Измерение Местные Анафилаксия у мышей

Резюме

Аллергические реакции, характеризующиеся активации тучных клеток и базофилов, приводятся в действие сшивания IgE и выпуска провоспалительных медиаторов. Количественная оценка аллергических реакций может быть достигнуто с помощью Эванс синий краситель для мониторинга изменений в проницаемости сосудов после аллергена.

Аннотация

Аллергические реакции являются результатом активации тучных клеток и базофилов, и последующее высвобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов. Воздействие на аллерген в сенсибилизированного лица может привести к клинической симптоматики, которые варьируются от незначительной эритемы, чтобы угрожающих жизни анафилаксии. В лаборатории, различные животные модели были разработаны для понимания механизмов вождения аллергические реакции. Здесь мы опишем подробно метод для измерения изменений в проницаемости сосудов количественно локализованные аллергические реакции. Местный анафилаксии анализ впервые сообщалось в 1920, и была адаптирована от техники, опубликованной Кодзима соавт. в 2007 году ^1. В этом анализе, мыши, чувствительным к OVA оспариваются в левом ухе с автомобиля и в правом ухе с OVA. За этим следует внутривенной инъекции синий краситель Эванса. Десять мин после инъекции Evans Blue, животное забивали и краситель, который вырожденными вк ушам добывается на ночь в формамидом. Поглощение извлеченного красителя затем количественно с помощью спектрофотометра. Этот метод надежно приводит к визуальной и количественной проявление местной аллергической реакции.

Введение

Тип I гиперчувствительности опосредовано антиген-индуцированного сшивки IgE на поверхности тучных клеток и базофилов. Это приводит к клеточной дегрануляции и освобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов, таких как гистамин, триптазы, и фактор активации тромбоцитов ^2. После выпуска предварительно сформированных посредников во дегрануляции, тучные клетки синтезируют и отпустите простагландины и лейкотриены, которые в дальнейшем увеличить проницаемость сосудов ^3. Начальное клинический ответ происходит быстро и упоминается как "немедленной реакции". В коже, ответ волдыри-и-вспышка хорошо видна в течение нескольких минут антигена. В зависимости от дозы вызов, можно наблюдать "поздно фазовую" несколько час спустя. Поздно фаза отек обусловлен локализованной отека и найма лейкоцитов в ткани ^2. Гистамин, как правило, считается основным медиатором участие вНепосредственные аллергические реакции, действует на рецептором гистамина 1 (HR1) выразил на судах и рецептором гистамина 2 (HR2) выразил на гладкие мышцы. Комбинированный эффект увеличивает приток крови и проницаемость сосудов в участке воспаления ^4.

Разнообразие моделей животных аллергии были разработаны с целью изучения механизмов, участвующих в аллергическом воспалении, в том числе моделей аллергической астмы, системной анафилаксии и местных анафилаксии. Администрация внутривенного краситель был использован для измерения локализованных аллергические реакции на животных моделях в течение почти столетия, с публикации описания этого технику, датируется 1920-х годов ^5. Кролики и морские свинки были первые модели животного происхождения, используемые для тестирования реакции гиперчувствительности немедленного и наиболее чувствительные Ответы, как правило найти в ухо ^5,6. Анализ впоследствии подтверждена для использования в крыс и мышей ^{7 8.}

Исторически сложилось так,Различные экспериментальные методы были использованы, в том числе инъекции антигена перед инъекцией красителя, красителя инъекции до инъекции антигена, и одновременного введения красителя и антигена. Внутривенное введение краситель в качестве средства для измерения аллергические реакции является универсальным для анализа, как он может быть использован для измерения активный, пассивный, и обратный пассивные реакции ^5,9. Многочисленные красители были использованы для оценки аллергические реакции, в том числе трипановым синим, пентамина голубой, Evans Blue, ГЕЙГИ Голубой 536, и тушь ^5,6,9. Раствор 0,5% Evans Blue, в настоящее время стандарт краситель используется для измерения аллергических реакций в коже.

Анафилактический ответ на вызов преходяще; Максимальная интенсивность достигается в течение 10 - 15 мин после инъекции красителя, и никакой реакции не видно, если краситель вводят больше чем 30 минут после вызова, независимо от вида животного, используемых ^9. Количественная оценка экстравазации красителя был оригиналенлы получают путем измерения волдырь размер, как указано синего красителя ^7-9. Кроме того, на счету дегранулированных тучных клеток может быть определена количественно путем вырезания кожной ткани от места реакции и окрашивания толуидиновым синим ^7. Мачты дегрануляции клеток часто используется в качестве маркера для кожного, IgE-опосредованные аллергические реакции, как тучные клетки являются основным местным населением клетки, экспрессирующей высокое сродство рецептора IgE FcεRI. Спектрофотометрические методы измерения красителя экстравазацию в ткань были разработаны для пассивных кожной анафилаксии (СПС) у крыс ¹⁰ и мыши ¹¹ в 1990-х годах.

Следующий протокол местной анафилаксии анализ был адаптирован из Kojima соавт. ^1, и использует куриные яйца яичный альбумин (OVA) в качестве антигена для выявления аллергических реакций. Тем не менее, другие, чем OVA антигены могут быть использованы, если это необходимо. Анализ затем использует синий краситель Эванса отслеживать изменения в сосудистой permeabilitу, что происходит в связи с тучных клеток IgE сшивание и высвобождение гистамина.

протокол

1. привлечь внимание Мыши

1. Подготовка исходного раствора OVA OVA путем разбавления в 1х PBS до конечной концентрации 20 мг / мл. Замораживание вниз аликвоты в криопробирки и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
2. Доведите один или несколько аликвот 20 мг / мл OVA складе до комнатной температуры. Развести OVA в 1х PBS до конечной концентрации 1 мг / мл в 5 мл полистирола с круглым дном трубки с крышкой. Кратко Vortex перемешать.
3. Удерживая полистирола трубки, содержащей 1 мг / мл OVA на вихрь, установленного на средней скорости, добавить равный объем тщательно гомогенизировали Imject Alum (40 мг / мл) по каплям при продолжении вихрь трубку, чтобы произвести 1: 1 соотношение квасцы в иммуногену.
4. Поместите крышку на трубки и ленты трубки вихря. Включите вихрь на минимальное значение и позволяют OVA адсорбироваться на алюминиевых квасцов в течение 30 мин.
   1. Не допускать большое количество времени, чтобы пройти между подготовки OVA / алюминиевыми квасцами и сенсибилизации мышей. Если сенсибилизация не может быть завершена сразу после OVA / Alum подготовка трионный, магазин OVA / квасцы при комнатной температуре. Vortex в течение 1 мин перед использованием.
5. Загрузите 1 мл инсулиновый шприц с OVA / Alum смеси. Закрывают шприц с 27 иглы.
6. Введите 100 мкл OVA / квасцов в брюшину линии BALB / C мышей при дозе на мышь 50 мкг OVA и 2 мг квасцов.
7. Для отрицательного контроля, внимания другую группу мышей в PBS. Подготовка 1: 1 смесь алюминиевыми квасцами и PBS в таким же образом, как указано выше, опуская OVA.
8. Внимание всех мышей (OVA и PBS управления) один раз в неделю в течение 3 недель в общей сложности 3 инъекции. После последней инъекции, ждать по крайней мере за 2 недели до проведения местного анафилаксии анализа.

2 Часовой Анафилаксия Анализ

1. Доведите OVA маточного раствора до комнатной температуры. В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, разбавленной 20 мг / мл OVA запас до конечной концентрации 5 мг / мл с PBS (1: 4 разбавление OVA в 1X PBS). Кратко Vortex перемешать.
2. Обезболить мышей, используя RC ^{2 <}/ SUP> грызунов Анестезия система (или сравнимы испаряется система доставки). Заполните резервуар изофлураном, и включите O ₂ воздуха. Место мышей в индукции камеры и настроить ИФ диск управления до 5%, чтобы инициировать обезболивания. После того, как мыши полностью под наркозом, указывает отсутствие мобильности, настроить ИФ диск управления до 3%, чтобы поддерживать глубокую обезболивания. Цель анестезии в этой процедуре для иммобилизации животных. Уха и хвост вены инъекции не вызывают сильную боль или страдания животному.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Isoflurane может оказать негативное воздействие на репродуктивную систему человека. Обязательно используйте в хорошо проветриваемом помещении и приложите поглощать канистру с индукционной камеры для нейтрализации отработанных газов. Если вы беременны, используя изофлуран, носить маску угольного фильтра, чтобы свести к минимуму воздействие.
3. Нагрузка 10 мкл 5 мг / мл OVA в 3/10 см инсулиновый шприц колпачком с иглой 31 G. Загрузить другой 3/10 куб.см инсулиновый шприц с 10 мклиз 1x PBS.
4. Использование рассекает микроскоп, привнести 10 мкл OVA в правое ухо наркозом мыши для вызова дозе 50 мкг OVA. Другие дозы, такие как 20 мкг, также являются приемлемыми.
   1. Для стабилизации ухо для инъекций, обернуть скотчем (липкой стороной вверх) вокруг 15 мл коническую трубку. Закрепите спинной стороны правого уха к ленте. Вставьте иглу конической стороной вверх между двумя листьями уха. Медленно введите OVA в центр ушной ткани, заботясь, чтобы не ударить любого кровеносные сосуды.
5. Используя ту же самую методику, описанную выше, вводят 10 мкл PBS в левое ухо в качестве отрицательного контроля.
6. Подождите 3 мин.
   1. В течение этого времени, поместите курсор в фиксатор и удерживайте хвост под инфракрасной лампой или в теплой ванне воды в течение 1 мин, чтобы расширить кровеносные сосуды.
7. Использование 1 мл инсулиновый шприц колпачком с иглой 27 G, медленно вдохнуть 200 мкл 0,5% синего красителя Эванса в хвостовую противЭйн мыши. Быстрое введение может разрушить структуру сосудов до целых 200 мкл вводят. Если это происходит, попытка ввести оставшиеся объем красителя в вену на противоположной стороне хвоста.
8. Подождите 10 минут.
9. Усыпить мыши и удалить оба уха, используя щипцы и хирургические ножницы.
   1. Захват края уха щипцами, чтобы убедиться, что давление не применяется в месте инъекции в центре уха. Удалить столько ушной ткани, как это возможно за счет сокращения близко к, но не до конца, гребень настоящее хряща у основания уха. Небольшие количества меха могут присутствовать на вырезанной уха; это не повлияет на анализ.
10. Алиготе 700 мкл формамида в 1,5 мл микропробирок. Подготовьте одну трубку за ухо (две трубки на мышь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формамид является тератогенным, мутагенным, и раздражителем. Носите защитные перчатки, очки и маску. Беременные женщины должны соблюдать осторожность при обращении сс формамид может быть эмбриотоксическое.
11. Добавить уши формамида, крышка трубы, и инкубировать в течение ночи в сухом тепла бане до 63 ° C. Уши могут появляться слегка синий после инкубации; Однако большинство красителя будут извлечены в формамиде.
12. Добавить 300 мкл каждого образца в двух экземплярах, в 96-луночный планшет. Избежать переноса мех, если он присутствует в образце. Убедитесь, что нет никаких пузырьки, присутствующие в скважинах, так как они влияют на чтение абсорбции.
13. Добавить 300 мкл формамида, в двух экземплярах, в 96-луночный планшет. Эти скважины будут использоваться в качестве заготовок.
14. С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности при 620 нм. Вычитание формамидные скважин от каждого чтения образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились под протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использованию силовых структур университета по.

Результаты

Животные, которые успешно прошли на анализ будет иметь кожу и глаза, которые появляются синие. PBS сенсибилизированных животных не должны реагировать на любой PBS или OVA вызов, поэтому оба уха должна оставаться белой (1А). В OVA сенсибилизированных животных, ухо приема вызов PBS (слева...

Обсуждение

Многочисленные маркеры аллергических заболеваний используются для оценки силы аллергических реакций следующих аллергена, включая изменения в уровнях циркулирующего гистамина, Th2 продукции цитокинов, а также набора клеток в бронхоальвеолярном жидкости в проточных частях вызов дыха?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform