. onların larva veya pupa da ni ^15,17 aşamaları.

Örümcek akarları hücre içeriğini fe vardıreders. Mite kaynaklı hasar soluk yeşil rengi beyazdan aralığı klorotik noktalar topluluğu olarak kabul edilmektedir. Örümcek akarı herbivory bir bitki konakçının duyarlılığı önceden örümcek akarı performans günlerin analizi yoluyla dolaylı olarak değerlendirildi sonrası istila ^18,19, ya da doğrudan bitkiler hafta sonrası istilası ¹⁸ brüt morfolojisini kullanarak veya maruz kalan yaprakların bir dijital görüntüleme kullanarak sonraki otomatik görüntü analizi ¹⁹ gün boyunca akarları için. Bu yöntemler geliştirilmiş ve domates bitki ve T. arasındaki etkileşimleri çalışmaları için kullanılmaya başlandı urticae, ve tipik olarak karma akar popülasyonundan toplandı ve yumuşak bir fırça ile yaprak yüzeyine yerleştirildi örümcek akarlarının az sayıda (tedavi başına 5-15) kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, akarların daha fazla sayıda uygulanması gereken çalışmalar için uygun değildir. Buna ek olarak, yaprak ise görüntülerin doğrudan işleme resim analiz yazılımıAdobe Photoshop (San Jose, CA) veya ImageJ ²⁰ domates hasar analizi için kullanılabilen gibi, bu protokol yüzeyinin daha büyük bir yansıtma yapabilirliği vardır veya açık renkli ve yüksek görünür trikomlar, var (yapraklara uygulanması için değişiklik ihtiyacı bitki hasar işaretlemek klorotik noktalar otomatik seçim ile müdahale, örneğin, A. thaliana). Bundan başka, hali hazırda önceki yöntemlerle kullanılabilir örümcek akarlarının gelişim aşamasında, en yaygın ve kolayca tanımlanabilir yetişkin kadın sınırlı değildir ve diğer gelişim aşamaları kullanımını önleyen edilir.

Bitki örümcek akarı etkileşimi yüksek verimlilik analizi doğru ilk kritik adım örümcek akarları ile bitkiler meydan ve güvenilir bir etkileşim sonuçlarını değerlendirmek için tekrarlanabilir, basit ve sağlam protokoller kurmaktır.

Bu video, büyük bir num hızlı ve kolay toplanması için etkin bir yöntem olarakber yetişkin dişi akarlar, bir deney tesisi ana ve bağlı örümcek akarı beslenmeye bitki zarar değerlendirilmesine ilişkin uygulama açıklanmıştır. Sunulan protokol takip eden deney uygulama için kullanılabilecek herhangi bir gelişim aşamasında (yumurta, larva, kurtçuklar, yetişkin erkek ve kadın) bireyler yüzlerce hızlı ve etkin bir toplama sağlar. Buna ek olarak, bu protokoller bir akarı ana bitkiye uygulanabilir, ama özellikle A. durumunda gösterilmektedir thaliana.

Protokol

Örümcek Mite Nüfus 1. Bakım

NOT: Örümcek akarları (Phaseolus vulgaris) Kaliforniya kırmızı barbunya fasulye yetiştirilir.

1. Önce istilası 2-3 hafta süreyle tohum fasulye bitkileri büyütün.
2. Istila bitkilerle Intermix bu bitkiler; Yetişkin akarlar hızla taze bitki materyali kolonize edecek.
3. Taze bitkiler ile bunların yerine, her 7-10 gün eski musallat fasulye bitkileri sökün.

2.. Yetişkin Kadın Akarlar Toplama

1. Yıkama Yöntemi kullanılarak Koleksiyon mite
   1. Akarları toplamak için, 1-2 gün önce deney enfekte bitkiler ile temas halinde olan bir taze fasulye bitki yer.
   2. 1,000 2,000 yetişkin dişi akarları toplamak için 20 ila 30 taze fasulye bitkileri kullanın.
   3. Oda sıcaklığında musluk suyu ile% 0.001 Tween 20 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
   4. Her seferinde 2-3 bitkileri kullanarak, Tween 20 çözeltisi içinde istila edilmiş fasulye bitkileri yıkayın.
   5. Her bitki yapraklarından tüm akarları toplamak için 2-3x yıkanır.
   6. Komple adım akarı ölümlerini önlemek için 10 dakika içinde 2.1.4.
2. Tanımlı Mesh Boyutu Elek ile Mite Süspansiyon Filtrasyon ile Yetişkin Kadın Akarlar İzolasyonu
   1. Aşağıdaki örgü boyutları elekler hazırlayın: 500 mikron (enkaz kaldırmak için) ve 300 mikron (dişi yetişkin akarları toplamak için) (Şekil 1A).
   2. 500 um elekten süspansiyon filtre.
   3. 300 um elekten süspansiyon Refilter. Yetişkin dişi akarlar muhafaza edilecektir.
   4. Tween 20 kaldırmak için temiz musluk suyu, yetişkin dişi akarları ile 300 mikron elek batırın.
   5. Eleğin altındaki bir tek kat olarak akarlar yayıldı.
   6. Eleğin ağ gözü ve taraftan fazla suyu almak için kağıt havlu kullanın. NOT: akarları kurtarmak için hızla kurumasını gerekir, çünkü bu yapılır.
   7. Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir montaj hazırlayınB; Bu akarlar serbestçe hareket sağlayacak, ama onları kaçmasını önleyecektir.
   8. Bir destek olarak kullanılan elek üstünde akarları elek yerleştirin.
   9. Dağılmasını akarları önlemek için su ile alt elek Surround. NOT: Akarlar sonra yaklaşık 5 dakika kurtarma başlayacak. Yaklaşık 30 dakika sonra, hareketli akar sayısı toplama (Şekil 1D) başlatmak için yeterlidir. Onlar koleksiyonu ile engel olacak ipek üretmek gibi Akarlar, 1 saat içinde alınmalıdır.

Akarlar ile 3. Bitki istila

NOT: Erişkin dişi kene iyileşti sonra, onlar bitki istilası için kullanılabilir. A) ince bir fırça (protokol bölüm 3.1) kullanılarak ve b) bir pompa veya vakum hattı (protokol bölüm 3.2) kullanılarak: Erişkin dişi kene ile deneysel bitkileri istila etmek için kullanılan 2 yöntem vardır.

1. Bir fırça kullanarak Akar istila
   NOT: Örümcek istilasıBir fırça bitki başına 30 kadar akar uygulanması için kullanılan ile.
   1. Büyüklüğü 00 veya daha ince bir yumuşak saçlar yuvarlak sanat fırça kullanın.
   2. RT musluk suyu ile fırça ıslatın.
   3. Yavaşça fırça ucu kullanarak elekten akarları pick up ve tesisine aktaracaktır.
2. Bir Pompa kullanarak Infestationu mite
   NOT: 30'dan akarlar tatbik edildiğinde, bir pompa / vakum hattı ile toplanmıştır akarları ile bitki istilası kullanılır. Bu yöntem için, mikro-elektronik bileşenler alıcı veya bir vakum hattı için bir vakum pompası kullanılabilir. Bu hava akımı sabit ve yeterli mukavemet (2-4 psi) tutmak için önemlidir.
   1. Pompa / vakum tüpü ile ucu arasında bir adaptör olarak altındaki bir 1.5 ml santrifüj tüpü kesme kullanılarak pompa ya da vakum hattına bağlayan bir tüpe 1 ml pipet takın.
   2. Pipet ve adaptörü (1.5 ml santrifüj tüpü) arasında kağıt havlu bir parça yerleştirin. Not: Bu amaçla t içine tuzak akarları içino aspirasyon işlemi sırasında pipet ucu ve aynı zamanda hava akımı (Şekil 1C) azaltmak için.
   3. Pipet kullanarak elekten doğrudan akarları toplayın.
   4. Seçenek olarak ise, bir Stereoskop kullanılarak Sirayet ettirilmiş yapraklardan akarları tek tek toplar.
   5. Akarların gerekli sayıda alındıktan sonra, pipet ucu arkasında kağıt havlu parçası rahatsız olduğundan emin olun, tüpten pipet çıkarın.
   6. Pipet dokunarak ve birlikte akarları kümeleyerek akarları toplayın. Daha sonra, yaprak üzerine koyun; saniye içinde, akarlar yaprak dağılmaya başlar.

4.. Kayıt ve değerlendirilmesi Bitki Hasar

1. Kayıt Bitki Hasar
   NOT: A için thaliana, bitki hasar akar besleme 4 gün sonra değerlendirilir. Hasar klorotik noktaların toplam yüzey alanı olarak kaydedilir. Hasar ölçümü için, tüm rozet kesilir ve taranır.Açıklanan tarama parametreleri Epson V30 tarayıcı için ancak benzer herhangi bir masaüstü tarayıcı için iyi bir başlangıç ​​noktası olarak hareket edecektir. Sağlayan tüm deneyler için sabit tarama parametrelerini tutmak bireysel deneme seferleri arasında karşılaştırma.
   1. Bitki materyali ile tarayıcı yüzeydeki önlemek için şeffaflık levha ile tarayıcı yatak örtün.
   2. Yani yaprakların adaxial (üst) taraf tarayıcı ışık kaynağı ve yakalama elemanı karşı karşıya tarayıcı yatağına bütün bir rozet ve yeri kesin. Alternatif olarak, rozet tarayıcı yatağa koymadan önce tek tek yaprakların veya ince makas ile örtüşmeyen yaprakları gruba rozet teşrih, örtüşme olmadan bireysel yaprakları yakalamak için çok yoğun eğer. Çoklu prizler aynı anda taranabilir.
   3. Bağlılık ve tarayıcı kapağının kirlenmesini önlemek için beyaz bir kağıt parçası ile rozet veya örtün.
   4. Yakın tarayıcı kapağı ve aşağıdaki parametreler ile bir tarama gerçekleştirin: Çözünürlük: 1,200 dpi; Renk modu: Adobe RGB; Parlaklık: +25; Dosya türü: maksimum kalite JPEG.
   5. Sonraki zarar analiz için görüntü dosyaları kaydedin.
2. Bitki Hasar miktarının
   NOT: hasar alan elle Photoshop kullanılarak hesaplanır. Nedeniyle akarı beslenme sonucu yaprak şekli ve semptomların renk yoğunluğundaki büyük farklılıklara bağlı olarak, otomatik yöntemler güvenilmez. Bu durumda, bir ızgara yöntem bitki hasarı değerlendirmek için kullanılır:
   1. Photoshop ile bitkinin görüntü açın.
   2. (- Show - Izgara, klavye kısayolu Ctrl + 'görüntüleme veya Display), yeni bir katman oluşturun, sonra da 0.25 mm x 0.25 mm bölünmeleri bir ızgara ile taranan görüntüyü kaplayabilirsiniz.
   3. Kalıplı bir katmanda, bir nokta ("Kalem Aracı", klavye kısayolu B kullanımı) kullanarak hasarlı yaprak alanları işaretleyin. Izgara birimi birden fazla yarısını kapsayan bir hasar var olduğu aşağıdaki ızgaranın her bir kare için bir tek bir nokta kullanın. Nokta büyüklüğü (piksel tanımlanır, yani, Nokta başına 52 piksel).
   4. Katmanda piksel sayısını belirlemek için - ızgara ünitesinin en az yarısını kaplayan bitki zarar göstermek ızgara tüm kareler bir nokta ile işaretli olduğunda, histogram aracı (Histogram Penceresi) kullanabilirsiniz. Histogram aracı, piksel sayısını ölçmek için bir izin verir. Her bir nokta piksel sabit ve belli bir sayı ile temsil edildiğinden, histogram aracı, uzantısı, noktaların toplam sayısını temsil eden toplam piksel sayısını ölçmek ve işaretlenmiş olan kareler toplam sayısı.
   5. Formül kullanılarak işaretlenen "nokta" sayısını hesaplayın:
      Nokta sayısı = nokta başına piksel piksel sayısı / toplam sayısı.
   6. Bir nokta ızgara bir kare karşılık olarak, ızgara 1 kare alanı ile görüntü üzerinde işaretlenen noktaların sayısını çarparak hasar toplam alanı hesaplayın.

Sonuçlar

20 ile 30 musallat fasulye bitkileri kullanarak bir elekler kullanılarak yaklaşık 2.000 yetişkin dişi akarları toplayabilirsiniz. Keneden aktarmak için bir fırça kullanıyorsanız, bitki başına 20 akarları ile 10 bitkilerin istila için gerekli süre yaklaşık olarak 15 dk. Toplanması ve uygulama yöntemleri kombinasyonları, Şekil 2'de gösterilmiştir.

Bu protokol toplanan akarları benzer fizyolojik durumuna ve bitki örümcek akarı etkileşim çalış...

Tartışmalar

Bu video izole etmek ve yetişkin dişi kene, çok sayıda bitkileri istila için kullanılan protokoller gösterir. Biz A. kullanarak bu protokolü sunulmasına rağmen thaliana, herhangi bir bitki örümcek akarı etkileşim sistemi için kullanılabilir ve halen başarılı bir şekilde, domates ve üzüm (Vitis vinifera) bitkiler üzerinde de tatbik edilmektedir. Toplanan akar (Şekil 3) benzer fizyolojik durumu olduğuna işaret protokol verimleri tekrarlanabilir sonuçla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant material:
California red kidney bean	Stokes, Thorold, ON, Canada		2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water			At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance
Other materials and equipment:
Plastic tray
Set of scissors
2 L beakers
Paper towels
Sets of sieves	Manufactured in house		Detailed instructions are available
Thin brush
Pipettes
Pipette tips			0.2 and 1 ml
1.5 ml centrifuge tubes
Air pump			Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope
Scanner	Epson	V30	Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer			Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software	Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA	various	Any version with Histogram tool included.