Применение Два выставления паутинный клещ<em&gt; Tetranychus Urticae</em&gt; Для растений-вредителей взаимодействию исследований

Резюме

Протоколы для эффективной подготовки однородных образцов паутинных клещей, вредителей экспериментальных растений и оценки ущерба растений, как это требуется для исследований растений вредителями взаимодействия были разработаны.

Аннотация

Два-пятнистый паутинный клещ, Tetranychus Urticae, является повсеместное многоядны членистоногих травоядное который питается удивительно широкого спектра видов, с более чем 150 из экономической ценности. Она является основным вредителем тепличных культур, особенно в пасленовых и тыквенных (например, помидоры, баклажаны, перец, огурцы, цуккини) и парниковых украшения (например, розы, хризантемы, гвоздики), годовые полевых культур (таких как кукуруза, хлопок, соя, и сахарная свекла), а в многолетних культур (люцерна, клубника, виноград, цитрусовые, и сливы) ^1,2. В дополнение к крайней полифагии, что делает его важным сельскохозяйственным вредителем, Т. Urticae имеет тенденцию к развитию устойчивость к широкому спектру инсектицидов и акарицидов, которые используются для его контролем ^3-7.

Т. Urticae является отличным экспериментальный организм, так как она имеет быстрое жизненный цикл (7 дней при 27 ° С)и может быть легко поддерживать при высокой плотности в лаборатории. Методы анализа экспрессии генов (в том числе в гибридизация и окрашивания антител) и инактивируют выражение паутинного клеща эндогенных генов с помощью РНК-интерференции были разработаны ^8-10. В последнее время вся последовательность генома T. Urticae сообщалось, создавая возможности для развития этого вредителя травоядных в качестве модельного организма с эквивалентными геномных ресурсов, которые уже существуют в некоторых своих растений-хозяев (арабидопсис и томатный Solanum Lycopersicum) ^11. Вместе эти модельные организмы могли дать ответ на молекулярных основ завод-вредителей взаимодействий.

Здесь, эффективный метод для быстрого и легкого сбора большого количества взрослых самок клещей, их применения на экспериментальной растения-хозяина, и оценки ущерба растений из-за паутинный клещ кормления описаны. Представленный протокол анAbles быстрый и эффективный сбор сотен людей на любом этапе развития (яйца, личинки, нимфы, взрослые мужчины, и женщины), которые могут быть использованы для последующей экспериментальной применения.

Введение

Завод-вредителями взаимодействие является тема представляет большой научное и экономическое значение. Это исторически изучены с использованием как культурные растения (например, помидор) и модель завода, А. THALIANA. В обоих случаях, восприимчивость растений к травоядным можно измерить либо непосредственно через оценке фенотипа растений после травоядных нападения или косвенно, через оценки эффективности борьбы с вредителями.

Прямые измерения растений восприимчивости были использованы ранее для ряда видов насекомых-вредителей, используя ряд методов. Например, herbivory чешуекрылых личинок измеряется как оценки части растительной ткани, потребляемой либо Plutella xylostella (капустной моли) или Trichoplusia Ni (совка) невооруженным глазом с помощью сетки ^12. Кроме того, существуют методы, которые используют цифровую съемку повреждения листьев с последующим количественным анализом изображения. Такие методы были использованы висследования А. THALIANA взаимодействие с Frankliniella западная (западные цветочный трипс) ^13, Scaptomyza Flava (минирующих дрозофила) ¹⁴ и Т. Ni ^15.

Косвенные измерения растительного восприимчивости широко используются в исследованиях растений вредителями взаимодействия. Например, восприимчивость А. THALIANA чтобы персиковая тля Myzus persicae herbivory обычно оценивается с помощью анализа с вредителями плодовитости и описание валового морфологии растений после взаимодействия ^16,17. Другой типичный косвенным показателем А. THALIANA восприимчивость к вредителя является сухой или влажный оценка вес травоядного. Этот параметр обычно используется для характеристики herbivory из lepidoterans, например Pieris rapae (маленький белый), P. xylostella или Т. Ni на их личинок или куколок этапы ^15,17.

Паутинный клещ являются клетки-Содержание Feeders. Повреждение Клещ-индуцированной признан коллекции хлоротичных пятен, которые варьируются по цвету от белого до бледно-зеленого цвета. Восприимчивость растения-хозяина к паутинный клещ herbivory ранее оценивали либо косвенно через анализ дней паук производительности клеща после заражения ^18,19, или непосредственно валовой морфология растений недель после вредителей ¹⁸ или с помощью цифровых изображений листьев подвергается с клещами в течение нескольких дней с последующим автоматизированного анализа изображений ^19. В настоящее время разрабатываются Эти методы и используется для изучения взаимодействий между томатов и Т. Urticae, и обычно используется в небольших количествах паутинного клеща (5-15 за лечение), которые были собраны из смешанного населения клеща и были размещены на поверхности листьев, используя щетку с мягкой щетиной. Однако эти способы не подходят для исследований, в которых большее число клещей должны быть применены. Кроме того, в то время как непосредственная обработка листовых изображений в программном обеспечении для анализа изображенийтакие как Adobe Photoshop (San Jose, CA) или ImageJ ²⁰ может быть использован для анализа повреждений томатов, эти протоколы требуют модификации для того, чтобы быть применены к листьев, которые имеют большую отражательную способность поверхности или слегка окрашенных и имеют хорошо видимые трихомы ( например, А. THALIANA), что мешает автоматизированной отбора хлоротичных пятен, которые отмечают повреждения растений. Кроме того, стадия развития паутинных клещей, которые могут быть легко использованы с предыдущими методами ограничивается наиболее распространенных и легко идентифицируемых взрослых самок и исключает использование других стадиях развития.

Первый критический шаг к высокой пропускной анализа растений паутинный клещ взаимодействия является установление воспроизводимые, простые и надежные протоколы, чтобы бросить вызов растения с паутинного клеща и надежно оценивать результаты взаимодействия.

В этом видео, эффективный метод для быстрого и легкого сбора большого питBER взрослых самок клещей, их применение на экспериментальной растения-хозяина, и оценки ущерба растений из-за паутинный клещ кормления описаны. Представленный протокол позволяет быстро и эффективно коллекцию сотен людей на любом этапе развития (яйца, личинки, нимфы, взрослые мужчины, и женщины), которые могут быть использованы для последующей экспериментальной применения. Кроме того, эти протоколы могут быть применены к любому хост-клещ растения, но конкретно продемонстрировано в случае А. THALIANA.

протокол

1. Ведение паутинный клещ населения

ПРИМЕЧАНИЕ: паутинный клещ выращивают на калифорнийских красная фасоль (Phaseolus обыкновенная).

1. Расти бобовые растения из семян в течение 2-3 недель до заражения.
2. INTERMIX эти растения с зараженных растений; взрослые клещи быстро колонизировать свежий растительный материал.
3. Удалить старые кишащие бобовые растения каждые 7-10 дней, заменив их свежих растений.

2. Сбор взрослых самок клещей

1. Mite Коллекция помощью Стиральные Метод
   1. Для сбора клещей, поместите свежий боб завод в контакте с пораженных растений от 1 до 2 дней до эксперимента.
   2. Используйте от 20 до 30 свежих бобов растения собирать от 1000 до 2000 взрослых самок клещей.
   3. Готовят раствор Tween 20 при 0,001% с использованием водопроводной воды при комнатной температуре.
   4. Промыть зараженных растений фасоли в растворе Tween 20, с использованием 2 до 3 растения одновременно.
   5. Каждое растение промывают 2-3x, чтобы собрать все клещей из листьев.
   6. Полный шаг 2.1.4 в течение 10 мин, чтобы избежать клеща смертности.
2. Выделение взрослых самок клещей фильтрацией суспензии клеща через сита определенных ячеи
   1. Подготовка сита следующими размерами ячеек: 500 мкм (для удаления мусора) и 300 мкм (для сбора женские взрослых клещей) (рис. 1А).
   2. Суспензию фильтруют через мкм сито 500.
   3. Refilter суспензии через сито 300 мкм. Взрослых самок клещей будут сохранены.
   4. Опустите 300 мкм сито с взрослыми женщинами клещей в чистой водопроводной водой для удаления Твин 20.
   5. Распространение клещей в один слой в нижней части сита.
   6. Используйте бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю воду из сетки и по бокам сито. ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается потому, клещи нужно быстро высушить, чтобы восстановить.
   7. Подготовить сборку как показано на рисунке 1В; это позволит клещи свободно передвигаться, но предотвратить их от побега.
   8. Поместите сито с клещами в верхней части сита, используемого в качестве опоры.
   9. Объемный нижнее сито с водой, чтобы предотвратить клещей диспергирования. ПРИМЕЧАНИЕ: Клещи начнет восстанавливаться после примерно 5 мин. После примерно 30 мин, число подвижных клещей достаточно, чтобы начать коллекцию (рис. 1D). Клещи должны быть собраны в течение 1 ч, поскольку они производят шелк, которые будут мешать коллекции.

3. Завод Зараженность клещей

Примечание: После того, как взрослых самок клещей восстановились, они могут быть использованы для растений инвазии. Есть 2 методы, используемые для заражения экспериментальных установок с взрослыми женщинами клещей: а) с помощью тонкой кисти (раздел протокола 3.1) и б), используя насос или вакуумный трубопровод (раздел протокола 3.2).

1. Клещ Заражение используя кисть
   ПРИМЕЧАНИЕ: Паутинный клещ заражениес кистью используется для применения до 30 клещей на растение.
   1. Используйте мягкую волос круглый искусства кисть размером 00 или мельче.
   2. Влажные щеткой с RT водопроводной воды.
   3. Аккуратно поднять клещей из сита с помощью кончика кисти и передавать их на завод.
2. Инвазии клеща с помощью насоса
   ПРИМЕЧАНИЕ: заражение растений с клещами, собранных с помощью насоса / вакуумной линии используется при более 30 клещей применяются. Для этого метода, вакуумный насос для микроэлектронные компоненты датчика или вакуумной линии можно использовать. Важно поддерживать постоянную воздушного потока и обладать достаточной прочностью (2-4 пси).
   1. Прикрепите пипетки на 1 мл в пробирку, который подключается к насоса или вакуумной линии с помощью разреза 1,5 мл трубки центрифуги в нижней качестве адаптера между насос / вакуумной трубки и чаевых.
   2. Место кусок бумажного полотенца между кончиком пипетки и адаптером (1,5 мл трубки центрифуги). ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого является для улавливания клещей внутри тон пипетки в процессе аспирации, а также уменьшить расход воздуха (рис. 1в).
   3. Сбор клещей прямо из сита с помощью пипетки.
   4. Альтернативно, клещи собрать один за другим из зараженных листьев с использованием стереоскоп.
   5. Когда требуемое количество клещей были собраны, удалить пипетки из трубки, убедившись, что кусок бумажного полотенца в задней части наконечника пипетки не нарушается.
   6. Сбор клещей, нажав пипетки и слипания клещей вместе. Затем поместите их на лист; в течение нескольких секунд, клещи начнут расходиться на листе.

4. Запись и оценки ущерба завод

1. Нанесенный Запись завод
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для А. THALIANA, повреждение растений оценивается после 4 дней клеща кормления. Нанесенный записывается как общей площади поверхности хлоротичных пятен. Для измерения ущерба, вся розетка вырезать и сканируются.Параметры сканирования описанные для V30 сканера Epson но будет выступать в качестве хорошей отправной точкой для любого аналогичного планшетного сканера. Держите параметры сканирования постоянна для всех экспериментов позволяет сравнение между отдельными трасс эксперимента.
   1. Крышка сканера кровать с прозрачностью листа для предотвращения загрязнения поверхности сканера растительного материала.
   2. Вырезать всю розетку и место на планшете сканера так адаксиальная (верхняя) сторона листьев сталкиваются источник сканер света и захвата элемент. Кроме того, если розетки слишком плотная, чтобы захватить отдельные листья без перекрытия, рассекают розетка на отдельные листья или групп непересекающихся листьев с мелкими ножницами перед размещением на планшете сканера. Несколько розетки могут быть отсканированы одновременно.
   3. Обложка розеток или листья с лист белой бумаги, чтобы предотвратить присоединение к и загрязнение крышки сканера.
   4. Закройте крышку сканера и выполнить сканирование со следующими параметрами: Разрешение: 1,200 точек на дюйм; Цветовая модель: Adobe RGB; Яркость: +25; Тип файла: максимальное качество JPEG.
   5. Сохранить файлы изображений для последующего анализа повреждений.
2. Нанесенный завод Количественное
   ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь повреждения рассчитывается вручную с помощью Photoshop. Из-за больших различий в форме листьев и интенсивности цвета симптомов в результате кормления клещей, автоматические методы были ненадежными. Таким образом, способ сетка используется для оценки ущерба растений:
   1. Откройте изображение завода с Photoshop.
   2. Создайте новый слой, затем наложить отсканированное изображение с сеткой 0,25 мм х 0,25 мм подразделения (вид или дисплей - шоу - Сетка, сочетание клавиш Ctrl + ').
   3. На накладным слоем, отметьте поврежденные листьев области, используя точку (использовать "Pencil Tool", сочетание клавиш B). Используйте одну единственную точку для каждого квадрата сетки, ниже которого есть повреждения покрывали более половины сетки блока. Размер точкой определяется в пикселях (т.е. 52 пикселей на точку).
   4. Когда все квадраты сетки, которые показывают повреждение растительного покрова по крайней мере половину сетки блока помечаются точкой, используйте гистограммы инструмент (Окно - Гистограмма), чтобы определить общее количество пикселей на слое. Инструмент Гистограмма позволяет, чтобы измерить количество пикселей. Поскольку каждая точка представлена ​​постоянным и известным числом пикселей, инструмент Гистограмма будет измерять общее количество пикселей, что составляет общее количество точек, и, как следствие, общее количество отмеченных квадратов.
   5. Рассчитать количество "точек", отмеченных по формуле:
      Количество точек = общее количество пикселей / количество пиксел на точку.
   6. Вычислить общую площадь повреждений путем умножения количества отмеченных точек на изображении в области 1 квадрата сетки, как одна точка соответствует одному квадрата сетки.

Результаты

Использование 20 до 30 зараженных бобовые растения, можно собрать около 2000 взрослых самок клещей с помощью сита. Время, необходимое для заражения 10 заводов с 20 клещей на растение находится примерно в 15 минут, если с помощью кисти передать клещей. Комбинации сбора и применения методов пока...

Обсуждение

Это видео демонстрирует протоколы, используемые для изоляции и заражать растения с большим количеством взрослых самок клещей. Хотя мы представили этот протокол, используя A. THALIANA, он может быть использован для любого завода-паука системе клеща взаимодействия и в настоящее время у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant material:
California red kidney bean	Stokes, Thorold, ON, Canada		2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water			At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance
Other materials and equipment:
Plastic tray
Set of scissors
2 L beakers
Paper towels
Sets of sieves	Manufactured in house		Detailed instructions are available
Thin brush
Pipettes
Pipette tips			0.2 and 1 ml
1.5 ml centrifuge tubes
Air pump			Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope
Scanner	Epson	V30	Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer			Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software	Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA	various	Any version with Histogram tool included.