המהיר פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

Summary

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Abstract

שילוב ניאון RNA הכלאה באתר (דגים) עם immunofluorescence (חיסוני דגים) יוצר בטכניקה שיכולה להיות מועסק ברמת התא הבודד כדי לזהות את הדינמיקה המרחבית של לוקליזציה RNA עם תובנה סימולטני ללוקליזציה של חלבונים, שינויים אפיגנטיים ופרטים נוספים אשר יכול להיות מודגש על ידי immunofluorescence. איון כרומוזום X הוא פרדיגמה להשתקת גנים ארוכה RNA קידוד שאינו (lncRNA) בתיווך. הצטברות X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA (נקראת Xist ענן) באחת משני כרומוזומים X-בנקבות יונקים היא שלב קריטי ליזום איון כרומוזום X. RNA Xist במישרין או בעקיפין אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים ומציג נופים אפיגנטיים ברורים לכרומוזום X פעיל (Xi). סימן היכר ידוע אפיגנטיים אחד Xi הוא trimethyl ליזין היסטון H3 27 שינוי (H3K27me3). כאן אנו מתארים חיסוני FISH פשוט ומהירפרוטוקול לאיתור Xist RNA באמצעות RNA FISH עם בדיקות oligonucleotide מרובות בשילוב עם immunofluorescence של H3K27me3 לבחון את הלוקליזציה של Xist RNA ושינויים אפיגנטיים הקשורים. שימוש בתוצאות בדיקות oligonucleotide בזמן דגירה קצר יותר וגילוי רגיש יותר של Xist RNA בהשוואה לבדיקות RNA במבחנה עיבד (riboprobes). פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של lncRNAs והשינוי אפיגנטיים הקשורים אליו, מבנה הכרומטין, ארגון גרעיני ורגולצית תעתיק.

Introduction

איון כרומוזום X יונקים (xci) הוא אסטרטגיה כדי לפצות על חוסר האיזון במינון גן צמוד X בין XX וXY, שבו אחד משני כרומוזומי X-בנקבות הוא תעתיק ¹ מומת. איון כרומוזום X הוא מערכת מודל נהדרת עבור RNA קידוד שאינו ארוך מחקר (lncRNA). איון כרומוזום X מוסדר על ידי lncRNAs מרובה, ונחקר בהרחבה בעשרות השנים האחרונות לחשוף את מנגנוני crosstalk בין lncRNAs, שעתוק, מבנה הכרומטין וארגון גרעיני ^{2, 3.}

מרכז איון X (XIC) הממוקם על כרומוזום X הוא מוקד גנטי מורכב מורכב ממספר גני ייצור RNAs ללא קידוד ^4. X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA ביונקי eutherian הוא lncRNA אחד כזה אשר ממלא תפקיד מכריע באיון כרומוזום X ^5,6. תמלילי Xist מקיפים את מיקומו של פוture Xi ליזום איון כרומוזום X, ומופיע כענן כאשר דמיינו באמצעות RNA FISH; מערך זה נקרא "Xist הענן" ^7. מאז Xist RNA אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים, שיתוף לוקליזציה של ענני Xist עם שינויים אפיגנטיים שונים להכרומטין השקט ושעתוק דיכוי הוא ציין במהלך איון כרומוזום X ^8. לדוגמא, Xist RNA אינטראקציה עם מורכב Polycomb מדכא 2 (PRC2) האחראית על H3K27me3 וגורם למצב הכרומטין דיכוי ^9. המופע של ענן Xist על Xi ושיתוף הלוקליזציה שלה עם שינוי H3K27me3 האינטנסיבי מייצג נוף heterochromatin פקולטטיביים של Xi ^10,11.

טכניקות ציטוגנטית, כגון DNA / RNA FISH יש כברת דרך מהשיטה המסורתית באמצעות בדיקות radiolabelled ¹² לטכניקות האחרונות ומתקדמות ברגישות ובמשופרותהדמיה ניאון באמצעות בדיקות oligonucleotide מרובות ^13,14. FISH DNA / RNA בשילוב עם immunofluorescence נעשה שימוש באופן שגרתי ככלי ציטולוגית להבין ארגון spatiotemporal גרעיני, לוקליזציה RNA, מבנה הכרומטין ושינויים. הכנת הבדיקה סטנדרטית ביותר עבור RNA FISH כרוך בשימוש בפלסמיד או כרומוזום מלאכותי שיבוטים חיידקים (BAC) והתיוג הבא שלהם או עם תרגום לכינוי או לתחולו אקראי ^15. עם זאת, כמעט 70% מהגנים בעכברים ו -40% מהגנים בבני האדם להראות חפיפה של תמלילי תחושה וantisense ^16, ומכאן צורך בשיטת FISH גדיל הספציפי כדי להבדיל תמלילי תחושה וantisense. במבחנה בדיקות RNA עיבד (riboprobe ) משמש לעתים קרובות לFISH גדיל RNA ספציפי ^17,18; עם זאת, מדובר בהכנת שיבוט פלסמיד או מוצר PCR עם T7, SP6, או אמרגן T3 וriboprobes סינתזה. יתר על כן, Riboprobes נגזר מgenomic DNA או cDNA לעתים קרובות מכיל אזורים שאינם ספציפיים ואלמנטים חוזרים, אשר יביאו לרעש רקע גבוה. בעיה נוספת היא שriboprobes, שהם כמה מאה נוקלאוטידים באורך ומכיל fluorophores מרובה, לא יכולה לחדור ביעילות לתוך הגרעין. כדי לעקוף את זה, בדיקות oligonucleotide קצרות מרובות שכותרתו עם fluorophore אחד בסוף פותחו שיש לי רגישות טובה, עוצמת אות אחידה, וקלות לניקוי וטיפול ^14. בנוסף, oligonucleotides DNA הוא בדרך כלל יציב יותר מRNA. אנחנו מוחלים אסטרטגיה דומה של שימוש בoligonucleotides Xist RNA FISH ¹⁹ עם immunofluorescence להבין את הדינמיקה אפיגנטיים של Xi הנגרמת על ידי Xist lncRNA במהלך התהליך של איון כרומוזום X. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של בדיקות oligonucleotide והכנה נכונה של תאים, כמו גם ניצול של immunofluorescence וRNA FISH. Xist RNA FISH באמצעות oligonucle מרובהotides היא גישה יעילה עלות בטווח הארוך אם Xist RNA FISH מבוצע באופן שוטף במעבדתו של אחד. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות lncRNAs בתאים תוך מיפוי שיתוף הלוקליזציה שלה עם שינויים או גורמים אפיגנטיים בו-זמנית. אחד יתרונות עיקריים של הפרוטוקול הוא היכולת לשנות אותו בקלות כדי להתאים תחומי המחקר של אחד.

Protocol

1. בדיקה הכנה

1. להשיג oligonucleotides מרובה הייחודי בXist (oligonucleotides 20-30 נוקלאוטיד באורך, טמפרטורת 63-65 מעלות צלזיוס היתוך, טבלת 1) עם שינוי 5'-אמינו ולהשעות במים.
2. כמויות בריכת equimolar של oligonucleotides עם 5'-אמינו שינוי (סה"כ 4.5 מיקרוגרם) ותווית עם צבע פלואורסצנטי אמין-reactive הבא הוראות היצרן.
   1. ממיסים את oligonucleotides נקווה ב5 μl הסופי של מים nuclease חינם ולהוסיף 3 μl של סודיום ביקרבונט 1 M לפתרון oligonucleotide.
   2. הוספת DMSO 2 μl לבקבוקון של צבע אמין-reactive ובקצרה מערבולת.
   3. מערבבים את פתרון oligonucleotide עם צבע תגובתי בDMSO דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 בחושך.
3. לטהר את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently על ידי עמודת G-25 ואחריו משקעים אתנול.
   1. טור צנטריפוגה G-25 ב 750 XG עבור 1 דקות כדי להסיר חיץ אחסון עודף.
   2. מוסיף מים nuclease ללא 40 μl לתערובת התיוג מיוצרת בשלב 1.2.3 ואחול על עמודת G-25. צנטריפוגה ב 750 XG למשך 2 דקות.
   3. הוסף 50 מים μl nuclease ללא, 10 נתרן אצטט μl 3 M (pH 5.2) ו -250 אתנול μl לבדיקה המטוהרת מהשלב 1.3.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 21,000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
   4. שטוף את oligonucleotides זירז פעם אחת עם 1 מיליליטר של אתנול 70%.
   5. להשעות מחדש ב -50 μl nuclease ללא מים או TE (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) לריכוז סופי של כ -10 מיקרומטר.
4. לדלל את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently לריכוז סופי של nM 250 עם חיץ הכלאה (פוראמיד 10%; 2x SSC [300 מ"מ NaCl; ציטראט 30 מ"מ נתרן]; 2 מ"ג / מיליליטר BSA, 10% סולפט dextran).
   הערה: עם פרוטוקול FISH זה מהר, p oligonucleotideגלימות בXist תוכננו והשתמשו בריכוז גבוה מפרוטוקול FISH הרגיל באמצעות בדיקות oligonucleotide כדי לקצר את זמן הדגירה של הכלאה.

2. החלק הכנה

הערה: ניתן להכין שקופיות לאימונו-FISH באמצעות עכבר גזע עוברי (ES) או גוף embryoid (EB) הבחנה תאים ^{20, 21} או על ידי גידולם ישירות בשקופית שטופל פולי-ליזין או באמצעות cytospin עם השעיה תא. כאן, הכנת שקופיות על ידי cytospin מוצגת.

1. לשאוב את מדיום התרבות בצלחת 6 באר. לשטוף עם PBS (בטמפרטורת חדר), ולשאוב ביסודיות.
2. הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין לצלחת 6-גם, דגירה למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. הוסף 5 מיליליטר של מדיום ולפזר תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים.
4. העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 200 בטמפרטורת חדר.
5. מחק את המדיוםד בעדינות להשעות את התאים 2 מיליליטר PBS.
6. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ולדלל השעיה תא ב 4 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ידי PBS.
7. להרכיב שקופיות, כרטיס מסנן וקאמרי עם קליפ ולהכניס אותם לתוך החריצים המתאימים ברוטור של cytospin. הוסף 250 μl של כל דגימה מוכנה בשלב 2.6 לכל תא של היחידות שהתכנסו בcytospin. צנטריפוגה ב 1500 סל"ד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
8. מלאו 3 צנצנות coplin על קרח עם 40 מיליליטר כל אחד מחיץ PBS, CSK קר כקרח (10 צינורות מ"מ, pH 6.8; 100 מ"מ NaCl; 300 סוכרוז מ"מ; 3 מ"מ MgCl _2), וחיץ CSKT (חיץ CSK עם 0.5% Triton X-100), בהתאמה.
9. לאחר cytospin הוא סיים, להעביר במהירות את השקופית לתוך PBS קר כקרח ודגירה של 5 דקות.
10. העבר את השקופית למאגר CSK קר כקרח ודגירת דקות 1.
11. העבר את השקופית למאגר CSKT קר כקרח ודגירה של 5 דקות.
12. העבר את השקופית בחזרה לbuf CSK קר כקרחFER דגירה דקות 1.
13. העבר את השקופית לתוך paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.

3. Immunofluorescence

1. מניחים את השקופיות בצנצנת coplin עם PBST (1x PBS עם Tween-20 0.1%) לכמה שניות.
2. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף מהשקופיות ולמקם אותו בתיבת pipet-קצה ריק עם מים. כיסוי השקופית עם 40 μl של פתרון חסימה (1x PBS, BSA 1%, 20-Tween 0.1%), מניח בעדינות coverslip, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.
3. הסר את coverslip, להסיר את פתרון החסימה, ולהוסיף 40 μl של הנוגדן הראשוני היסטון H3K27me3 המדולל לריכוז של 1: 500 בחסימת פתרון. מניחים את coverslip חזרה על שקופיות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
   הערה: מעכב RNase בפתרון החסימה עשויה להיות מועילה כדי לשמר RNA בRNA FIS זהפרוטוקול H כאשר נוגדני polyclonal משמשים.
4. לשטוף להחליק 2 פעמים בצנצנות coplin מלאות PBST, במשך 5 דקות כל אחד, בעדינות רועדת בזמן הכביסה.
5. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת הקצה. שכבה עם 40 μl של הנוגדנים משני (1: 500) מדוללים בחסימת פתרון, במקום coverslip, ודגירה במשך 15 דקות בחושך. לשלבים הבאים, לשמור על השקופיות בחושך בכל העת.
6. לשטוף 2 פעמים בCoplin צנצנות עם PBST כמו בשלב 3.4.

FISH RNA 4. עם oligonucleotide בדיקות

1. טרום חם תיבת pipet-קצה ריק עם מים בתחתית כדי למנוע שקופיות מהתייבשות על 37 מעלות צלזיוס במשך FISH RNA בשלב 4.3.
2. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות את נוזל עודף השקופיות מצעד 3.6 ובמקום להחליק לתוך תיבת pipet-הקצה עם ואטאה בתחתית. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף FISH (פוראמיד 10% ב2x SSC) בשקופית ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
3. הסר פתרון לשטוף FISH, להוסיף 8 μl של בדיקות oligonucleotide לשקופית, במקום להחליק כיסוי, ולהעביר את השקופיות לתיבת pipet-טיפ מראש חימם עם מים בתחתית; לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
4. מניחים 3 צנצנות coplin מראש חימם באמבט מים ב 37 ° C עם חיץ לשטוף FISH, חיץ לשטוף FISH עם DAPI, ו2x SSC.
5. לאחר הדגירה שעה 1-2 לRNA FISH, לשים את השקופיות לחיץ לשטוף FISH מראש חימם.
6. דגירה השקופיות במשך כמה דקות עד coverslip נופל של השקופית.
7. מניחים את השקף חזרה לחיץ לשטוף, ולהמשיך דגירה במשך 5 דקות.
8. העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם חיץ לשטוף FISH מראש חימם עם 0.5 ng / ml DAPI ודגירה של 5 דקות.
9. העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם מראש חימם 2x SSC ודגירה של 5 ק"מn.
10. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת קצה יבשה. הוסף 4 μl של antifade עם DAPI לשקופית ומניח coverslip.
11. לאטום את coverslip עם לק ולהתבונן תחת מיקרוסקופ. השקופית יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך כמה חודשים.

תוצאות

נציג תמונות של חיסוני FISH מהיר מוצגות באיור 1 א. שיתוף לוקליזציה של אות הענן וH3K27me3 Xist RNA על Xi התגלתה בהבחנת תאים נקביים. ביום 12 על בידול, יותר מ -90% מתאי EB היו ענן Xist (איור 1). בדיקות oligonucleotide הקצר חדרו יעילות לתוך הגרעינים, שמובילות להדמיה של כמעט כל אותות H...

Discussion

במאמר זה, שהצגנו פרוטוקול חיסוני FISH מהיר שלוקח פחות מ 5 שעות כדי להשלים הכנת שקופיות, Xist RNA FISH, וimmunofluorescence לH3K27me3. בהשוואה לגישה חיסונית FISH הכללי לXist RNA זיהוי, אשר בדרך כלל צריך דגירה הלילה לRNA FISH, פרוטוקול זה לא רק מפחית באופן משמעותי את משך זמן, אלא גם משפר את הרגישות של ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification	IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye	Life Technologies	A32750
MicroSpin G-25 columns	GE Healthcare	27-5325-01
Cytospin 2	Shandon	59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)	Roche	10715859103
Histone H3K27me3 antibody	Active Motif	61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A21424
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36931