Method Article
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
大腸癌(CRC)は、世界中の悪性腫瘍1の4 番目の最も一般的な原因である。この疾患の家族の基礎の理解の重要な進歩にもかかわらず、遺伝的素因だけのCRCケース2の〜20%のに貢献しています。残りは、慢性炎症を含む多くの外因性および環境要因に起因する。ヒトでは、慢性炎症および結腸癌との間のリンクは、炎症性疾患3の期間に応じて、程度及び重症度、大腸炎関連大腸癌(CAC)を発症する危険性がより高い潰瘍性大腸炎(UC)患者において明らかである-5。したがって、新しい治療法は、免疫応答および炎症、腫瘍の微小環境6-8による成長促進因子の関連した生産を制御するために開発されている。の治療効力を特徴付けるための適切な前臨床動物モデルの増加要件は存在し疾患の発症および進行に対するこれらの薬剤。
マウスモデルは、明白に、炎症性微小環境でも明白な炎症9,10の非存在下で、CRCの進行に寄与することが実証されている。これらのモデルは、上皮損傷および急性および慢性炎症性腸疾患(IBD)11,12をモデル化するためのマウスの飲料水に設けられた多糖、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の使用を含む。 DSSは、粘膜障害および大腸炎を誘導するメカニズムは完全には理解されていないが、いくつかの研究では、DSSは、細胞内で細胞の逆転写酵素とRNA分解酵素活性を阻害する、または損傷上皮に至る結腸膜と融合ナノ - 脂質複合体の形成を促進することを示唆している13,14。標準のDSSモデルへの変更は、また結腸上皮細胞は組織の恒常性とのRegu性を維持するメカニズムに重要な洞察を提供してきました後半粘膜免疫応答15。
アゾキシメタン(AOM)の腹腔内投与は、単独で、またはDSSとの組み合わせで、上皮粘膜および炎症および間質微小環境16,17に体細胞変異の間の相互作用を調べるためのモデルを提供します。 AOMは、直接DNA変異を生じない発癌物質1,2-ジメチルヒドラジン(DMH)の代謝産物である。その代わりに、AOMはMAMがグルクロン酸と抱合した後、胆汁の分泌物18を介して腸に搬送され、肝臓、シトクロムアイソフォームCYP2E1によって(MAM)methylazoxymethanolに加水分解される。これは、細菌のβグルクロニダーゼは、DNAアルキル化および上皮細胞19における変異の蓄積をもたらすMAMの分解に寄与すると考えられている。ほとんどのAOM誘発性結腸腫瘍はプロテアソームdegradatiに耐性タンパク質をレンダリングする、をコードする遺伝子βカテニンにおけるミスセンス変異を抱くカノニカルWntシグナル伝達経路20の異常な活性化、その結果、上に。 AOMの活性はDSSによって誘発粘膜損傷と組み合わせると、その後の創傷治癒応答は、成長と変異誘発された上皮の拡大を助長している微小環境を作成します。このモデルのバリエーションでは、数週間の期間にわたって単独でAOMの反復投与は、DSS誘導性大腸炎10,17の非存在下で、散発性結腸直腸癌をモデル化するために使用することができる。これらの2つの相補のモデルは、炎症促進性の腫瘍微小環境10に関連付けられてどちらもそれぞれCAC及び散発性CRCを研究するための実験的な設定を提供する。
マウスにおけるシリアル視鏡の使用は、ベッカーと同僚21によって開拓され、大腸炎および腫瘍進行の長手方向の監視を可能にした。ここでは、DSS誘導性粘膜損傷および/またはAOM媒介TUに基づいて3前臨床プロトコルを提供MOR誘導が再現可能に特定の結腸の病理を誘導する。第一のプロトコルは、IBDに関連した病理組織学的機能の多くを引き出すDSSの投与に応答して、急性粘膜損傷を誘発説明しています。第二のプロトコルは、一般にIBDの患者で観察炎症のフレアを模倣するためにDSS投与の3つの連続したサイクルに基づいており、AOM誘発性の変異と組み合わせて実施することができる。最終的なプロトコルはAOM誘発性散発上皮の変異に基づいています。これらのプロトコルのそれぞれに対して、我々は、新薬の有効性をモニターするために開発した予防的および治療的介入の方法を含む、関連する標準的な手順を拡張。
医学研究動物倫理委員会のウォルターとエリザ·ホール研究所は、これらのプロトコルに記載された手順のそれぞれを承認した。
実験マウスの作製
上皮損傷と急性大腸炎モデル2.前臨床試験
慢性大腸炎や大腸炎関連癌モデル3.前臨床試験
散発性結腸直腸癌モデルにおける4.前臨床試験
6.病スコアリング
体重減少は、日常的に、マウスの全体的な健康状態を監視するために使用される大腸炎に関連する疾患をモニターするために、標準的なパラメータとして使用される。動物は、一般的には、DSS含有水が投与されている間、自分の体重を維持し、唯一のそれらは通常の飲料水に戻されたときに緩い重量に開始します。許容重量損失のパラメータは、金融機関の動物倫理委員会に合わせて確立されるべきである。長期の下痢に関連付けられた脱水を防ぐために、通常の飲料水に加えて、プロテインシェイクを補充したマッシュのルーチン提供を(食物ペレットがマッシュポテトや飲料水と混合)を使用する。
代替麻酔、ケタミン/キシラジンまたは類似の薬剤などのイソフルラン機器が利用できない場合に、使用することができる。による内視鏡の剛性の性質のために、これらの手順は、マウス結腸の最も遠位3cmの可視化を可能にする。との新しい内視鏡 (柔軟性と蛍光を含む)の追加機能は、実験の必要性に応じてご利用いただけます。 DSSの有害な影響は、主に中央結腸において観察され、より穏やかな病理を有するマウスの遠位結腸に限定されているので、硬性内視鏡は、個々のマウスの粘膜の健康のモニタリングを妨げない。我々は、急性DSS誘発大腸炎の予防的処置のためのプロトコルを説明しているが、このプロトコルは、容易に介入治療戦略をテストするために改変することができる。上皮損傷および大腸炎を軽減するために設計された薬剤の有効性は、個々のマウスにおいて、縦方向に監視され( 図5)に記載のスコアリングパラメータに基づいて定量することができる。これは、実験プロトコルの間、特定の時点でマウスの殺処分を必要とする伝統的な実験デザインよりも有利であり、経時治療に対する疾病の応答の特徴付けを可能にしない。
トン ">ヒトでの臨床試験では、個々の患者に治療に応答する方法の異なる腫瘍においてかなりの変動性を強調している。ここで説明する手順は、全体的な腫瘍量、ならびににわたって個々の腫瘍の治療応答をモニターする手段を提供する実験の。それは、癌モデルについて概説されている介入プロトコルは考慮に腫瘍の開始に対する治療の影響を取ることはありませんことを考慮することが重要である。予防的なプロトコル、事前の腫瘍は内視鏡検査によって可視になったときに提供される治療で、この情報を得るために必要とされる。ここで説明するプロトコルは、進行に対する治療効果についての情報を提供する個々の腫瘍(腫瘍サイズで測定)。腫瘍退縮も見える腫瘍の数の減少によって示され得る。グラム "/>
図1:急性大腸損傷のモデルでは予防的治療療法の有効性を監視(a)の実験プロトコルは、開始から完了まで8日間が必要です。治療薬は、予防的治療のために1日目から(b)に投与される。 DSSは、実験プロトコルの3日目から飲料水を(c)に設けられている。内視鏡検査は、動物における疾患の進行をモニターするために(d)を実施する。推奨の時点では、5日目と8(疾病負担を決定するために)0日目(未処理)と2日目(ヘルスモニタリング)などがあります。実験は、野生型マウスでは8日目の朝(f)の経時的な疾患の増加の進行(e)を終了する。
図2:モデルOに介入療法の有効性を監視するF大腸炎関連癌は。実験プロトコル(A)は、スタートから完成まで72日を要する。 (b)は、治療薬は、介入治療のために46日目から確立された腫瘍を有するマウスに投与される。 AOM(c)は 1日目に注入され、DSSは、内視鏡検査(d)は 、動物における疾患の進行を監視するために実行される8日目に開始し、実験プロトコルの3つのサイクルにわたって飲料水に設けられている。推奨の時点では(腫瘍量に応じた群の動物に)0日目(未処理)、20日(ヘルスモニタリング)、および40日目を含む。内視鏡検査は、疾患の転帰を監視するために治療的処置の過程にわたって毎週実施される。実験(e)は、以降40日目から増加し、野生型マウス(f)は 、腫瘍負荷において72日目の朝に終了される。
図3:自発的な大腸癌のモデルに介入療法の有効性をモニタリングする実験プロトコルは(a)の開始から完了まで> 50週間が必要です。 (b)は、治療薬は、介入の治療のための確立された腫瘍を有するマウスに投与される。 AOM(c)は、実験プロトコルの経過にわたって毎週、その後6つの連続した注射のための1日目に注入している。内視鏡検査(d)は、動物における疾患の進行をモニターするために行われる。推奨の時点では、隔週そこ(腫瘍量を確立するために)の後に0日目(未処理)および8週目(腫瘍監視)とが含まれる。内視鏡検査は、治療の結果をモニターするため、治療の過程にわたって毎週実施される。実験(e)は、以降の週40から増加する野生型マウス(f)は 、腫瘍負荷において50週で終了した。 P>
図4:機器のセットアップ装置の個々の部分と、内視鏡装置用の実験装置は、(a)は 、示された。個々のコンポーネントとの硬性内視鏡(b)は 、示された。スケールバー= 2.5 cmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5:内視鏡検査によるスコアリング病パラメータ大腸炎重症度のマウス内視鏡指数(MEICS)の概要(a)に。。個々の腫瘍のスコアリングパラメータの概要(b)にES / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6:代表治療的処置のための代表的な減量、内視鏡画像とスコア:。。。シーケンシャル以下の開発(A)急性DSS誘発粘膜損傷AOM / DSSプロトコルに従って開発された(b)の腫瘍(C)腫瘍AOMプロトコル。群当たりN = 3匹のマウス。 * P <0.05、*** P <0.001(スチューデントのt検定)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスでの大腸疾患病理の信頼性と再現性誘導の概略の方法を説明している3つのプロトコル。ルーチン内視鏡監視とここで概説介入戦略と組み合わせることで、これらのプロトコルは、治療薬の有効性への強力な前臨床洞察を提供します。私たちの研究室は、定期的に新規治療薬10,23,24の成功を監視するために、これらのプロトコルのすべてを使用する。
新しい治療法を試験するための前臨床動物モデルを選択する考慮事項が数多くあります。これらは、ヒト疾患のモデルの妥当性、および治療標的の提案アクションに腫瘍微小環境の寄与を含む。ここでは、確立された腸疾患モデルにおける治療的介入のための3つのプロトコルを提供する。これらのモデルは、再現可能であり、疾患を誘発する試薬の配信は、管理が容易である。重要なことは、モデルは非常に関連しています複数のファセットと大腸炎の発症、および腫瘍の開始と進行のステージに。 DSSおよび/ またはAOMにより誘発される疾患に対する感受性はかなり25を変化させることができるように研究者は、考慮した実験を設計する際に使用されるマウス系統の遺伝的背景を取る必要があります。さらに、異なる微生物群集は細菌によって代謝されるAOMの文脈において異なる代謝能力を有することができる。私たちは、単一の実験で(商用ベンダーを含む)を別の動物施設に生まれたマウスの異なるコホートを使用しないことを警告する。同様に、異なる施設から使用したマウスの異なる微生物叢は、上皮バリアの損傷11誘発性をDSSに、異なる宿主応答を誘発し得る。逆転写酵素を阻害するDSSの能力は、その後の分子解析26,27に影響するので、(例えば、RNA精製の ための)組織の適切な分析もまた、考慮されるべきである。
マウスの内視鏡検査を繰り返し、個々のマウスにおける疾患の発症および進行を監視するための最先端の技術である。ビデオを録画や静止画を抽出する能力は、複数の疾患パラメータおよび腫瘍の監視を簡単に行うことが可能。動物福祉を改善することに加えて、内視鏡監視はまた、伝統的に疾患の転帰を追跡するために異なる時点で殺処分された実験用マウスの複数のコホートの必要性を低減する。 MEICSスコアリングシステムは、病理組織学的分析に代わるものではありませんが、代替が生きたマウスでの動物の健康および粘膜損傷を監視する手段を提供する。マウスの内視鏡検査は、専門の研究室の技術であり、すべての手順は、マウスの適切な操作と取り扱いを確保するため、ならびに疾患のスコアリングに使用される画像で一貫した品質を提供するために訓練を受けた担当者が行ってください。資格のある個人の手では、内視鏡検査はtumoにほとんど、あるいは全く損傷を誘導することを見出した腫瘍内出血を引き起こすRS。それは初期の腫瘍負荷を決定する手段を提供し、治療薬の投与前に類似した腫瘍の負担と動物群のコホートに私たちを可能にするので概要を治療プロトコルのために、我々は、内視鏡検査は非常に有利考える。マウスの連続監視がタイムリーに失敗した実験を終了させるオプションを指定して、早い段階で新しい治療法の有効性を決定するために、研究者を可能にします。
炎症性腸疾患および結腸直腸癌の進行についての理解として、治療のための新たな標的が同定される。適切な動物モデルは、最も有望な新しい治療法が臨床試験に向けて移動されることを確実に不可欠であろう。
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | Apple | iMovie | |
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
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