빠른 형광<em&gt; 현장에서</emX 염색체 불 활성화에 히스톤 수정의 면역 형광와 XIST RNA 결합에 대한&gt; 하이브리드 프로토콜

요약

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

초록

면역 형광 (면역 FISH) 동일계 하이브리드 화 (FISH)에서 RNA 형광체를 결합 단백질, 후생 유전 학적 변형 및 다른 세부 사항들의 위치 파악에 동시 통찰력 RNA 현지화 공간적 동역학을 검출하는 단일 세포 수준에서 사용될 수있는 기술을 만들어 이는 면역에 의해 강조 할 수있다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) - 매개 유전자 침묵에 대한 패러다임이다. 포유류 암컷의 두 X-염색체 중 하나 (XIST 구름이라고도 함) X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA 축적은 X 염색체 비활성화를 시작하는 중요한 단계입니다. XIST RNA를 직접 또는 간접적으로 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용 및 비활성 X 염색체 (사이)에 별개의 후생 유전 학적 풍경을 소개합니다. 사이의 하나 알려진 후생 유전 학적 특징은 히스톤 H3 트리메틸 라이신 27 (H3K27me3) 수정이다. 여기서 우리는 간단하고 빠른 면역 FISH를 설명XIST RNA의 현지화와 관련된 후성 유전 적 변형을 검사 H3K27me3의 면역과 함께 여러 올리고 뉴클레오티드 프로브 RNA FISH를 사용 XIST RNA를 검출하기위한 프로토콜입니다. 올리고 뉴클레오티드 프로브 짧은 배양 시간에 결과와 시험 관내 전사 RNA 프로브 (리보 프로브)에 비해 XIST RNA의 민감한 검출 기능의 사용. 이 프로토콜은 lncRNAs의 역학 및 관련 후성 ​​유전 학적 변형, 크로 마틴 구조, 핵 조직 및 전사 조절을 이해하기위한 강력한 도구를 제공합니다.

서문

포유류 X 염색체 비활성화 (XCI)은 여성에서 두 개의 X-염색체 중 하나가 전사적으로 ¹ 불 활성화 된 것을 특징으로 XX와 XY 사이의 X-연결된 유전자 복용량 불균형을 보상하기위한 전략이다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. X 염색체 비활성화 여러 lncRNAs 의해 규제되고, 광범위 lncRNAs, 전사, 염색질 구조와 핵 조직 ^{(2, 3)} 사이의 크로스 토크 메커니즘을 밝히기 위해 지난 수십 년 동안 연구되어왔다.

X 염색체에 위치한 X 불활 센터 (XIC)의 비 RNA를 코딩하는 유전자의 ^{제조 (4)의} 개수로 이루어지는 복합 유전 궤적이다. X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA eutherian 포유류는 X 염색체 불 활성화 ^5,6에서 중요한 역할을 하나의 lncRNA이다. XIST 성적 증명서는 쿵푸의 위치를​​ 둘러싸고진짜야 사이는 X 염색체 비활성화를 시작하고, RNA FISH를 사용하여 시각 때 구름으로 표시합니다; 이 형성 "XIST ^{클라우드"(7)라고합니다.} XIST RNA는 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용하기 때문에, 침묵 크로 마틴과 억압 전사에 대해 서로 다른 후성 유전 학적 수정을 XIST 구름의 공동 현지화는 X 염색체 불 활성화 ⁽⁸⁾ 동안 관찰된다. 예를 들어, XIST RNA는 H3K27me3에 대한 책임과 억압 염색질 상태 ^(9)을 유도 polycomb 억압 복잡한 2 (PRC2)와 상호 작용합니다. 사이와 집중 H3K27me3 수정과의 공동 현지화에 XIST 구름의 발생 사이 ^{(10, 11)의} 통성 이질 염색질 풍경을 나타냅니다.

이러한 DNA / RNA FISH 등의 세포 유전 학적 기술은 향상된 감도와 최근의 진보 된 기술에 방사성 동위 원소를 프로브 ^(12)를 사용하여 전통적인 방법에서 먼 길을왔다여러 올리고 뉴클레오티드 프로브 ^{(13, 14)를} 사용하여 형광 이미징. 면역 형광과 함께 DNA / RNA의 물고기는 정기적으로 시공간 핵 조직, RNA 현지화, 크로 마틴 구조 및 수정을 이해하는 세포 학적 도구로 사용되어왔다. RNA FISH에 대한 대부분의 표준 프로브 준비 플라스미드 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 닉 번역 또는 임의 프라이밍 ⁽¹⁵⁾ 중 하나를 자신의 다음 라벨의 사용을 포함한다. 그러나 생쥐의 유전자의 약 70 %와 인간 유전자의 40 %는 센스 및 안티센스 성적 증명서를 구별하기 위해, 따라서 가닥 특정 FISH 방법을 필요로 센스 및 안티센스 성적 증명서 ^(16)의 중첩을 보여줍니다. 시험 관내 전사 RNA 프로브를 (리보 프로브 (riboprobe)를 )는 종종 특정 가닥 RNA의 FISH ^{(17, 18)에} 사용된다; 그러나, 이는 T7, SP6, 또는 T3 프로모터와 리보 프로브 합성 플라스미드 클론 또는 PCR 산물을 준비하는 것을 포함한다. 또한, genom에서 파생 된 리보 프로브IC DNA 또는 cDNA를 종종 높은 배경 노이즈가 아닌 특정 지역과 반복적 인 요소가 포함되어 있습니다. 또 다른 문제는, 길이 수백 뉴클레오타이드 복수 형광체를 포함하는 리보 프로브를 효율적으로 핵으로 침투 할 수 없다는 것이다. 이를 회피하기 위해, 하나의 단부에서 복수의 형광 물질로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 짧아 양호한 감도, 신호 강도가 균일하고, 정제의 용이성 및 ¹⁴ 취급이 개발되었다. 또한, DNA 올리고 뉴클레오티드는 일반적으로 RNA보다 더 안정하다. 우리는 X 염색체 불 활성화 과정 XIST lncRNA 의해 유도 후생 유전 학적 사이의 역학 관계를 이해하기 위해 면역 형광 XIST RNA FISH와 ^19의 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 유사한 전략을 적용 하였다. 이 프로토콜은 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 세포의 적절한 제제의 창조뿐만 아니라 면역 형광 및 RNA FISH의 이용을 설명한다. 여러 oligonucle를 사용 XIST RNA FISHXIST RNA 물고기가 하나의 실험실에서 일상적으로 수행되는 경우 otides은 장기적으로 비용 효과적인 방법입니다. 이 기술은 후생 유전 학적 변형을 동시에 또는 인자와의 공동 현지화를 맵핑하는 동안 세포에서 lncRNAs를 식별하는데 사용될 수있다. 프로토콜의 하나의 큰 장점은 쉽게 하나의 연구 분야에 맞도록 수정할 수있는 기능입니다.

프로토콜

1. 프로브 준비

1. 5'- 아미노 수정하여 여러 독특한 XIST에 올리고 뉴클레오티드 (20 ~ 30 염기 길이의 올리고 뉴클레오티드, 63 ~ 65 ºC의 용융 온도, 표 1)를 얻어 물을 일시 중지합니다.
2. 5' 아미노 수정 (총 4.5 μg의) 제조업체의 지시에 따라 아민 반응성 형광 염료와 레이블 올리고 뉴클레오티드의 풀 몰량.
   1. 클레아없는 물 5 μL의 최종 풀링 된 올리고 뉴클레오티드에 용해시키고, 올리고 뉴클레오티드 용액에 1 M 중탄산 나트륨 3 μL를 추가한다.
   2. 간단히 아민 반응성 염료와 소용돌이의 바이알에 2 μL의 DMSO를 추가합니다.
   3. DMSO의 반응성 염료와 함께 올리고 뉴클레오티드 용액을 혼합하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다.
3. 에탄올 침전 다음에 G-25의 열을 기준으로 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 정화.
   1. 750 XG 1 분 원심 분리기 G-25 컬럼은 과잉 저장 버퍼를 제거합니다.
   2. 단계 1.2.3에서 생산되는 라벨 혼합물에 40 ㎕의 클레아없는 물을 추가하고 G-25 컬럼에 적용됩니다. 2 분 동안 750 XG에 원심 분리기.
   3. 단계 1.3.2에서 정제 된 프로브로 50 μL 클레아없는 물, 10 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) 및 에탄올 250 μL를 추가한다. 4 ° C에서 15 분 동안 21,000 XG에 30 분 원심 분리기에 대한 -80 ° C에서 보관.
   4. 70 % 에탄올 1 ml로 한 번 침전 올리고 뉴클레오티드를 씻으십시오.
   5. 50 μL에 재현 탁 클레아없는 물 또는 TE (10 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 1 mM의 EDTA) 대략 10 μM의 최종 농도.
4. 혼성화 완충액으로 250 nM의 최종 농도로 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 희석 (10 % 포름 아미드; 2 × SSC [300 mM의 염화나트륨을 30 mM의 시트르산 나트륨], 2 ㎎ / ㎖ BSA, 10 % 덱스 트란 설페이트).
   참고 :이 빠른 물고기 프로토콜로, 올리고 뉴클레오티드 페이지XIST 가운에 설계 및 혼성화 배양 시간을 단축하기 위해, 올리고 뉴클레오티드 프로브를 이용하여 FISH 프로토콜 정상보다 더 높은 농도로 사용 하였다.

2. 슬라이드 준비

참고 : 슬라이드가 마우스 배아 줄기 (ES) 또는 배아 체 (EB)를 사용하여 면역 FISH을 준비 할 수 있습니다 폴리 라이신 처리 된 슬라이드에 직접 성장 또는 세포 현탁액과 cytospin를 사용하여 전지 ^{(20), (21)을} 차별화. 여기에, cytospin에 의해 슬라이드 준비가 표시됩니다.

1. 6 잘 접시에 문화 매체를 대기음. 철저하게 PBS (실온) 및 흡인 씻으시오.
2. 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 품어, 6 자 접시에 트립신의 0.5 ML을 추가합니다.
3. 매체의 5 ML을 추가하고 부드럽게 여러 번을 피펫 아래로 세포를 분산.
4. 실온에서 200 XG에서 5 분 동안, 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
5. 매체를 폐기부드럽게 2 ml의 PBS에 세포를 일시 좋아.
6. 혈구 세포를 이용하여 카운트하고, PBS에 의해 4 × ¹⁰⁵ 세포 / ml에서 세포 현탁액을 희석.
7. 슬라이드, 필터 카드와 클립 챔버를 조립하고 cytospin의 회 전자의 해당 슬롯에 배치합니다. cytospin의 조립 단위의 각 실에 단계 2.6에서 제조 된 각 시료의 250 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 1,500 rpm에서 원심 분리기.
8. 40 ml의 얼음처럼 차가운 PBS, CSK 버퍼의 각 얼음 3 코 플린 항아리 채우기 (10 mM의 파이프, 산도 6.8, 100 mM의 NaCl을 300 mM의 자당 3 mM의의 MgCl _2), CSKT 버퍼 (0.5 % 트리톤과 CSK 버퍼 X-100)을 각각.
9. cytospin이 끝나면 신속하게 빙냉 PBS로 슬라이드를 전송하고 5 분 동안 배양한다.
10. 얼음처럼 차가운 CSK 버퍼에 슬라이드를 전송하고 1 분 동안 품어.
11. 얼음처럼 차가운 CSKT 버퍼에 슬라이드를 전송하고 5 분 동안 품어.
12. 얼음처럼 차가운 CSK 버피로 다시 슬라이드로 이동FER과 1 분 동안 품어.
13. PBS로 4 % 파라 포름 알데히드로 슬라이드 이동하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다.

3. 면역 형광

1. 몇 초 동안 (0.1 % 트윈 20 1X PBS) PBST와 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다.
2. 슬라이드 아래로 흘러 버퍼를 남아있게 경사에 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 슬라이드에 묻은 액체를 닦아 물 빈 피펫 팁 상자에 넣습니다. 커버 슬립을 부드럽게 배치 차단 용액 40 μL (1X PBS, 1 % BSA, 0.1 % 트윈 -20)로 슬라이드를 오버레이하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다.
3. , 커버 슬립을 제거 차단 솔루션을 제거하고 1의 농도로 희석 히스톤 H3K27me3 차 항체의 40 μl를 추가 : (500)를 차단 솔루션에. 백 슬라이드 커버 슬립을 넣고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
   주 : 블로킹 용액의 RNase 억제제 FIS이 RNA에서 RNA를 보존하는 것이 도움이 될 수도폴리 클로 날 항체를 사용하는 H 프로토콜.
4. 워시 부드럽게 세척하는 동안 흔들림, 5 분마다, PBST로 가득 코 플린 단지에 2 번 밀어 넣습니다.
5. 슬라이드 아래로 흘러 버퍼를 남아있게 경사에 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 물기를 닦아 다시 팁 상자에 슬라이드를 배치합니다. 이차 항체 (1 : 500) 40 μL와 오버레이 차단 솔루션에 희석, 커버 슬립을 배치하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어. 다음 단계는, 항상 어두운 슬라이드를 유지한다.
6. 단계 3.4에서와 같이 PBST 항아리를 코 플린의 과정을 2 회 반복한다.

올리고 뉴클레오티드 프로브 4. RNA의 물고기

1. 4.3 단계에서 RNA의 FISH 37 ° C에서 건조에서 슬라이드를 방지하기 위해 바닥에 물을 빈 피펫 팁 상자를 미리 따뜻하게.
2. 슬라이드 아래로 흘러 버퍼를 남아있게 경사에 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 단계 3.6에서 슬라이드에 묻은 액체를 닦아 와트와 피펫 팁 상자에 슬라이드를 배치맨 아래에있는 어. 슬라이드에 물고기 세척 버퍼 (2 × SSC 10 % 포름 아미드)의 500 μl를 추가하고, 실온에서 5 분 동안 품어.
3. , FISH 세척 용액을 제거 슬라이드에 올리고 뉴클레오티드 프로브의 8 μl를 추가, 커버 슬립을 배치하고 바닥에 물을 미리 예열 피펫 팁 상자에 슬라이드를 전송; 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
4. 물고기 세척 버퍼, DAPI와 물고기 세척 버퍼 및 배 SSC 37 ° C에서 물을 욕조에 3 미리 예열 코 플린 항아리를 놓습니다.
5. RNA FISH 1-2 시간 배양 한 후, 미리 예열 물고기 세척 버퍼에 덮개를 씌우고.
6. 커버 슬립 슬라이드 오프로 떨어질 때까지 몇 분 동안 슬라이드를 품어.
7. 다시 세척 버퍼에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 배양을 계속합니다.
8. 0.5 NG / ㎖ DAPI로 미리 예열 물고기 세척 버퍼와 다른 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송하고 5 분 동안 품어.
9. 미리 예열 배 SSC와 다른 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송하고 5 마일 부화N.
10. 슬라이드 아래로 흘러 버퍼를 남아있게 경사에 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 물기를 닦아 건조 팁 상자에 다시 슬라이드를 배치합니다. 슬라이드에 DAPI와 antifade 4 μl를 추가하고 coverslip에 배치합니다.
11. 매니큐어와 커버 슬립을 봉인하고 현미경으로 관찰한다. 슬라이드는 몇 달 동안 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

결과

빠른 면역 FISH의 대표 이미지는 그림 1A에 표시됩니다. 사이에 XIST RNA 구름과 H3K27me3 신호의 공동 현지화 여성 세포를 분화 검출되었다. 분화시, 12 일, EB 세포의 90 % 이상 XIST 클라우드 (도 1b)를 가지고 있었다. (150을 97 %, N = 그림 1C) 짧은 올리고 뉴클레오티드 프로브를 효율적으로 거의 모든 H3K27me3 신호 XIST RNA와 공동으로 현지화의 시각화로 이어지는 핵에 침투...

토론

이 논문에서는 H3K27me3에 대한 슬라이드 준비, XIST RNA 물고기, 면역 형광을 완료하는 데보다 5 시간 소요 빠른 면역 FISH 프로토콜을 제시 하였다. 일반적으로 RNA FISH 밤새 배양을 필요로 XIST RNA 검출에 대한 일반적인 면역 FISH 방법과 비교하여,이 프로토콜은 크게 소요되는 시간을 줄일뿐만 아니라, 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 면역 FISH의 감도를 향상뿐만 아닙니다.

...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification	IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye	Life Technologies	A32750
MicroSpin G-25 columns	GE Healthcare	27-5325-01
Cytospin 2	Shandon	59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)	Roche	10715859103
Histone H3K27me3 antibody	Active Motif	61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A21424
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36931