מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

Summary

תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.

Abstract

תגובות אלרגיות הן התוצאה של הפעלת תאי מאסט ובזופילים, ואת שחרורו הבא של vasoactive ומתווכים מעודדי דלקת. חשיפה לאלרגן באדם רגיש יכולה לגרום לתסמינים קליניים המשתנים מאריתמה הקטין לאנפילקסיס סכנת חיים. במעבדה, מודלים של בעלי חיים שונים פותחו כדי להבין את מנגנוני נהיגה תגובות אלרגיות. בזאת, אנו מתארים שיטה מפורטת למדידת שינויים בחדירות כלי דם לכמת תגובות אלרגיות מקומיות. Assay אנפילקסיס המקומי דווח לראשונה ב1920s, והותאם מהטכניקה שפורסמה על ידי אל Kojima et. ב2007 ^1. ב assay זה, עכברים רגישים לOVA מאותגרים באוזן השמאל עם רכב ובאוזן ימין עם OVA. זה ואחריו הזרקה תוך ורידית של צבע אוונס הכחול. עשר דקות לאחר הזרקת אוונס הכחול, בעלי החיים הוא מורדמים והצבע שextravasated בלאוזניים מופק לילה בפוראמיד. הספיגה של הצבע שחולץ לאחר מכן לכמת עם ספקטרופוטומטר. שיטה זו באופן מהימן תוצאות בביטוי חזותי וכימות של תגובה אלרגית מקומית.

Introduction

סוג אני רגישות יתר מתווך על ידי-Induced אנטיגן cross-linking של IgE על פני השטח של תא פיטום ובזופילים. התוצאה היא degranulation הסלולרי והשחרור של מתווכי vasoactive ומעודדים דלקת כגון היסטמין, tryptase, וגורם ² שמפעיל את טסיות דם. בעקבות השחרור של מתווכים, מעוצב מראש, במהלך degranulation, תאי פיטום לסנתז ולשחרר פרוסטגלנדינים ולאוקוטריאנים, המגדיל את חדירות כלי דם ³ נוסף. התגובה הקלינית הראשונית מתרחשת במהירות, והוא מכונה "תגובה מיידית". בעור, תגובת wheal ו- התלקחות גלויה בקלות בתוך דקות של אתגר אנטיגן. בהתאם למינון של האתגר, אפשר לצפות "תגובת שלב מאוחר" כמה שעות מאוחר יותר. נפיחות שלב המאוחרות בשל בצקת מקומית וגיוס ליקוציט לתוך הרקמות ^2. היסטמין, בדרך כלל נחשב למתווך העיקרי לוקח חלק בתגובות אלרגיות מיידיות, פועלת על קולטן היסטמין 1 (HR1) הביעה בכלי וקולט היסטמין 2 (HR2) הביע על שריר חלק. ההשפעה המשולבת מגבירה את זרימת דם וחדירות כלי דם באתר של דלקת ^4.

מגוון רחב של מודלים של בעלי החיים של אלרגיה פותחו כדי לחקור את המנגנונים מעורבים בדלקת אלרגית, כולל מודלים של אסתמה אלרגית, אנפילקסיס המערכתי, ואנפילקסיס המקומי. ממשל צבע תוך ורידים נעשה שימוש כדי למדוד את התגובות אלרגיות מקומיות במודלים של בעלי חיים לכמעט מאה שנה, עם פרסומים המתארים היכרויות טכניקה זו חזרה ל1920s ^5. ארנבות ושרקנים היו המודלים של בעלי החיים הראשונים משמשים לבדיקת תגובות של רגישות יתר מיידיות, והתגובות רגישות ביותר נמצאו בדרך כלל באוזן ^5,6. Assay מאוחר יותר תוקף לשימוש בחולדות ועכברים ^{7 8.}

מבחינה הסטורית,מגוון של שיטות ניסיוניות היה בשימוש, כולל הזרקה של אנטיגן לפני הזריקה של צבע, הזרקה של צבע לפני הזריקה של אנטיגן, והזרקה בו זמנית של צבע ואנטיגן. ממשל צבע תוך ורידים כאמצעי למדידת תגובות אלרגיות הוא assay צדדי כפי שהוא יכול לשמש למדידה פעילה, פסיבי, ולהפוך את תגובות פסיביות ^5,9. צבעים רבים כבר נוצלו כדי להעריך את תגובות אלרגיות, כולל Trypan הכחול, Pontamine שמיים כחולים, אוונס הכחול, Geigy הכחול 536, והודו דיו ^5,6,9. פתרון של .0.5% כחול אוואנס הוא כיום הצבע הסטנדרטי המשמש למדידת תגובות אלרגיות בעור.

התגובה אנפילקטית לאתגר היא חולפת; הוא הגיע בעוצמה מקסימלית בתוך 10 - 15 דקות של הזרקת צבע, ואין תגובה היא גלויה אם צבע מנוהל יותר מ 30 דקות אחרי האתגר, ללא קשר למינים של בעלי החיים המשמשים ^9. כימות של extravasation הצבע הייתה מקוריתly מתקבל על ידי מדידת גודל wheal כפי שצוין על ידי הצבע הכחול ^7-9. בנוסף, סעיפים של תאי פיטום degranulated ניתן לכמת על ידי כריתת רקמת עור מהאתר של התגובה וצביעה עם toluidine הכחול ^7. degranulation תא פיטום משמש לעתים קרובות כסמן לעורית, תגובות אלרגיות בתיווך IgE, כתאי פיטום הם אוכלוסיית התא המקומית העיקרית המבטאת את הזיקה הגבוהה IgE קולט FcεRI. טכניקות spectrophotometric למדידת extravasation צבע לתוך הרקמות פותחו לאנפילקסיס הפסיבי עורית (PCA) בחולדה ^{10 ו11} העכבר של 1990.

פרוטוקול assay אנפילקסיס המקומי הבא הותאם מאל Kojima et. ^1, ומנצל ovalbumin ביצת עוף (OVA) כאנטיגן ללעורר תגובות אלרגיות. עם זאת, ניתן להשתמש באנטיגנים אחרים מאשר OVA אם תרצה בכך. Assay אז משתמש לצבוע אוונס הכחול לעקוב אחר שינויים בpermeabilit כלי הדםy המתרחשים עקב תורן תא קישור צולב IgE ושחרור היסטמין.

Protocol

.1 עכברים לרגש

1. הכן פתרון מניות OVA על ידי דילול OVA ב1x PBS לריכוז סופי של 20 מ"ג / מ"ל. להקפיא את aliquots בcryovials ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי.
2. להביא aliquots אחד או יותר מ20 מ"ג / מניית OVA מ"ל לטמפרטורת חדר. לדלל OVA ב1x PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל ​​בצינור 5 מ"ל קלקר עגול תחתון עם כובע. בקצרה מערבולת לערבב.
3. בעוד מחזיק את צינור הקלקר המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​OVA במערבולת להגדיר במהירות בינונית, מוסיף נפח שווה של אלום הומוגני ביסודיות Imject (40 מ"ג / מ"ל) dropwise תוך המשך מערבולת הצינור כדי לייצר יחס של 1: 1 של אלום לimmunogen.
4. הנח כובע על צינור צינור וקלטת למערבולת. הפעל מערבולת בהגדרה הנמוכה ביותר ולאפשר OVA לספוג לאלום ל30 דקות.
   1. אל תאפשר לכמות גדולה של זמן כדי לעבור בין הכנת OVA / אלום ורגישות עכברים. אם רגישות לא ניתן להשלים באופן ישיר לאחר preparat OVA / אלוםיון, חנות OVA / אלום בטמפרטורת חדר. מערבולת 1 דקות לפני השימוש.
5. לטעון מזרק אינסולין 1 מ"ל עם תערובת OVA / אלום. מכסה את המזרק עם מחט המד 27..
6. הזרק של OVA / אלום 100 μl לתוך הצפק של עכברים / ג BALB למנה לכל עכבר של 50 מיקרוגרם של OVA ו2 מ"ג של אלום.
7. לביקורת שלילית, רגישות קבוצה אחרת של עכברים לPBS. הכן 1: תערובת 1 של אלום וPBS באותו אופן כפי שפורט לעיל, תוך השמטת OVA.
8. רגישות כל העכברים (שליטת OVA וPBS) פעם בשבוע למשך 3 שבועות עבור הסכום כולל של 3 זריקות. לאחר ההזרקה אחרונה, לחכות לפחות 2 שבועות לפני ביצוע assay אנפילקסיס המקומי.

.2 המקומי אנפילקסיס Assay

1. להביא פתרון מניות OVA לטמפרטורת חדר. בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, לדלל 20 מ"ג / מ"ל ​​מניית OVA לריכוז סופי של 5 מ"ג / מ"ל ​​עם PBS (1: 4 דילול של OVA ב1X PBS). בקצרה מערבולת לערבב.
2. הרדימי עכברים באמצעות RC ^{2 <}/ Sup> מערכת מכרסמים הרדמה (או מערכת אספקה ​​מתאדה מקבילה). מלא מאגר עם isoflurane, ולהדליק O ₂ זרימת אוויר. מקום עכברים בחדר אינדוקציה ולהתאים חיוג שליטת isoflurane עד 5% ליזום הרדמה. ברגע שעכברים מורדמים באופן מלא, שצוין על ידי חוסר הניידות, להתאים חיוג שליטת isoflurane עד 3% כדי לשמור על הרדמה עמוקה. המטרה של הרדמה בהליך זה היא לשתק את בעלי החיים. זריקות וריד אוזן וזנב לא לגרום לכאב או מצוקה משמעותיים לבעלי החיים.
   הערה: Isoflurane יכולה להיות השפעות שליליות על מערכת הרבייה האנושית. הקפד להשתמש בחדר מאוורר היטב ולצרף מיכל הדחה לתא האינדוקציה לנטרל גז פסולת. אם הינך בהריון בעת ​​שימוש isoflurane, ללבוש מסכת מסנן פחמן כדי למזער את החשיפה.
3. טען 10 μl של 5 מ"ג / מ"ל ​​OVA לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק כתרים עם מחט ביום 31 בG. לטעון אחר מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק עם 10 μlPBS של 1x.
4. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להזריק 10 μl של OVA לאוזן ימין של עכבר הרדים למנת אתגר של 50 מיקרוגרם של OVA. מינונים אחרים, כגון 20 מיקרוגרם, גם מקובל.
   1. כדי לייצב את האוזן להזרקה, לעטוף נייר דבק (צד עד דביק) סביב צינור חרוטי 15 מ"ל. אבטח את צד הגב של אוזן ימין לקלטת. הכנס את צד פוע המחט בין שני העלים של האוזן. לאט לאט להזריק OVA למרכז רקמת האוזן, נזהר שלא לפגוע בכל כלי דם.
5. שימוש באותה השיטה שתוארה לעיל, להזריק 10 μl של PBS לתוך אוזן השמאל כביקורת שלילית.
6. חכה 3 דקות.
   1. במהלך תקופה זו, להציב את העכבר בעוצר ולהחזיק את הזנב תחת מנורת חום או באמבט מים חם ל1 דקות כדי להרחיב את כלי הדם.
7. באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל כתרים עם מחט 27 G, להזריק לאט 200 μl של .0.5% צבע אוונס הכחול לv הזנבעין של העכבר. הזרקה מהירה עלולים להרוס את מבנה הספינה לפני 200 μl כולו מנוהלת. במקרה זה, תנסה להזריק את הנפח הנותר של צבע לתוך הווריד בצד השני של הזנב.
8. חכה 10 דקות.
9. להרדים את העכבר ולהסיר את שני האוזניים באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיות.
   1. תפוס את הקצוות של האוזן עם מלקחיים, ולוודא כי אין לחץ מוחל על אתר ההזרקה במרכז של האוזן. להסיר כמה שיותר רקמת אוזן ככל האפשר על ידי חיתוך קרוב ל, אך לא דרך, הרכס של הווה סחוס בבסיס של האוזן. כמויות קטנות של פרווה יכולות להיות נוכחת באוזן נכרתה; זה לא ישפיע על assay.
10. Aliquot 700 μl של פוראמיד לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge. הכן צינור אחד לכל אוזן (שני צינורות לכל עכבר).
    הערה: פוראמיד הוא טרטוגניות, mutagenic, וגירוי. ללבוש כפפות, משקפי מגן, ופנים הגנה. נשים בהריון צריכות לנקוט באמצעי זהירות בעת טיפולפוראמיד של עשוי להיות fetotoxic.
11. הוספת אוזניים לפוראמיד, מכסה את הצינורות, ודגירת הלילה באמבט חום יבש מוגדר 63 ° C. אוזניים עדיין עשויות להופיע כחולות מעט לאחר דגירה; עם זאת רוב הצבע יהיה חילוץ לפוראמיד.
12. הוסף 300 μl של כל דגימה, בשני עותקים, לצלחת גם 96. הימנע מהעברת פרווה אם הוא נמצא במדגם. ודא שאין בועות בהווה בבארות, כפי שהם ישפיעו על הקריאה ספיגה.
13. הוסף 300 μl של פוראמיד, בשני עותקים, לצלחת גם 96. בארות אלה ישמשו כחסר.
14. השתמש ספקטרופוטומטר למדוד הספיגה ב 620 ננומטר. בארות פוראמיד לגרוע מכל קריאת מדגם.
    הערה: כל הניסויים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת שירותים במדים.

תוצאות

בעלי חיים שעברו assay בהצלחה יהיו עור ועיניים המופיעות כחול. בעלי חיים רגישים PBS לא צריכים להגיב לכל אחד PBS או אתגר OVA, לכן שני האוזניים צריכה להישאר (איור 1 א) הלבן. בבעלי החיים OVA רגישים, אוזן קבלת אתגר PBS (משמאל) צריכה להיות לבנה או בקלילות כחולה בדרך מקומית באתר ה?...

Discussion

סמנים רבים של מחלות אלרגיות נמצאים בשימוש כדי להעריך את הכוח של תגובות אלרגיות הבאות אתגר אלרגן, לרבות שינויים ברמות של היסטמין במחזור, ייצור ציטוקינים Th2, וגיוס של תאים לנוזל רונכואלוואולרית בהגדרה של אתגר דרכי הנשימה. בעוד מעקב אחר שינויים בפרמטרים אלה הוא חשוב ללי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform