クイック蛍光<em&gt;その場で</emX染色体不活性化におけるヒストン修飾の免疫蛍光とのXist RNA複合のための&gt;ハイブリダイゼーションプロトコル

要約

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

要約

免疫蛍光（免疫FISH）、 インサイチュハイブリダイゼーション （FISH） で RNA蛍光を組み合わせることにより、タンパク質の局在に同時洞察、エピジェネティックな改変およびその他の詳細とRNAの局在化の空間的なダイナミックスを検出するために、単一細胞レベルで使用することができる技術を作成その免疫蛍光によって強調することができる。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）媒介遺伝子サイレンシングのためのパラダイムである。哺乳類の雌の二つのX染色体の1のX非アクティブな特定の転写産物（Xistの雲と呼ばれる）（のXist）lncRNAの蓄積は、X染色体不活性化を開始する重要なステップです。のXist RNAは、直接または間接的に、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用し、不活性X染色体（XI）に明確なエピジェネティックな風景を紹介します。 xiの一つの既知のエピジェネティックな特徴は、ヒストンH3のトリメチルリジン27（H3K27me3）変形例である。ここでは、簡単かつ迅速免疫FISHを記述のXist RNAおよび関連するエピジェネティック修飾の局在を調べるためにH3K27me3の免疫蛍光に結合された複数のオリゴヌクレオチドプローブとのRNA FISHを使用してのXist RNAを検出するためのプロトコル。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）と比較して、より短いインキュベーション時間とのXist RNAのより高感度な検出オリゴヌクレオチドプローブの結果を使用して。このプロトコルは、lncRNAsのダイナミクスとそれに関連するエピジェネティックな修飾、クロマチン構造、原子力組織と転写調節を理解するための強力なツールを提供します。

概要

哺乳類のX染色体不活性化（XCI）は、雌では二つのX染色体の1が¹転写不活性化され、XXとXY間のX連鎖遺伝子量のアンバランスを補償するための戦略である。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）研究のための優れたモデルシステムです。 X染色体不活性化は、複数のlncRNAsによって調節され、広範にlncRNAs、転写、クロマチン構造および核組織^2,3間のクロストークメカニズムを解明するために、過去数十年にわたって研究されてきた。

X染色体上に位置するX不活性化センター（XIC）は、非コードRNA ^4を産生する遺伝子の数で構成される複雑な遺伝子座である。 X-非アクティブな特定の転写産物（のXist）lncRNA真獣類哺乳動物においては、X染色体不活性化^5,6に重要な役割を果たしているそのようなlncRNAです。 Xistの転写物のfuの位置を囲むトゥーレXiはX染色体不活性化を開始し、RNA FISHを用いて可視化するとき雲のように表示される。この形成は、「Xistのクラウド^」7と呼ばれている。のXist RNAは、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用するので、サイレントクロマチンと抑圧的な転写のための別のエピジェネティック修飾とXistの雲の共局在は、X染色体不活性化⁸の間に観察されている。例えば、XistのRNAはH3K27me3を担当し、抑圧的なクロマチン状態^9を誘導するポリコーム抑制複合体2（PRC2）と対話します。 Xiと集中的なH3K27me3の修正との共局在上のXistの雲の発生は、西^10,11の通性ヘテロクロマチン風景を表している。

そのようなDNA / RNA FISHなどの細胞遺伝学的技術は、強化された感度で最近、高度な技術を放射性標識したプローブ^12を用いた従来の方法から長い道のりを歩んでいると複数のオリゴヌクレオチドプローブ^13,14を用いた蛍光イメージング。免疫蛍光と連結DNA / RNAのFISHは、日常的に、時空間核組織、RNAの局在化、クロマチン構造および修正を理解するために、細胞学的ツールとして使用されてきた。 RNA FISHのための最も標準的なプローブの調製は、プラスミドまたは細菌人工染色体（BAC）クローンおよびニックトランスレーションまたはランダムプライミング¹⁵のいずれかそれらのその後の標識の使用を含む。しかし、ヒトにおけるマウスの遺伝子の約70％の遺伝子の40％は、したがって、センスおよびアンチセンス転写物を区別するために、鎖特異的FISH法を必要とする、センスおよびアンチセンス転写物¹⁶の重なりを示している。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）は、多くの場合、鎖特異的RNA FISH ^17,18のために使用される。しかしながら、これは、T7、SP6又はT3プロモータープラスミドクローンまたはPCR産物を調製し、リボプローブを合成することを含む。さらに、リボプローブはGENOMから派生icをDNAまたはcDNAは、多くの場合、高いバックグラウンドノイズを生じる​​非特異的領域および反復エレメントを含む。別の問題は、長さが数百ヌクレオチドであり、複数のフルオロフォアを含むリボプローブは、効率的に核内に浸透することができないということである。これを回避するために、終了時の単一のフルオロフォアで標識された複数の短いオリゴヌクレオチドプローブは、良好な感度、均一な信号強度、精製および取り扱い¹⁴の容易さを有するように開発されてきた。また、DNAオリゴヌクレオチドは、一般的にRNAよりも安定である。我々は、X染色体不活性化の過程のXist lncRNAによって誘発される西のエピジェネティックなダイナミクスを理解するために、免疫蛍光でのXist RNA FISH ¹⁹のオリゴヌクレオチドを用いて、同様の戦略を適用した。このプロトコルは、オリゴヌクレオチドプローブおよび適切な細胞の調製、ならびに免疫蛍光およびRNA FISHの利用の作成を記載している。複数oligonucleを使用してのXist RNA FISHotidesのXist RNA FISHは自分の研究室で日常的に行われた場合、長期的に費用対効果の高いアプローチです。この技術は、同時にエピジェネティック修飾または因子との共局在をマッピングしながら、細胞内でlncRNAsを同定するために用いることができる。プロトコルの1つの主な利点は、簡単に自分の研究関心に合わせてそれを変更する機能です。

プロトコル

1.プローブの準備

1. 5'-アミノ修飾を有する複数の固有のXistにおけるオリゴヌクレオチド（20〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、63-65ºCの融解温度、 表1）を取得し、水に一時停止。
2. 5'-アミ​​ノ修正（合計4.5μgの）、製造業者の指示以下のアミン反応性蛍光色素で標識を用いてオリゴヌクレオチドのプール等モル量。
   1. ヌクレアーゼを含まない水の最終5μlのプールされたオリゴヌクレオチドを​​溶解し、オリゴヌクレオチド溶液に、1M重炭酸ナトリウムの3μlを添加する。
   2. 簡単にアミン反応性染料と渦のバイアルに2μlのDMSOを追加します。
   3. DMSO中の反応性染料をオリゴヌクレオチド溶液を混合し、暗所で1時間室温で混合物をインキュベートする。
3. エタノール沈殿に続くG-25カラムで蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを精製する。
   遠心機G-25カラム。
   1. ステップ1.2.3で生産ラベリング混合物に40μlのヌクレアーゼフリー水を追加し、G-25カラムに適用されます。 2分間750×gで遠心分離する。
   2. ステップ1.3.2から精製されたプローブを、50μlのヌクレアーゼフリー水、10μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および250μlのエタノールを加える。 4℃で15分間21000×gで30分間の遠心のため-80℃で保存。
   3. 70％エタノール1mlで一回沈殿させたオリゴヌクレオチドを​​洗ってください。
   4. 50μl中に再懸濁ヌクレアーゼフリー水またはTE（10mMのトリス-HCl、pH7.5; 1mMのEDTA）、約10μMの最終濃度。
4. ハイブリダイゼーション緩衝液（; 2×SSC [300mMのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム]; 2mg / mlのBSA、10％硫酸デキストラン、10％ホルムアミド）を用いて250nMでの最終濃度に蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを希釈する。
   注：このクイックFISHプロトコルで、オリゴヌクレオチドPXistの中のローブを設計し、ハイブリダイゼーションのためのインキュベーション時間を短縮するためにオリゴヌクレオチドプローブを使用して、通常のFISHプロトコルよりも高い濃度で使用した。

2.スライドさせて準備

注：スライドをマウス胚性幹（ES）または胚様体（EB）を用いた免疫FISH用に調製することができるポリ-リジンで処理したスライド上に直接成長または細胞懸濁液をサイトスピンを用いて、セル^20、21を微分する。ここで、サイトスピンによりスライドの準備を示している。

1. 6ウェルディッシュ中の培地を吸引除去する。 PBSで洗浄し（室温）、そして徹底的に吸引除去する。
2. 37℃で5〜10分間インキュベート、6ウェルディッシュにトリプシンの0.5ミリリットルを追加します。
3. 培地の5ミリリットルを加え、穏やかに数回ピペッティングして細胞を分散させる。
4. 室温で200×gで5分間、15mlチューブに遠心し、細胞を移す。
5. メディアのANを破棄優しく2mlのPBSで細胞を懸濁dは。
6. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、PBSによる4×10 ⁵細胞/ mlで細胞懸濁液を希釈する。
7. クリップでスライド、フィルタカードとチャンバーを組み立て、サイトスピンのローターで適切なスロットに入れます。サイトスピンで組み立てられたユニットの各チャンバーにステップ2.6で調製した各サンプルを250μlを追加。室温で10分間、1500rpmで遠心する。
8. 40ミリリットルの氷冷PBS、CSKバッファーのそれぞれと氷上で3コプリンジャーフィル（10mMのPIPES、pHが6.8、100mMのNaCl、300mMのスクロース; 3のMgCl _2）、およびCSKTバッファー（0.5％トリトンとCSKバッファーX-100）、それぞれ。
9. サイトスピンが終了した後、すぐに氷冷したPBS中にスライドを転送し、5分間インキュベートする。
10. 氷のように冷たいCSKバッファにスライドを移し、1分間インキュベートする。
11. 氷のように冷たいCSKTバッファにスライドを移し、5分間インキュベートする。
12. バック氷のように冷たいCSK bufにスライド移動する。FERと1分間インキュベートする。
13. PBS中の4％パラホルムアルデヒド中にスライドを移し、室温で10分間インキュベートする。

3.免疫蛍光

1. いくつかの秒（0.1％のTween-20を1×PBS）PBSTでコプリンジャーにスライドを置きます。
2. 残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重にスライドから余分な液体を拭き取り、水と空のピペットチップボックスに入れてください。静かにカバースリップを置き、ブロッキング溶液を40μl（1×PBS、1％BSA、0.1％のTween-20）を用いてスライドをオーバーレイし、室温で10分間インキュベートする。
3. カバースリップを外し、ブロッキング溶液を除去し、1の濃度に希釈し、ヒストンH3K27me3一次抗体40μlの追加：ブロッキング溶液で500を。バックスライド上にカバースリップを置き、室温で30分間インキュベートする。
   注：ブロッキング溶液中のRNase阻害剤は、このRNA FIS中のRNAを保存するために役立つかもしれないポリクローナル抗体が使用されているHプロトコル。
4. ウォッシュを優しく洗いながら揺れ、5分ごとに、PBSTで満たされたコプリンジャーに2回スライドさせます。
5. 残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重に余分な液体を拭き取り、バック先端ボックスにスライドを置く。二次抗体（1：500）の40μlのオーバーレイブロッキング溶液中で希釈し、カバースリップを置き、暗所で15分間インキュベートする。以下の手順については、すべての回で暗闇でスライドを保つ。
6. ステップ3.4のように、PBSTでjarをコプリンで2回洗浄する。

オリゴヌクレオチドプローブ4. RNA FISH

1. ステップ4.3でのRNA FISH 37℃での乾燥からスライドを防ぐために、下部の水と空のピペットチップボックスを事前に温める。
2. 残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重にステップ3.6からスライドから余分な液体を拭き、ワットとピペットチップボックスにスライドを置く下部のER。スライド上のFISH洗浄緩衝液（2×SSCで10％ホルムアミド）の500μLを加え、室温で5分間インキュベートする。
3. FISH洗浄溶液を外し、スライド上にオリゴヌクレオチドプローブの8μlを添加、カバースリップを配置し、下部の水と予め温めピペットチップボックスにスライドを転送する。 1〜2時間、37℃でインキュベートする。
4. FISH洗浄緩衝液、DAPIによるFISH洗浄緩衝液、および2×SSCで37℃の水浴中で3予め温めコプリンジャーを置き。
5. RNA FISH 1-2時間インキュベートした後、予め温めFISH洗浄緩衝液中にスライドを置く。
6. カバースリップ、スライドの外に低下するまで数分間スライドをインキュベートします。
7. バック洗浄バッファーにスライドを置き、5分間のインキュベーションを続ける。
8. 0.5 / mlのDAPIで予め温めFISH洗浄緩衝液で別のコプリンジャーにスライドを移し、5分間インキュベートする。
9. 予め温め2X SSCで別のコプリンジャーにスライドを移し、5マイルインキュベートN。
10. 残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重に余分な液体を拭き取り、乾いた先端ボックスにバックスライドを置く。スライド上にDAPIで退色防止の4μLを追加し、カバースリップを配置。
11. マニキュアでカバースリップを密封し、顕微鏡下で観察する。スライドは、数ヶ月間暗所で4℃で保存することができる。

結果

迅速な免疫FISHの代表的な画像を図1Aに示されている。 Xiの上のXist RNAクラウドとH3K27me3信号の共局在は、女性の細胞を分化で検出された。分化の際に12日目に、EB細胞の90％以上は、Xistの雲（ 図1B）を有していた。短いオリゴヌクレオチドプローブを効率のXist RNA（; 97％はn = 150、図1C）と共局在し、ほぼすべてのH3K27me3信号の可視化をもたらす、核内に侵入...

ディスカッション

本稿では、H3K27me3ためのスライドの準備、XistのRNA FISH、および免疫蛍光を完了するために、5未満の時間がかかる迅速な免疫FISHプロトコルを提示している。通常RNA FISHのための一晩のインキュベーションを必要とするXist RNA検出のための一般的な免疫FISH法と比較して、このプロトコルは、有意に費やされる時間を減少させるだけでなく、オリゴヌクレオチドプローブを使用して免疫FISHの感度を...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification	IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye	Life Technologies	A32750
MicroSpin G-25 columns	GE Healthcare	27-5325-01
Cytospin 2	Shandon	59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)	Roche	10715859103
Histone H3K27me3 antibody	Active Motif	61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A21424
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36931