Misurare Anafilassi locali nei topi

Riepilogo

Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

Abstract

Reazioni allergiche sono il risultato dell'attivazione dei mastociti e basofili e il successivo rilascio di vasoattivo e mediatori proinfiammatori. L'esposizione ad un allergene in una persona sensibilizzata può causare sintomi clinici che variano da eritema lieve a pericolo di vita anafilassi. In laboratorio, sono stati sviluppati diversi modelli animali per capire i meccanismi di guida reazioni allergiche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per misurare i cambiamenti della permeabilità vascolare per quantificare le risposte allergiche localizzate. Il saggio anafilassi locale è stata segnalata per la prima nel 1920, ed è stato adattato dalla tecnica pubblicata da Kojima et al. nel 2007 ^1. In questo saggio, i topi sensibilizzati al OVA sono sfidati nel orecchio sinistro con il veicolo e l'orecchio destro con OVA. Questa è seguita da una iniezione endovenosa di Blu di Evans colorante. Dieci minuti dopo l'iniezione di Blu di Evans, l'animale è eutanasia e il colorante che è uscito dai vasi inper le orecchie viene estratto durante la notte in formammide. L'assorbanza del colorante estratto viene poi quantificato con uno spettrofotometro. Questo metodo assicura in maniera affidabile una manifestazione visiva e quantificabile di una reazione allergica locale.

Introduzione

Ipersensibilità di tipo I è mediata da antigene-indotta cross-linking delle IgE sulla superficie dei mastociti e basofili. Ciò si traduce in degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori vasoattivi e proinfiammatori come l'istamina, triptasi, e fattore attivante le piastrine ^2. A seguito del rilascio di mediatori preformati durante degranulazione, mastociti sintetizzano e rilasciano prostaglandine e leucotrieni, che aumentano ulteriormente la permeabilità vascolare ^3. La risposta clinica iniziale avviene rapidamente ed è indicato come una "reazione immediata". Nella pelle, una risposta wheal-e-bagliori è facilmente visibile a pochi minuti dall'esposizione all'antigene. A seconda della dose di sfida, è possibile osservare una "risposta in fase tardiva" poche ore più tardi. Gonfiore fase tardiva è dovuta a edema localizzato e il reclutamento dei leucociti nei tessuti ^2. L'istamina, generalmente considerato il principale mediatore parteciparereazioni allergiche immediate, agisce sul recettore dell'istamina 1 (HR1) espresso su navi e istamina recettore 2 (HR2) espresso sulla muscolatura liscia. L'effetto combinato aumenta il flusso sanguigno e la permeabilità vascolare nel sito di infiammazione ^4.

Una varietà di modelli animali di allergia sono stati sviluppati al fine di studiare i meccanismi coinvolti nell'infiammazione allergica, compresi i modelli di asma allergica, anafilassi sistemica, e anafilassi locali. Somministrazione endovenosa colorante è stato utilizzato per misurare le reazioni allergiche localizzate in modelli animali per quasi un secolo, con pubblicazioni che descrivono questa tecnica risalente al 1920 ^5. Conigli e porcellini d'India sono stati i primi modelli animali utilizzati per testare le reazioni immediate di ipersensibilità, e le risposte più sensibili sono stati generalmente presenti nell'orecchio ^5,6. Il dosaggio è stato successivamente convalidato per l'uso in ratti e topi ^{7 8.}

Storicamente,una varietà di metodi sperimentali sono stati utilizzati, compresa l'iniezione di antigene prima dell'iniezione del colorante, iniezione di colorante prima dell'iniezione di antigene, e l'iniezione contemporanea di colorante e l'antigene. Somministrazione endovenosa colorante come mezzi per misurare le risposte allergiche è un test versatile in quanto può essere utilizzato per misurare attiva, passiva, e invertire reazioni passive ^5,9. Numerosi coloranti sono stati utilizzati per valutare reazioni allergiche, tra cui Trypan Blue, Pontamine Cielo Blu, Blu di Evans, Geigy Blu 536, e l'India Ink ^5,6,9. Una soluzione di 0,5% Blu di Evans è attualmente il colorante standard utilizzato per misurare le risposte allergiche della pelle.

La risposta anafilattica alla sfida è transitoria; intensità massima viene raggiunta entro 10 - 15 minuti di iniezione colorante, e nessuna reazione è visibile se colorante viene somministrato più di 30 minuti dopo la sfida, indipendentemente dalle specie animali utilizzate ^9. Quantificazione di colorante stravaso era originalely ottenuta misurando dimensione pomfo come indicato dal colorante blu ^7-9. Inoltre, conti di mastociti degranulati possono essere quantificati da asportare tessuto cutaneo dal sito della reazione e la colorazione con blu di toluidina ^7. Degranulazione dei mastociti è spesso usato come marker per cutanea, reazioni allergiche IgE-mediate, come mastociti sono la principale popolazione di cellule locale che esprime il recettore ad alta affinità per le IgE FcεRI. Tecniche spettrofotometriche per la misurazione colorante stravaso nei tessuti sono stati sviluppati per anafilassi cutanea passiva (PCA) nel ratto e topo ^{10 11} nel 1990.

Il seguente protocollo del saggio anafilassi locale è stato adattato da Kojima et al. ^1, e utilizza ovoalbumina uova di gallina (OVA) come l'antigene per suscitare reazioni allergiche. Tuttavia, antigeni diversi OVA possono essere utilizzati se lo si desidera. Il test utilizza quindi Blu di Evans colorante per monitorare i cambiamenti in permeabilit vascolarey che si verificano a causa di mastociti IgE cross-linking e il rilascio di istamina.

Protocollo

1. Mice Sensibilizzare

1. Preparare una soluzione stock OVA diluendo OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Congelare le aliquote in cryovials e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
2. Portare una o più aliquote di 20 mg / ml di OVA magazzino a temperatura ambiente. Diluire OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml in una provetta 5 ml di polistirolo rotonda fondo con un tappo. Vortex brevemente per miscelare.
3. Tenendo la provetta di polistirene contenente 1 mg / ml di OVA in un vortice funzionante a velocità media, aggiungere un volume uguale di fondo omogeneizzato Imject allume (40 mg / ml) goccia a goccia continuando a vortice tubo per produrre un rapporto 1: 1 di Alum a immunogeno.
4. Mettere tappo sul tubo e nastro tubo vortex. Attivare vortice sul valore più basso e consentire OVA di adsorbimento al Alum per 30 min.
   1. Non permettere che una grande quantità di tempo per passare tra la preparazione OVA / allume e sensibilizzazione topi. Se sensibilizzazione non può essere completata direttamente dopo OVA / allume preparatione, negozio OVA / allume a temperatura ambiente. Vortex per 1 min prima di utilizzare.
5. Caricare una siringa da insulina da 1 ml con miscela di OVA / Alum. Chiudere la siringa con l'ago calibro 27.
6. Iniettare 100 ml di OVA / Alum nel peritoneo di topi BALB / c per una dose per ogni topo di 50 mg di OVA e 2 mg di Alum.
7. Per un controllo negativo, sensibilizzare altro gruppo di topi a PBS. Preparare una miscela 1: 1 di Alum e PBS in stesso modo di cui sopra, omettendo OVA.
8. Sensibilizzare tutti i topi di controllo (OVA e PBS) una volta a settimana per 3 settimane per un totale di 3 iniezioni. Dopo l'iniezione finale, attendere almeno 2 settimane prima di eseguire il test anafilassi locale.

2. locale anafilassi Assay

1. Portare soluzione madre OVA a temperatura ambiente. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, diluire 20 mg / ml di OVA magazzino ad una concentrazione finale di 5 mg / ml con PBS (1: 4 diluizione di OVA in PBS 1X). Vortex brevemente per miscelare.
2. Anestetizzare topi utilizzando RC ^{2 <}/ Sup> Roditore anestesia sistema (o sistema di erogazione vaporizzata comparabili). Riempire il serbatoio con isoflurano, e accendere O ₂ flusso d'aria. Luogo topi in camera di induzione e regolazione selettore di controllo isoflurano al 5% di avviare anestesia. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, indicato dalla mancanza di mobilità, regolare il selettore di controllo isoflurano al 3% per mantenere la profonda anestesia. Lo scopo di anestesia in questa procedura è quello di immobilizzare l'animale. Le iniezioni orecchie e coda vena non causano dolore o disagi all'animale.
   NOTA: isoflurano può avere effetti negativi sul sistema riproduttivo umano. Assicurarsi di utilizzare in una stanza ben ventilata e allegare una bomboletta scavenging alla camera di induzione di neutralizzare gas di scarico. In caso di gravidanza durante l'utilizzo di isoflurano, indossare una maschera di filtro a carbone per ridurre al minimo l'esposizione.
3. Carico 10 ml di 5 mg / ml OVA in una siringa da insulina 3/10 cc ricoperto con un ago 31 G. Caricare un'altra siringa da insulina 3/10 cc con 10 microlitridi 1x PBS.
4. Utilizzando un microscopio da dissezione, iniettare 10 ml di OVA in dell'orecchio destro di un mouse anestetizzato per una dose di 50 mg di OVA. Altre dosi, come ad esempio 20 mg, sono anche accettabili.
   1. Per stabilizzare l'orecchio per l'iniezione, avvolgere nastro adesivo (adesivo rivolto verso l'alto) attorno ad un tubo da 15 ml. Fissare il lato dorsale dell'orecchio destro al nastro. Inserire il lato ago smusso tra le due foglie dell'orecchio. Iniettare lentamente OVA nel centro del tessuto dell'orecchio, facendo attenzione a non colpire eventuali vasi sanguigni.
5. Utilizzando lo stesso metodo descritto sopra, iniettare 10 ml di PBS nell'orecchio sinistro come controllo negativo.
6. Attendere 3 min.
   1. Durante questo periodo, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e tenere la coda sotto una lampada di calore o in un bagno di acqua calda per 1 min a dilatare i vasi sanguigni.
7. Usando una siringa da insulina da 1 ml con tappo con un ago 27 G, iniettare lentamente 200 ml di 0,5% Blu di Evans colorante in coda vein del mouse. Iniezione rapida può distruggere la struttura nave prima l'intero 200 ml viene somministrato. In questo caso, tentare di iniettare il volume residuo di colorante nella vena sul lato opposto della coda.
8. Attendere 10 min.
9. Euthanize il mouse e rimuovere entrambe le orecchie con pinze e forbici chirurgiche.
   1. Afferrare i bordi dell'orecchio con una pinza, facendo attenzione che non viene applicata pressione al sito di iniezione al centro dell'orecchio. Rimuovere il tessuto più orecchie possibile tagliando vicino a, ma non attraverso la cresta di cartilagine presente alla base dell'orecchio. Piccole quantità di pelo possono essere presenti su un orecchio asportato; ciò non pregiudica il test.
10. Aliquota 700 ml di formammide in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Preparare una provetta per orecchio (due tubi per il mouse).
    NOTA: Formamide è teratogeno, mutageno, e un irritante. Indossare guanti, protezioni per gli occhi e la faccia. Le donne incinte dovrebbero prestare attenzione quando si maneggia unas formammide può essere fetotossici.
11. Aggiungi orecchie per formammide, tappare i tubi, e incubare una notte in un bagno di calore secco impostato a 63 ° C. Orecchie possono ancora apparire leggermente blu dopo l'incubazione; Tuttavia la maggior parte del colorante sarà estratto nel formammide.
12. Aggiungere 300 ml di ciascun campione, in duplicato, di una piastra ben 96. Evitare il trasferimento di pelliccia se è presente nel campione. Assicurarsi che non vi siano bolle presenti nei pozzetti, in quanto saranno influenzare la lettura di assorbanza.
13. Aggiungere 300 ml di formammide, in duplice copia, alla piastra ben 96. Questi pozzi saranno utilizzati come spazi vuoti.
14. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 620 nm. Pozzi formammide sottrarre da ogni lettura del campione.
    NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Institutional Animal Care and Use Committee in uniforme Servizi Università.

Risultati

Gli animali che hanno subito il test con successo avranno la pelle e gli occhi che appaiono blu. PBS animali sensibilizzati non dovrebbero reagire a uno o PBS sfida OVA, quindi entrambe le orecchie dovrebbero rimanere bianco (Figura 1A). Negli animali sensibilizzati OVA, l'orecchio riceve la sfida PBS (sinistra) dovrebbe essere completamente bianca o leggermente blu in modo localizzato nel sito di iniezione. L'orecchio riceve la sfida OVA (a destra) dovrebbe diventare progressivamente più scuro...

Discussione

Numerosi marcatori di malattia allergica sono utilizzati per valutare la forza delle risposte allergiche seguenti sfida allergene, compresi i cambiamenti nei livelli di istamina circolante, Th2 produzione di citochine, e il reclutamento di cellule in liquido broncoalveolare nella cornice della sfida delle vie aeree. Mentre il monitoraggio dei cambiamenti in questi parametri è importante per studiare le reazioni allergiche, marcatori biologici non sempre correlano con malattia allergica clinica. Il test anafilassi local...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform