JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Аннотация

Сочетание РНК люминесцентные в гибридизация (FISH) с иммунофлюоресценции (иммуно-FISH) создает технику, которая может быть использована в одном уровне клетки для выявления пространственной динамики РНК локализации с одновременным проникновением в локализации белков, эпигенетических модификаций и других деталей которые могут быть выделены с помощью иммунофлуоресценции. Инактивация Х-хромосомы является парадигмой для длительного некодирующая РНК (lncRNA) опосредованной сайленсинга. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) накопление lncRNA (так называемый Xist облако) на одном из двух Х-хромосом у самок млекопитающих является важным шагом для начала инактивации Х-хромосомы. Xist РНК, прямо или косвенно взаимодействует с различными хроматина модифицирующие ферменты и вводит различные эпигенетические ландшафты в неактивной Х-хромосомы (XI). Один известный эпигенетические отличительной чертой Xi является гистонов H3 триметил-лизин 27 (H3K27me3) модификация. Здесь мы опишем простой и быстрый иммуно-FISHпротокол для обнаружения Xist РНК с использованием РНК FISH с несколькими датчиками олигонуклеотидных в сочетании с иммунофлюоресценции H3K27me3 изучить локализацию Xist РНК и связанные изменения эпигенетических. С использованием олигонуклеотидных зондов результатов в более короткие сроки инкубации и более чувствительного обнаружения Xist РНК по сравнению с в пробирке транскрибируемых РНК-зондов (рибозонды). Этот протокол обеспечивает мощный инструмент для понимания динамики lncRNAs и связанных с ним эпигенетические модификации, структура хроматина, ядерной организации и регуляции транскрипции.

Введение

Млекопитающих Х-хромосомы инактивации (XCI) представляет собой стратегию для компенсации дисбаланса в Х-хромосомой гена дозе между XX и XY, в котором один из двух Х-хромосом у женщин является транскрипционно инактивированные 1. Инактивация Х-хромосомы является большая модель системы долго некодирующих РНК (lncRNA) исследований. Инактивация Х-хромосомы регулируется несколькими lncRNAs, и была тщательно изучена в течение последних нескольких десятилетий, чтобы раскрыть механизмы перекрестных помех между lncRNAs, транскрипция, структуры хроматина и ядерной организации 2, 3.

Х инактивации центр (XIC) расположен на Х-хромосоме представляет собой комплекс генетический локус состоит из ряда генов, продуцирующих некодирующих РНК 4. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) lncRNA в плацентарные млекопитающие, является одним из таких lncRNA который играет важнейшую роль в X-хромосоме инактивации 5,6. XIST транскрипты окружают расположение фура Xi инициировать инактивации Х-хромосомы, и появляются в виде облака, когда визуализированы с помощью РНК рыбы; Это образование называется как "облако" Xist 7. С Xist РНК взаимодействует с различными хроматина изменения ферменты, со-локализация облака Xist с различными эпигенетических модификаций для молчащего хроматина и репрессивного транскрипции наблюдается при X-хромосомы инактивации 8. Например, Xist РНК взаимодействует с Поликомб репрессивного комплекса 2 (PRC2), который отвечает за H3K27me3 и вызывает репрессивный хроматина 9. Появление Xist облако на Си и его совместной локализации с интенсивным модификации H3K27me3 представляет собой добровольную гетерохроматина ландшафт Xi 10,11.

Цитогенетические методы, такие как ДНК / РНК FISH прошли долгий путь от традиционного метода используются меченые зонды 12 на последние и передовые технологии с повышенной чувствительностью ифлуоресцентных изображений с использованием нескольких олигонуклеотидных зондов 13,14. ДНК / РНК FISH в сочетании с иммунофлюоресценции регулярно используется в качестве цитологического инструментом для понимания пространственно-временной ядерной организации, локализация РНК, структура хроматина и модификации. Наиболее стандартный препарат зонд для РНК FISH включает использование плазмиды или бактериальных искусственных хромосом (ВАС) клонов и их последующей классификации либо с переводом ник или случайного праймера 15. Тем не менее, почти 70% генов у мышей и 40% генов у человека показывают, перекрытие смысловых и антисмысловых транскриптов 16, следовательно, требует метод FISH нити конкретным районам в целях отличить смысл и антисмысловых транскриптов. В пробирке, транскрибируемые РНК-зондов (Riboprobe ) часто используются для цепи РНК с FISH 17,18; Однако, это включает подготовку плазмиды клона или ПЦР-продукта с Т7, SP6 или T3 промотора и синтеза рибонуклеотидными зондами. Кроме того, рибозонды получены из геномаIC ДНК или кДНК часто содержат не конкретные регионы и повторяющиеся элементы, что приводит к высокой фонового шума. Другой вопрос, что рибозонды, которые несколько сотен нуклеотидов в длину и содержат несколько флуорофоры, не может эффективно проникать в ядро. Чтобы обойти это, несколько короче олигонуклеотидных зондов, меченных с помощью одного флуорофора в конце были разработаны, которые имеют хорошую чувствительность, равномерную силу сигнала и простоту очистки и обработки 14. Кроме того, олигонуклеотиды, ДНК, как правило, более стабильны, чем РНК. Мы применили подобную стратегию с использованием олигонуклеотидов в Xist РНК FISH 19 с иммунофлуоресценции понимать эпигенетические динамику Xi, вызванные Xist lncRNA в процессе инактивации Х-хромосомы. Этот протокол описывает создание олигонуклеотидных зондов и надлежащей подготовки клеток, а также использование иммунофлуоресценции и РНК рыбы. Xist РНК FISH с использованием нескольких oligonucleotides является экономически эффективным подходом в долгосрочной перспективе, если Xist РНК FISH проводится на регулярной основе в своей лаборатории. Этот метод может быть использован для идентификации lncRNAs в клетках, одновременно отображение его совместную локализацию с эпигенетических модификаций или факторов. Одно из главных преимуществ протокола является возможность легко изменять его в соответствии с своих научных интересов.

протокол

1. Зонд Подготовка

  1. Получить несколько уникальных олигонуклеотидов в Xist (20-30 нуклеотидов, длины олигонуклеотидов, 63-65 ° С температуры плавления, таблица 1) с 5'-амино модификации и приостановить в воде.
  2. Бассейн эквимолярные количества олигонуклеотидов с 5'-амино модификации (всего 4,5 мкг) и этикетка с амин-реактивным флуоресцентным красителем следующей инструкцией изготовителя.
    1. Растворите объединенных олигонуклеотидов в финале 5 мкл нуклеазы без воды и добавить 3 мкл 1 М бикарбоната натрия для олигонуклеотидным решения.
    2. Добавить 2 мкл ДМСО во флакон амина-реактивного красителя и вихря кратко.
    3. Смешайте олигонуклеотидного раствора реакционноспособного красителя в ДМСО и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте.
  3. Очищают флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов от колонке G-25 с последующим осаждением этанолом.
    1. Колонка Центрифуга G-25 в 750 мкг в течение 1 мин для удаления избытка буфер хранения.
    2. Добавить 40 мкл нуклеазы без воды в меченой смеси, полученной на стадии 1.2.3 и применить к колонке G-25. Центрифуга при 750 мкг в течение 2 мин.
    3. Добавить 50 мкл нуклеазы без воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 250 мкл этанола в очищенном зонда с шага 1.3.2. Хранить при -80 ° С в течение 30 мин и центрифугируют при 21000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
    4. Вымойте осажденных олигонуклеотидов один раз 1 мл 70% этанола.
    5. Повторное приостановить в 50 мкл нуклеазы без воды или ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА) до конечной концентрации приблизительно 10 мкМ.
  4. Развести флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов до конечной концентрации 250 нМ с гибридизации буфера (10% формамида; 2Х SSC [300 мМ NaCl; 30 мМ цитрат натрия]; 2 мг / мл БСА, 10% сульфат декстрана).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого быстрого протокола рыба, олигонуклеотид родежды в Xist были разработаны и использованы при более высокой концентрации, чем в нормальном протокола FISH с использованием олигонуклеотидных зондов, с тем, чтобы сократить время инкубации в течение гибридизации.

2. Презентация Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть подготовлены для иммуно-FISH с использованием мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) или эмбриональных тело (EB) дифференциации клеток 20, 21 либо растет их непосредственно на поли-лизин-обработанной слайд или с помощью Cytospin с клеточной суспензии. Здесь, подготовка слайд в Cytospin показано.

  1. Аспирируйте культуральной среды в чашке с 6-а. Промыть PBS (комнатная температура), и аспирата тщательно.
  2. Добавить 0,5 мл трипсина на блюдо 6-а, инкубировать в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С.
  3. Добавить 5 мл среды и дисперсных клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз.
  4. Передача клеток в 15 мл пробирку, центрифуги в течение 5 мин при 200 х г при комнатной температуре.
  5. Откажитесь от средой вбы мягко приостановить клетки в 2 мл PBS.
  6. Граф клеток с использованием гемоцитометра и разводят клеточной суспензии в 4 х 10 5 клеток / мл по PBS.
  7. Соберите слайд, фильтр карты и камеру с зажимом и поместите их в соответствующие пазы в роторе Cytospin. Добавить 250 мкл каждого образца, полученного на стадии 2.6 в каждую камеру из собранных единиц в цитоспина. Центрифуга при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре.
  8. Заполните 3 Коплин банки на льду с 40 мл каждого из ледяной PBS, ЦСК буфере (10 мМ, рН ТРУБЫ 6,8; 100 мМ NaCl; 300 мМ сахарозы; 3 мМ MgCl 2), и CSKT буферные (ЦСК буфер с 0,5% Triton Х-100), соответственно.
  9. После завершения цитоспина, быстро передавать слайд в ледяной PBS и инкубировали в течение 5 мин.
  10. Передача слайд в ледяной ЦСК буфера и инкубировать в течение 1 мин.
  11. Передача слайд в ледяной CSKT буфера и инкубировать в течение 5 мин.
  12. Передача слайд обратно в ледяной ЦСК BUFфер и инкубировать в течение 1 мин.
  13. Передача слайд в 4% параформальдегид в PBS и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.

3. Иммунофлуоресценции

  1. Поместите слайды в Коплин банку с PBST (1x PBS с 0,1% твина-20) в течение нескольких секунд.
  2. Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость от слайда и поместите его в пустую пипетку кончиком коробке с водой. Перекрытие слайд с 40 мкл блокирующего раствора (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Твин-20), осторожно поместить покровное и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. Удалить покровное, удалить блокирующий раствор, и добавить 40 мкл первичного антитела гистонов H3K27me3 разбавленного до концентрации 1: 500 в блокирующем растворе. Поместите покровное обратно на предметное стекло и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНКазы ингибитор в блокировании решения могут быть полезны для сохранения РНК в этом РНК FISH Протокол когда поликлональные антитела используются.
  4. Вымойте слайд в 2 раза в Коплин банки, наполненные ФБРТ, в течение 5 минут каждый, осторожно встряхивая время мытья.
  5. Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость и поместить слайд обратно в коробку наконечника. Наложение с 40 мкл вторичного антитела (1: 500), разведенного в блокирующем растворе, разместить покровное и инкубировать в течение 15 мин в темноте. Для следующих шагов, сохранить слайд в темноте во все времена.
  6. Вымойте 2 раза в Коплин банки с PBST как в шаге 3.4.

4. РНК FISH с олигонуклеотидных зондов

  1. Предварительно разогреть пустой пипетки кончика коробку с водой на дне, чтобы предотвратить слайды из сушки при 37 ° С в течение РНК рыбу в шаге 4.3.
  2. Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость от слайда, начиная с шага 3.6 и поместить слайд в пипетку кончиком коробке с Ватэр в нижней части. Добавить 500 мкл промывочного буфера FISH (10% формамида в 2х SSC) на слайде и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Удалить FISH промывочного раствора, добавить 8 мкл олигонуклеотидных зондов на слайде, место покровное, и передать слайда в подогретого поле пипетки наконечника с водой на дне; инкубировать при 37 ° С в течение 1-2 ч.
  4. 3 место подогретого банки Коплин на водяной бане при 37 ° С с рыбой промывочного буфера, рыба промывочного буфера с DAPI и 2х SSC.
  5. После 1-2 часов инкубации для РНК FISH, положить слайд в предварительно нагретой буфера FISH стирки.
  6. Выдержите слайд в течение нескольких минут, пока покровное не падает на слайде.
  7. Поместите затвор назад в промывочного буфера, и продолжают инкубацию в течение 5 мин.
  8. Передача слайда к другому Коплин банку с подогретого FISH промывочного буфера с 0,5 нг / мл DAPI и инкубировать в течение 5 мин.
  9. Передача слайда к другому Коплин банку с подогретого 2х SSC и инкубировать в течение 5 мип.
  10. Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость и поместить слайд обратно в сухом боксе наконечника. Добавить 4 мкл antifade с DAPI на слайд и поместите покровное.
  11. Печать покровное с лаком для ногтей и наблюдать под микроскопом. Слайд может храниться при температуре 4 ° С в темноте в течение нескольких месяцев.

Результаты

Характерные изображения быстро иммуно-FISH показаны на рис 1А. Со-локализация РНК Xist облака и H3K27me3 сигнала на Xi была обнаружена при дифференцировке клеток женщин. В день 12 после дифференцировки, более 90% клеток ЕВ была Xist облако (фиг.1В). Краткое олигонуклеотидные зонды эф...

Обсуждение

В этой статье мы представили краткий протокол иммуно-FISH, что занимает меньше 5 ч завершить подготовку слайдов, Xist РНК рыбу, и иммунофлюоресценции H3K27me3. По сравнению с общим подходом иммуно-FISH для Xist РНК обнаружение, которые, как правило, нуждается в инкубации в течение ночи для РНК FISH, это...

Раскрытие информации

No conflicts of interest declared.

Благодарности

We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
oligonucleotides with 5’-amino modificationIDT
Alexa Fluor 488 Reactive DyeLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 columnsGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)Roche10715859103
Histone H3K27me3 antibodyActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbedLife TechnologiesA21424
ProLong Gold antifade reagentLife TechnologiesP36931

Ссылки

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

93XistX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены