הערכה לא פולשנית של היעילות של ניו Therapeutics למעי פתולוגיות שימוש הדמיה אנדוסקופי סידורי של עכברים חיים

Summary

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

סרטן מעי גס (CRC) הוא הסיבה השכיחה ביותר 4 ^th של ממאירות בעולם ^1. למרות ההתקדמות המשמעותית בהבנה של הבסיס המשפחתי של מחלה זו שלנו, נטייה גנטית תורמת רק ל~ 20% מהמקרים CRC ^2. היתרה מיוחסת לגורמים חיצוניים וסביבתיים רבים, כוללים דלקת כרונית. בבני אדם, את הקשר בין דלקת כרונית וסרטן מעי גס ניכר בקוליטיס כיבית (UC) חולים, שיש להם סיכון גבוה יותר לפתח סרטן המעי הגס הקשורים קוליטיס (CAC), בהתאם לתקופה, של המחלה הדלקתית ³ המידה והחומרה ^-5. בהתאם לכך, טיפולים חדשניים בפיתוח לשלוט תגובה החיסונית והייצור הקשורים של גורמי גדילת קידום על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול הדלקתי ^6-8. יש דרישה הולכת וגוברת למודלים של בעלי חיים פרה-קליניים מתאימים לאפיין את היעילות הטיפולית שלתרופות אלו נגד ההתפתחות וההתקדמות של מחלה.

המודלים של עכברים באופן חד משמעי הוכיחו כי מייקרו-הסביבה הדלקתית תורם להתקדמות CRC, גם בהעדר של דלקת גלויה ^9,10. מודלים אלה כוללים את השימוש של נתרן גופרתי dextran פוליסכריד (DSS), ובלבד במי השתייה של עכברים, לדגמן פגיעת אפיתל ומחלת מעי הדלקתי חריפה וכרונית (IBD) ^11,12. למרות שהמנגנון שבאמצעותו DSS גורם נזק לרירית וקוליטיס אינו מובן לחלוטין, חלק מהמחקרים מצביעים על כך שDSS מעכב את פעילות transcriptase וribonuclease הפוכה סלולרית בתוך תאים, או מקדם את הקמתה של מתחמי ננו-שומנים שלהתמזג עם קרום המעי הגס מוביל לאפיתל נזק ^13,14. גם שינויים במודל DSS הסטנדרטי סיפקו תובנה משמעותית המנגנונים שבאמצעותם תאי אפיתל במעי הגס לשמור על הומאוסטזיס וregu רקמהתגובה חיסונית ברירית מאוחר ^15.

ממשל Intraperitoneal של azoxymethane (AOM) לבד, או בשילוב עם DSS, מספק מודל לבחינת יחסי הגומלין בין מוטציות סומטיות ברירית האפיתל ומייקרו-הסביבה הדלקתית וסטרומה ^16,17. AOM הוא מטבוליט של קרצינוגן 1,2-dimethylhydrazine (DMH) שאינו ישירות לגרום למוטציות בדנ"א. במקום זאת, AOM הוא הידרוליזה לmethylazoxymethanol (MAM) על ידי איזופורם ציטוכרום CYP2E1 בכבד, שבו הוא MAM מצומדות עם חומצת glucuronic ולאחר מכן הועבר למעי דרך הפרשות מרה ^18. הוא חשב כי β-glucuronidase החיידקים תורם לזילות של MAM וכתוצאה מכך אלקילציה DNA וההצטברות של מוטציות בתאי האפיתל ^19. רוב הגידולים במעי הגס הנגרם AOM נמל מוטציות missense בגן המקודד β-קטנין, עיבוד החלבון עמיד לdegradati proteasomalב, שתוצאת ההפעלה חריגה של מסלול Wnt-האיתות הקנונית ^20. כאשר הפעילות של AOM היא בשילוב עם הנזק לרירית שהושרו על ידי DSS, הפצע שהתפתח ריפוי תגובה יוצר מייקרו-סביבה כי הוא מסייע לצמיחה וההתרחבות של האפיתל mutagenized. בוריאציה של מודל זה, ממשל חוזר ונשנה של AOM על פני תקופה של מספר שבועות בלבד יכול לשמש מודל סרטן מעי גס סדיר, בהעדר קוליטיס המושרה DSS ^10,17. שני דגמים מחמיאים אלה מספקים הגדרות ניסיוניות ללמוד CAC וCRC סדיר בהתאמה, שניהם קשורים למייקרו-סביבה של גידול פרו-דלקתי ^10.

השימוש באנדוסקופיה הסידורי בעכברים היה חלוץ ידי בקר ועמיתים ^21, ומאפשרת ניטור אורך של קוליטיס והתקדמות גידול. כאן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים פרה-קליניים המבוססים על נזק הנגרם DSS הרירי ו / או tu תיווך AOMמור אינדוקציה לגרום reproducibly פתולוגיות מעי הגס ספציפיות. הפרוטוקול הראשון מתאר גרימת נזק לרירית חריפה בתגובה לממשל DSS לעורר רב של תכונות histopathological הקשורים במחל מעי דלקתי. הפרוטוקול השני מבוסס על שלושה מחזורים רצופים של ממשל DSS לחקות את הזיקוקים של דלקת נפוצה שנצפתה בחולים במחל מעי דלקתיים, ויכול להתבצע בשיתוף עם מוטציות הנוצר על-AOM. הפרוטוקול הסופי מבוסס על מוטציות אפיתל לא סדירות הנוצר על-AOM. עבור כל אחד מהפרוטוקולים הללו, אנו מרחיבים על הנהלים סטנדרטיים הרלוונטיים לכוללים שיטות התערבות מניעתית וטיפוליות שפיתחנו כדי לפקח על היעילות של תרופות חדשות.

Protocol

מכון וולטר ואליזה היכל ועדת אתיקה של בעלי החיים למחקר רפואי אושר כל אחד מההליכים המתוארים בפרוטוקולים אלה.

1. הכנת העכברים ניסוי

1. להלחין קבוצות ניסיוניות של לפחות 4 מין תאם C57BL / 6 עכברי 6-8 בן שבוע (מ 'musculus) שהם התרבו ושוכנו באותה (SPF) מתקן חיה / חדר הפתוגן ללא ספציפי ומסופקים עם מזון ומים autoclaved. השימוש בנקבות העכברים יאפשר שיתוף דיור של עכברים מקווים שונים, מספרי תיבת הגבול, ולהפחית וריאציה כלוב לכלוב.
2. ודאו עכברים, כי הם לפחות 6 שבועות של גיל כדי לאפשר הליכי אנדוסקופיה באמצעות נדן אנדוסקופיה קוטר 3.0 מ"מ.
3. השתמש בעכברים מאותו הרקע הגנטי, והיכן שניתן, מכלובים מאוחסנים על אותו המדף לצמצום תנודות הקשורות להמיקרופלורה במעי. וריאציות במיקרופלורה בין מתקני בעלי חיים צריכים להילקח בחשבון when קביעת עכברי בקרה הנאותים וגנוטיפים עבור כל ניסוי ^22.
4. מארק עכברים על ידי קטעי אוזן / בוהן, קעקועים, או דומה, כדי לאפשר זיהוי קל.
5. לשקול עכברים ביום 0, כדי לקבוע משקולות בסיס ניסיוני.
6. לבצע אנדוסקופיה (ראה סעיף 5) של עכברים ביום 0 להקליט פנוטיפים מעי הגס תחילת המחקר.

2. ניסיון פרה-קליני בניזק אפיתל והחריף קוליטיס דגם

1. הכן פתרון של הסוכן הטיפולי להיבדק. לתרופות מועברות על ידי gavage פה (PO), להכין פתרונות לנפח מרבי של 100 μl. לתרופות מועברות על ידי הזרקת intraperitoneal (IP), להכין פתרונות לנפח מרבי של 200 μl.
   הערה: חוזרת ונשנית מתן תרופת ה- IP או פו על פני תקופות ממושכות של זמן יכול לגרום לשינה את התנהגות עכבר. החלף את אתר הזרקת ip, כדי למנוע אי נוחות מתמשכת. לממשל פו, לספק את העכברים עם autocזרעי חמניות התמרקו כ'פינוק 'כדי למזער את הקשר השלילי עם הליך gavage.
2. ביום 1, לנהל הטיפולי של עניין (מוכן בשלב 2.1) ובקרות רכב מתאימות. בדוגמא בתנאי (איור 6 א), 5 מיקרוגרם של אנושי רקומביננטי (RH) iInterleukin (IL) -11 חלבון פורקה ב ופר פוספט 200 μl (PBS) וip מנוהל
3. לקבוע את העיתוי ותדירות של הממשלים, אשר יהיו תלוי בפרופיל הפרמקוקינטי הוקם למגיב הטיפולי שנבדק. איור 1 מתאר טיפול מונע באמצעות זריקות ip פעמיים ביום במהלך הניסוי.
4. לפקח, בם: עקביות צואה ואת הנוכחות של דם, ולשקול כל עכבר יומי. בימים של טיפול, במשקל צריך לחפוף עם ממשל של התרופה הטיפולית כדי למזער את הלחץ לעכברים הנגרמים על ידי טיפול חוזר ונשנה.
5. ביום 3, להכין 2.5% (2.5 גר '/ 100 מיליליטר) פתרון DSS במי השתייה המסופקים באופן שגרתי לעכברים על ידי מתקן בעלי החיים. כ 5 מיליליטר / עכבר / יום של פתרון DSS נדרש לצורך הניסוי. צריכת המים DSS עשויה להשתנות אם טמפרטורת הסביבה של מתקן בעלי החיים משתנה.
   הערה: DSS הוא גירוי וצריך להיות מטופל בהתאם להוראות MSDS.
6. לספק DSS טרי כרצונך עכברים בבקבוקי מים נקיים במשך 5 ימים רצופים. בערבו של יום 5, לספק מי שתייה רגילה, בנוסף לכדורי מזון מרוסקים ותוספת חלבון הניתנת במנות קטנות פטרי (שייק החלבון 100 כדורי מזון g / 10 ג '/ 10 מיליליטר מים). זה מונע התייבשות ומסייע במזעור אובדן משקל חמור.
7. להרדים עכברים על ידי הרעלת CO ₂ ולאסוף רקמות לניתוח היסטולוגית לאחר בבוקרו של יום 8, או כאשר העכברים לחוות ≥15% ירידה במשקל-יותר משלושה גימי onsecutive, לפי המוקדם.
   הערה: התאם את מינון DSS בין 1-4% (w / v) תלוי במיקרופלורה של מתקן בעלי החיים ואצווה של DSS. לבצע, בדיקה שגרתית אצווה להקים את המינון המתאים וDSS וריאציה אצווה לתצווה לעקוף. המינון המתאים צריך להיות מבוסס על ירידה במשקל (לא יותר מ- 15% ממשקל מקורי) ואישר את histopathology קוליטיס.

3. ניסיון פרה-קליני בקוליטיס כרוני או דגם הסרטן הקשורים קוליטיס

1. למודל קוליטיס הכרוני מתחיל מצעד 3.7.
2. למודל הסרטן הקשורים קוליטיס (CAC), ביום 1, להזריק כל עכבר עם 10 מ"ג / קילוגרם (W / w) azoxymethane (AOM, 250 μl, IP).
   הערה: AOM הוא חומר מסרטן ויש לטפל בהתאם להוראות MSDS.
3. פתרונות מניות של AOM מוכנים כמו 10 מ"ג / מיליליטר aliquots ומאוחסנים ב -20 ° C. ביום ההזרקה, פתרון מניות AOM מופשר ומדולל ל1 מ"ג / מ 'l בPBS. יש להימנע הקפאה להפשרה של פתרון מניות AOM חוזרים ונשנים.
4. מינון AOM עשוי להיות מותאם בין 8-12 מ"ג / קילוגרם. בדיקות שגרתיות אצווה נדרשת לשם קביעת המינון המתאים AOM כדי לעקוף רעילות לעכברים עקב וריאציה אצווה לתצווה.
5. במהלך הימים הבאים 1-7 משקולות ממשל AOM תהיה יציבה ומסיבה זו ניטור במשקל יכול להיות מושמט בימים 1-7 להימנע מבעלי חיים טיפול שלהפריש מטבוליטים רעילים לתאים בצואה שלהם.
6. ביום 7 כל המצעים צריך להיות שונה בעקבות הליכים ציטוטוקסיות. ברגע ששינוי המצעים הושלם, בעלי החיים כבר לא דורשים נהלי טיפול רעילים לתאים, כפי שהם כבר לא יהיו להפריש מטבוליטים רעילים לתאים.
7. ביום 8, להכין 2.5% (2.5 גר '/ 100 מיליליטר) פתרון DSS (כפי שמתואר בשלב 2.5) ולספק לעכברים כרצון.
8. לשקול עכברים יומיים לאורך כל הניסוי ולפקח על סימני מחלה, כולל פו קפליםr, רוכן, צואה דמה ותנועה מופחתת.
9. ביום 13, להסיר את פתרון DSS ולספק את העכברים במי שתייה רגילים עד ליום 28. ימים 8-28 מהווים "מחזור" אחד מפרוטוקול קוליטיס / CAC הכרוני.
10. על 13-28 ימים, כאשר ניתנים העכברים מי שתייה רגילה, לספק את העכברים עם כדורי מזון מרוסקים ותוספת חלבון הניתנת במנות קטנות פטרי (כדורי מזון 100 גר '/ 10 ייק חלבון g / 10 מיליליטר מים). זה מונע התייבשות ומסייע במזעור אובדן משקל חמור.
    הערה: תוספי החלבון במחית לא צריכים להינתן כאשר העכברים מקבלים DSS המכיל מי שתייה על מנת להבטיח עקביות בצריכת DSS.
11. ביום 20 לבצע בדיקה אנדוסקופית השנייה כדי לפקח על בריאות עכבר בודדת (ראה סעיף 5).
12. ביום 29 בחוזר מחזור DSS (מחזור 2: 2.5% (w / v) DSS סיפק במהלך הימים 29-33 ומי שתייה רגילה במהלך הימים 34-50).
13. ביום 40 לבצע third בדיקה אנדוסקופית כדי לפקח על בריאות עכבר בודדת ולקבוע נטל גידול (ראה סעיף 5).
14. אם אין גידולים גלויים על ידי אנדוסקופיה ביום 40, מתחיל מחזור DSS שלישי בימי 50-72 (מחזור 3: 2.5% (w / v) DSS סיפק במהלך הימים 50-55 ומים שתייה רגילים במהלך הימים 56-72). בדרך כלל, גידולים נראים על ידי יום 40 ולכן המחזור השלישי של DSS יכול להיות מושמט.
15. ברגע שהגידולים להיות גלויים על ידי בדיקה אנדוסקופית, להקצות לכל עכבר ציון גידול אנדוסקופית (ראה סעיף 5) ולהקצות עכברים בודדים לקבוצות עם נטל גידול בסיסי דומה.
16. ביום 42 (או כאשר גידולים גלויים), לנהל את המתחם הטיפולי או שליטה ברכב רלוונטי (ראה סעיף 2.2). התזמון של המינונים יהיה תלוי בפרופיל הפרמקוקינטי של טיפולי. דוגמא לטיפול התערבות הזריק ip שלוש פעמים בשבוע בעכברים עם גידולים הוקמו מסופקים (איור 2).
17. בצע דוארבחינות ndoscopic פעם בשבוע על משך הטיפול הטיפולי לפקח נטל גידול. בדרך כלל, 4 שבועות של טיפול טיפולי די להתבונן תגובה לטיפול אובייקטיבית. בעקבות הפסקת הטיפול, קבוצה של עכברים יכולה גם להיות במעקב על ידי אנדוסקופיה להשנות גידול.
18. להרדים עכברים על ידי הרעלת CO ₂ ולאסוף רקמות לאנליזה ביוכימית ו / או היסטולוגית בבוקרו של יום 72 או כאשר עכברים לחוות ≥15% ירידה במשקל במשך יותר משלושה ימים רצופים, ראשון מביניהם.

4. ניסיון פרה-קליני בסרטן מעי גס בדגם טפטוף

1. ביום 1, להזריק כל ip עכבר עם 10 מ"ג / קילוגרם AOM (ראה שלב 3.2). מינון AOM עשוי להיות מותאם בין 8-12 מ"ג / קילוגרם. בדיקות שגרתיות אצווה נדרשת לשם קביעת המינון המתאים AOM כדי לעקוף רעילות לעכברים עקב וריאציה אצווה לתצווה.
2. חזור על ההזרקה ביום הראשון של כל שבועבמשך 5 השבועות הבאים (איור 3). יש לטפל בעכברים על פי נהלי בטיחות ציטוטוקסיות לכל 6 השבועות.
3. לשקול כל עכבר ביום הזרקת AOM כדי למזער את המצוקה לעכברים הנגרמים על ידי טיפול חוזר ונשנה.
   הערה: AOM הוא חומר מסרטן ויש לטפל בהתאם להוראות MSDS.
4. יש לטפל בכל בעלי החיים על פי נהלי בטיחות ציטוטוקסיות עבור 6 השבועות של זריקות ip AOM נדרשות לפרוטוקול זה.
5. במהלך השבוע 8 לבצע בדיקה אנדוסקופית כדי לפקח על גידולים מתפתחים (ראה סעיף 5). בדיקה אנדוסקופית צריכה להתבצע אחת לשבועיים עד הגידולים להיות גלויים. בדרך כלל, wild-type C57Bl / 6 חיות מתחילות לפתח גידולים בכ -40 שבועות לאחר שהממשל הראשוני של AOM.
6. ברגע שהגידולים להיות גלויים על ידי בדיקה אנדוסקופית, להקצות לכל עכבר ציון גידול אנדוסקופית (ראה סעיף 5) ולהקצות עכברים בודדים לעוקבה עם דומה נטל גידול לפני תחילתו של טיפול רפואי.
7. במהלך השבוע 40 (או כאשר הגידולים הראשונים גלויים), לנהל את המתחם הטיפולי או שליטה ברכב הרלוונטית.
8. התזמון של המינונים יהיה תלוי בפרופיל הפרמקוקינטי של טיפולי (ראה שלב 2.1). דוגמא לטיפול התערבות הזריק ip 3 פעמים בשבוע בעכברים עם גידולים הוקמו מסופקים (איור 3).
9. לבצע בדיקה אנדוסקופית שבועי למשך תקופות טיפול הטיפוליות לפקח נטל גידול. בדרך כלל, 4 שבועות של טיפול טיפולי מספיקים לתגובה לטיפול אובייקטיבית. בעקבות הפסקת טיפול, קבוצה של עכברים יכולה גם להיות במעקב על ידי אנדוסקופיה להשנות גידול.
10. להרדים עכברים על ידי הרעלת CO ₂ ולאסוף רקמות לאנליזה ביוכימית ו / או היסטולוגית של המעי הגס וגידולים בשבוע 45, או הבא 4 שבועות של טיפול.

ve_title "> 5. בחינות אנדוסקופי

1. ציוד אנדוסקופיה צריך להרכיב על פי נהלים קבועים ^16.
2. לעקר ולנקות את הבדיקה אנדוסקופ עם 70% אתנול או חומר סיכה אנטי בקטריאלי.
3. ניתן להקליט וידאו באמצעות מחשב נייד או שולחן עבודה ותוכנת תקשורת סטנדרטית, כגון iMovie. צג סטנדרטי מחשב, ולא לפקח כיתה רפואית, די בכך כדי להמחיש את המעי הגס במהלך הליך אנדוסקופיה (איור 4).
4. הרדימי קבוצות של 5-6 עכברים בו זמנית בתא עם 3% isoflurane ב 100% O ₂ בשיעור של 0.2-0.4 L / min. ברגע שהעכברים מורדמים, אשר אושרו על ידי קמצוץ הבוהן; רמות isoflurane צריכים להשתנות כדי 0.5-2% לצורך התחזוקה.
5. הסר עכבר בודד מהתא, ומניח בצד גחונו עם ראשו מובטח באף-קונוס. צריכה להיות במעקב הרדמה מלאה וצריכה להיות מותאמות הרגליים האחוריות, כך שהם stretched מאחורי העכבר.
6. הנח משחה וטרינר בעיניים של העכברים כדי למנוע יובש.
7. החזק את הזנב של העכבר שבו הוא פוגש את עמוד השדרה התחתונה כדי לחשוף את פי הטבעת באופן ברור. הכנס את נדן אנדוסקופ הקשיח לתוך כוס מים ולהתאים את זרימת האוויר על מנת לאפשר השחרור של בועה קטנה אחד בכל פעם.
8. זרימת האוויר יאפשר המעי הגס לנפח. אם זרימת האוויר חזקה מדי, אוויר להישאב לתוך הבטן של העכבר. אין סיכה נוספת נדרשת.
9. בזהירות להוסיף את נדן אנדוסקופ הקשיח לתוך פי הטבעת. בדרך כלל, אנדוסקופ ניתן להכניס עד 3 סנטימטר, ובנקודה המעי הגס בעקומות עכברים ואינו נגיש לאנדוסקופ הקשיח.
10. קושי נפוץ במהלך הליכי אנדוסקופיה הוא חסימה של גישה ללומן של המעי הגס עקב צואה. למנוע זאת על ידי בעדינות לעסות את הבטן של עכברים לפני ההליך כדי לעודד הפרשת צואה, או בזהירות תמרון אנדוסקופ סביב fecaעניין l במהלך ההליך. תנועת מעיים יכולים להתרחש גם, שבמהלכו אנדוסקופ צריך להיות מוחזק בתפקיד עד שרירי המעי הגס מרגיע.
11. ליזום הקלטת וידאו בכל שלב של הליך אנדוסקופיה. ניקוד מחלה יכול להיות מוקלט על ידי עוזר מנוסה במהלך ההליך, או בשלב מאוחר יותר מהקבצים וידאו.
12. בעקבות הבחינה אנדוסקופית, להחזיר את העכברים לכלוב שלהם ולפקח עליהם במהלך התאוששות מן ההרדמה. בעלי חיים הם בדרך כלל ער ונייד בתוך 2 דקות לאחר פינוי מחרטום isoflurane ניהול.
13. ודא שנהלים אלה מבוצעים על ידי מדען מנוסה. כל הליך אנדוסקופיה ייקח כ 2 דקות לכל עכבר.

6. מחלת ניקוד

1. כדי לפקח על קוליטיס, להבקיע קטעי וידאו לMurine אנדוסקופי מדד קוליטיס החומרה (MEICS) ^16, המתעד שינויים ב( i) עובי דופן המעי הגס מצויינים בשקיפות, עקביות צואה, (iii) שלמות כלי דם ונוכחות, (iv) כיבים ותחומי ההתחדשות שמציגים באופן פרטני, (v) דימום שצוינו על ידי הפיברין פיקדונות (איור 5 א) (ii).
2. כדי לפקח על נטל גידול, להבקיע קטעי וידאו לשכיחות גידולים וגודל. גודל גידול נקבע על ידי הקוטר של לומן המעי הגס שנכבש על ידי (איור 5) גידול ^16. זה נפוץ להשתמש בשני הפרמטרים קוליטיס וניקוד גידול לעכבר אחת. באמצעות אנדוסקופיה, גידולים בודדים והבריאות של רירית המעי הגס יכול להיות במעקב לאורך זמן, מתן לקריאה החוצה להצלחת טיפולים החדשים בחיה אחת.
3. ניתן לחלץ (אופציונליות) תמונות סטילס מקטעי הווידאו עבור דור של דמויות נציג (איור 6).

תוצאות

הרזיה משמשת כפרמטר סטנדרטי כדי לפקח על מחלות הקשורות לדלקת מעי גס, המשמש באופן שיגרתי כדי לפקח על הבריאות הכללית של עכברים. בעלי חיים בדרך כלל לשמור על משקלם, תוך DSS המכיל מים מנוהל, ורק מתחילים משקל רופף כאשר הם חזרו למים שתייה רגילים. פרמטרים לירידה במשקל צריכים להיות מקובלים שהוקמו בהתאם לועדת האתיקה של בעלי החיים של המוסד. על מנת למנוע ההתייבשות קשורה בשלשולים ממושכים, השתמש בהוראה השגרתית של mash (כדורי מזון מרוסקים ומעורבבים עם מים שתייה) בתוספת שייק חלבון בנוסף למים שתייה רגילים.

כפי שניתן להשתמש בי הרדמה חלופית, קטמין / xylazine או סוכנים דומים, אם ציוד isoflurane אינו זמין. בשל אופייה הנוקשה של האנדוסקופ, נהלים אלה מאפשרים רק להדמיה של 3 סנטימטר דיסטלי ביותר של מעי גס עכבר. אנדוסקופים חדשים יותר עם יכולות נוספות (כולל גמישות וקרינה) זמינות בהתאם לצרכים של הניסוי. עם זאת, מאז ההשפעות המזיקות של DSS מוגבלים בעיקר למעי הגס הדיסטלי של עכברים, עם הפתולוגיה מתונה יותר נצפתה במעי גס האמצע, אנדוסקופ הקשיח לא לעכב ניטור של הבריאות הרירית של עכברים בודדים. למרות שאנו מתארים פרוטוקול לטיפול מניעתי לקוליטיס מושרה DSS החריף, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי לבדוק את אסטרטגיות טיפול התערבות. יעילותה של תרופה שנועדה להקל על הנזק וקוליטיס אפיתל ניתן לנטר longitudinally בעכברים בודדים ולכמת מבוססת על הפרמטרים שתוארו ניקוד (איור 5). זה יש יתרון על פני עיצובים ניסיוניים מסורתיים, הדורשים קולינג של עכברים בנקודות זמן מסוימים במהלך פרוטוקול הניסוי, ואינו מאפשר אפיון של תגובת המחלה לטיפול לאורך זמן.

t "> מחקרים קליניים בבני האדם הדגישו שונות רבות באופן שונה בגידולים במטופל מגיב לטיפולים. ההליכים המתוארים כאן לספק אמצעי לניטור נטל כולל גידול, כמו גם את התגובה לטיפול בגידולים בודדים במהלך של ניסוי. חשוב לקחת בחשבון כי פרוטוקולי ההתערבות שהתוו עבור דגמי הסרטן לא לוקחים בחשבון את ההשפעות של טיפול על התחלה של גידול. פרוטוקולי מניעתי, עם הטיפול הניתן לפני כאשר הגידולים להיות גלויים על ידי אנדוסקופיה, נדרשים כדי להשיג מידע זה. הפרוטוקולים המפורטים כאן מספקים מידע על השפעות טיפוליות על על ההתקדמות (שנמדד על ידי גודל גידול) של גידולים בודדים. רגרסיה הגידול גם יכולה להיות מצויינים על ידי ירידה במספרם של גידולים גלויים.

ז "/>
איור 1:. ניטור היעילות של טיפול טיפול מונע במודל של נזק במעי הגס חריף (א) פרוטוקול הניסוי מחייב 8 ימים מתחילתו ועד סיומו. Therapeutics מנוהל (ב) מיום 1 לטיפולים מניעתיים. DSS מסופק במי השתייה (ג) מיום 3 לפרוטוקול הניסוי. אנדוסקופיה מבוצעת (ד) כדי לפקח על התקדמות המחלה בבעלי החיים. נקודתי זמן הציע כוללות יום 0 (ללא טיפול) ויום 2 (ניטור בריאות), יום 5 ו -8 (כדי לקבוע נטל מחלה). הניסוי הופסק (ה) בבוקרו של יום 8. בעכבר wild-type (ו) את ההתקדמות של מחלה עולה עם זמן.

איור 2: ניטור את היעילות של טיפול התערבות בo מודלf קוליטיס הקשורים לסרטן. (א) פרוטוקול הניסוי מחייב 72 ימים מתחילתו ועד סיומו. Therapeutics (ב) מנוהל לעכברים עם גידולים שהוקמו מיום 46 לטיפולי התערבות. AOM (ג) מוזרק ביום 1, וDSS מסופק במי השתייה במהלך שלושה מחזורים של פרוטוקול הניסוי, המתחיל ביום 8. אנדוסקופיה (ד) מבוצעת כדי לפקח על התקדמות המחלה בבעלי החיים. נקודתי זמן הציע כוללות יום 0 (ללא טיפול), 20 (ניטור בריאות) היום, ויום 40 (לבעלי חיים קבוצה על פי נטל גידול). אנדוסקופיה מבוצעת שבועית במהלך הטיפול הרפואי כדי לפקח על תוצאות מחלה. הניסוי (ה) הסתיימה בבוקרו של יום 72. בניטל גידול עכבר wild-type (ו) מגבירה מיום 40 ואילך.

איור 3:. ניטור את היעילות של טיפול התערבות במודל של סרטן מעי גס ספונטני פרוטוקול הניסוי (א) דורש> 50 שבועות מתחילתו ועד סיומו. Therapeutics (ב) מנוהל לעכברים עם גידולים שהוקמו לטיפולי התערבות. AOM (ג) מוזרק ביום 1, ולאחר מכן שבועי למשך 6 זריקות רצופות במהלך פרוטוקול הניסוי. אנדוסקופיה (ד) מבוצע כדי לפקח על התקדמות המחלה בבעלי החיים. נקודתי זמן הציע כוללות יום 0 (ללא טיפול) ושבוע 8 (ניטור גידול) ודו-שבועי לשם אחרי (להקמת נטל גידול). אנדוסקופיה מבוצעת שבועית במהלך הטיפול כדי לפקח על תוצאות טיפוליות. הניסוי (ה) הסתיים בשבוע 50. בניטל גידול עכבר wild-type (ו) מגביר משבוע 40 ואילך. p>

איור 4:. הגדרת ציוד ניסיוני ההגדרה (א) ליחידה אנדוסקופית, עם יצירות בודדות של ציוד מצויינים. אנדוסקופ הקשיח (ב), עם רכיבים בודדים שצוין. בר = 2.5 סנטימטרים בהיקף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5:. פרמטרים מחלה ניקוד על ידי אנדוסקופיה מתאר (א) לMurine אנדוסקופי מדד קוליטיס החומרה (MEICS). מתווה (ב) לפרמטרי ניקוד גידול הבודדים.es / ftp_upload / 52,383 52383fig5highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: טיפולים טיפוליים נציג ירידה במשקל-נציג, תמונות אנדוסקופית וציונים ל:. (א) אקוטי DSS-Induced נזק לרירית (ב) גידולים שהתפתחו בעקבות AOM הפרוטוקול / DSS גידולים (ג) שהתפתחו בעקבות רציף.. פרוטוקול AOM. N = 3 עכברים בכל קבוצה. * P <0.05, *** P <0.001 (מבחן t). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שלושה פרוטוקולים המתוארים שיטות קווי המתאר של אינדוקציה אמינה ושחזור של פתולוגיה מחלה במעי הגס בעכברים. בשילוב עם ניטור אנדוסקופית שיגרתי ואסטרטגיות ההתערבות שתוארו כאן, הפרוטוקולים הללו יספק תובנה פרה-קלינית חזקה ליעילותם של טיפולים. המעבדות שלנו משתמשות באופן שיגרתי כל פרוטוקולים אלה כדי לפקח על ההצלחה של תרופות רומן ^10,23,24.

ישנם מספר שיקולים בעת בחירת מודל חיה פרה-קליני לבדיקת תרופות חדשות. אלה כוללים את הרלוונטיות של המודל למחלה האנושית, ואת תרומתם של מייקרו-הסביבה של הגידול לפעולה המוצעת של היעד הטיפולי. כאן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים להתערבות טיפולית במודלי מחלת מעיים הוקמו. מודלים אלה הם שחזור והאספקה ​​של חומרים כימיים כדי לגרום למחלה היא קלה לניהול. חשוב לציין, המודלים רלוונטיים מאוד להיבטים ושלבים של תחילת קוליטיס, וחניכת גידול ולהתפתחות מרובים. חוקרים צריכים לקחת בחשבון את הרקע הגנטי של זני העכבר משמשים בעת תכנון ניסויים, כמו הרגישות למחלות הנגרמת על ידי DSS ו / או AOM יכול להשתנות במידה ניכרת ^25. בנוסף, ייתכן שיש לי קהילות חיידקים שונות יכולות חילוף חומרים שונות בהקשר של AOM, אשר עובר מטבוליזם על ידי חיידקים. אנו מזהירים מפני שימוש בקבוצות שונות של עכברים שנולדו לתוך מתקנים שונים של בעלי חיים (כוללים ספקים מסחריים) בניסוי אחד. באופן דומה, מיקרופלורת השונות בעכברים המשמשים ממתקנים שונים עשויים לעורר תגובת מארח שונה לDSS-Induced נזק מחסום האפיתל ^11. יתר על כן, הניתוח המתאים של רקמה (לטיהור הדוגמא RNA) צריך להיות גם נחשב, שכן היכולת של DSS לעכב transcriptase ההפוך ישפיע על הניתוח מולקולרי הבא ^26,27.

ss = "jove_content"> אנדוסקופיה העכבר היא טכניקה חדשנית לניטור תחילת מחלה והתקדמות שוב ושוב בעכבר בודד. היכולת להקליט קטעי וידאו ולחלץ תמונות סטילס מאפשרת ניטור קל של פרמטרים מחלה מרובים וגידולים. בנוסף לשיפור רווחת בעלי חיים, ניטור אנדוסקופית גם מפחית את הצורך במחזורים רבים של עכברי ניסוי, אשר באופן מסורתי נלקחו בזמן נקודות שונות כדי לעקוב אחר תוצאות מחלה. שיטת הניקוד MEICS אינה מהווה תחליף לניתוח histopathological, אבל מספקת אמצעים חלופיים כדי לפקח על נזק בריאות בעלי החיים ורירי בעכברים חיים. אנדוסקופיה העכבר היא טכניקת מעבדה מיוחדת, וכל הנהלים צריכים להתבצע על ידי צוות מיומן כדי להבטיח מניפולציה וטיפול הולמות בעכברים, וכן כדי לספק איכות עקבית בתמונות המשמשות לניקוד מחלה. בידיו של אישית מוסמך, מצאנו כי אנדוסקופיה גורמת נזק מועט, אם בכלל tumors שיגרום לדימום תוך-tumoral. לפרוטוקולים הטיפוליים שתוארו, אנו רואים אנדוסקופיה יתרון מאוד, שכן הוא מספק דרך כדי לקבוע את נטל גידול הראשוני, ומאפשר לנו קבוצות קבוצה של בעלי חיים עם נטל גידול דומה לפני הממשל של תרופה טיפולית. ניטור רציף של העכברים מאפשר לחוקרים לקבוע את היעילות של טיפולים חדשניים בשלב מוקדם, עם האפשרות של הפסקת ניסויים מוצלחים במועד.

כהבנה של מחלת מעי דלקתית וסרטן מעי גס שלנו מראש, מטרות חדשות לטיפול תזוהה. מודלים של בעלי החיים מתאימים יהיו חלק בלתי נפרד מהבטחה שהטיפולים החדשים המבטיחים ביותר מועברים לניסויים קליניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000)	MP Biochemicals	160110	Requires batch testing.
Azoxymethane	Sigma	A5486-100MG	Requires batch testing.
Vanilla protein shake	N/A	N/A	Available from hospital pharmacies.
Isoflurane	PPC	M60303	This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% ethanol	N/A	N/A	Standard lab reagent.
Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam	Karl Storz	20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump	Karl Storz	20134001
HOPKINS straight Forward Telescope	Karl Storz	64301AA
Endoscopic sheath (total diameter 3 mm)	Kalr Stroz	61029C
Fiber optic light cable	Kalr Stroz	69495ND
Computer and media player software	Apple		iMovie
Scale	Any		Any scale suitable for weighing mice.